植物基因組DNA的提取及其定性、定量分析

1、分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)報(bào)告 實(shí)驗(yàn)一 植物基因組DNA的提取及其定性、定量分析【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?通過本實(shí)驗(yàn)學(xué)習(xí)利用CTAB法從植物組織中提取DNA并通過瓊脂糖凝膠電泳及紫外分光光度法對DNA進(jìn)行定性定量分析?！緦?shí)驗(yàn)原理】 CTAB(十六烷基三甲基溴化銨)是一種陽離子型去污劑，可溶解細(xì)胞膜，在高離子強(qiáng)度下(大于0.7 M NaCl)，與蛋白和中性多糖形成復(fù)合物沉淀出來。利用液氮對植物組織進(jìn)行研磨，從而破碎細(xì)胞。然后加入CTAB緩沖液將DNA溶解出來，再用酚、氯仿抽提的方法去除蛋白，最后經(jīng)乙醇沉淀得到DNA。瓊脂糖凝膠電泳是分離和純化DNA片段的常用技術(shù)。把DNA樣品加入到一塊包含電解質(zhì)的多孔支持介