酵母中RNA的提取與含量測定

1、 酵母中RNA的提取與含量測定 14級拔尖 趙子杰 1 實驗目的 1.掌握稀堿法提取酵母RNA的原理和方法。 2.掌握用苔黑酚法測定RNA含量的原理和方法。2 實驗原理 1.RNA的提取核酸（RNA）都是由核苷酸組成的多聚核苷酸化合物，而核苷酸是由糖、堿基和磷酸以等分子比例構成的，故測定組成核苷酸的任意一種組分即可以測定生物體內(nèi)核酸的含量或者是提取出來的核酸的含量。提取RNA的方法很多，在工業(yè)生產(chǎn)上常用的是稀堿法和濃鹽法。前者是利用堿使細菌細胞壁溶解，是RNA釋放出來，后者是在加熱的條件下，利用高濃度的鹽改變細胞膜的通透性，使RNA釋放出來。使用濃鹽法提取RNA的時候應該注意掌握溫度，直接至9

2、0100浸提，避免在2070的時間過長，因為這是磷酸二酯酶和磷酸單酯酶的作用活躍的溫度范圍，會使RNA降解而降低提取率。這兩種方法是從廢棄的啤酒酵母中提取RNA的一般方法。但是這兩種方法各有利弊，如濃鹽法提取的RNA純度高，而稀堿法提取的時間短，提取率高，更利于工業(yè)化生產(chǎn)。本實驗采取濃鹽法。酵母核酸中RNA的含量較多，DNA則少于2%。RNA可溶于堿性溶液，當堿液被中和后，可加乙醇使其沉淀，由此即可得到粗RNA粗品。 2.RNA的鑒定 目前測定核酸含量的方法主要有以下四種：定磷法（RNA/DNA）、戊糖測定法(RNA)、脫氧戊糖測定法（DNA）和紫外吸收法（DNA/RNA）。定磷比色法是有準確

3、，微量，快速的特點，是測定核酸含量的最好方法，戊糖測定法和脫氧戊糖測定法是通過糖的顏色反應來測定RNA和DNA的，方法簡單，快速，但是當樣品中含有粘多糖和蛋白質(zhì)存在的時候?qū)y定會有干擾。在酸性條件下，RNA分子中的核算基轉變?yōu)?呋喃甲醛，后者與苔黑酚（3,5-二羥甲苯）作用生成綠色復合物，可用比色法鑒定。3 實驗器材 RNA的提?。?RNA的含量測定： 1.干酵母粉（市售）。 1.試管1.5cmX1.5cm(X7)。 2.PH試紙。 2.吸管5ml。 3.離心機4000r/min。 3.水浴鍋。 4.抽濾裝置。 4.722型（或720型）分光光度計。 5.電子天平。 5.移液槍。 6.量筒。

4、7.吸管(5ml)。4 實驗試劑 1.0.2%NaOH溶液。 2.乙酸A.R.。 3.95%乙醇。 4.無水乙醚A.R.。 5.標準RNA溶液：準確稱取RNA標準品10mg，用少量蒸餾水溶解，定容至100ml。 6.樣品溶液：同樣取10mg左右的樣品，定容于100ml，搖勻。 7.苔黑酚-三氯化鐵試劑。五實驗步驟 1.RNA的提取 稱取8g酵母粉于100ml燒杯中，加入0.2%NaOH溶液40ml，沸水浴加熱30min，經(jīng)常攪拌。 冷卻，加入乙酸數(shù)滴，使提取液呈酸性（PH56）。離心10min,4000r/min。取上清液，加入兩倍體積的95%的乙醇，邊加邊攪。 加畢，靜置，待完全沉淀，過濾。

5、濾渣先用95%的乙醇洗兩次，每次約10ml，繼而用無水乙醚洗兩次，每次10ml。洗滌時可用玻棒小心攪動沉淀。乙醚濾干后，濾渣即為粗RNA，可用作接下來的測定含量用。 2.RNA的含量測定 1）標準曲線的繪制取干凈試管6支，編號。按下表進行操作。 管號試劑0123456RNA標準溶液/ml0.00.40.81.21.62.0樣品溶液（0.5mg/ml)2.0蒸餾水2.01.61.20.80.40.00.0苔黑酚試劑2.02.02.02.02.02.02.0RNA含量/mg0.00000.04120.08240.12360.16480.2060水浴45minA670nm/A0.0000.0780.

6、1830.2680.3560.4560.212 2）樣液測定 加畢，混勻，加熱45min。冷卻，測定各管670nm的吸光度，對照標準曲線求得未知RNA的含量。六實驗現(xiàn)象與結論 1.RNA的提取實驗現(xiàn)象：加入NaOH進行攪拌后呈棕黃色粘稠物。離心后明顯分層，沉淀為棕黃色，上層溶液呈黃色粘稠狀，似蛋清。向上清液加入乙醇后呈淡黃色渾濁，靜置后沉淀為白色，上清液為黃色。過濾洗滌后呈白色粉末狀沉淀。稱取酵母粉：8.01gRNA粗品：0.4234g 2.RNA的含量測定實驗現(xiàn)象：加熱后從0號至5號溶液由黃色至黃綠色依次加深，6號溶液顏色為淡黃綠色。稱量RNA樣品：0.0101g稱量標準RNA：0.0103

7、g按要求繪制標準曲線如下： 根據(jù)標準線線性回歸的結果為y=2.2184x-0.005，其中R2=0.9989，接近于1，表明線性回歸效果很好。 根據(jù)結果測得y=0.212，代入原方程得：x=0.0980mg，即該試管中RNA的含量為0.0980mg。 可知其純度為： 7 實驗總結1. 過濾時,洗滌不能帶水,否則沉淀粘在濾紙上取不下來。2.有時絮狀沉淀出現(xiàn)較慢,可放十多分鐘。3.利用等電點控制RNA析出時，應嚴格控pH。4.稀堿法提取的RNA為變性RNA，可用于RNA組分鑒定及單核苷酸制備，不能作為RNA生物活性實驗材料。5.有很多操作細節(jié)需要相當嚴謹?shù)耐瓿桑热缢r間，離心時間，沉淀取上清液

8、等，只有小心翼翼充分細心的做好這些細節(jié)工作，產(chǎn)率會有一定的提高八思考題 1.本實驗為何選用酵母為生產(chǎn)原料？在分離純化的實驗選材上有哪些主要原則？ 答：因為酵母細胞中核酸的含量非常高，且主要是RNA，其含量可達2.67%10.0%。而DNA的含量較少，在測定RNA的含量時DNA對測定的影響非常小，故選取酵母為生產(chǎn)原料。在分離純化的實驗選材上應該注意以下幾點：待分離物質(zhì)再材料中的含量要高；提取方法要簡便；雜質(zhì)要少，保證提取后提取物的純度。如果是用于規(guī)?；a(chǎn)的話，必不可少的一個就是要考慮材料的價格。 2.大量的乙醇洗滌在工業(yè)生產(chǎn)上有否危險隱患？廠家是如何考慮的。 答：廢舊的乙醇可以凈化以后回收再利用。乙醇是易揮發(fā)物質(zhì)和燃品，有很大的安全隱患。乙醇洗滌有很多的好處，可以脫去色素，脂溶性雜質(zhì)，還可以使RNA分子脫水，易于烘干。由于RNA分子在乙醇溶液中水化層被破壞，磷酸基團暴露出來，并與Na結合，最終使RNA沉淀，增加產(chǎn)率。因此乙醇洗滌時必須的。 2.RNA提取過程中的關鍵步驟及注意事項有哪些？ 答：過濾時，洗滌不能帶水，否則沉淀粘在濾紙上取不下來；有時絮狀沉淀出現(xiàn)較慢，可放十多分鐘；利用等電點控制RNA析出時，應嚴格控制p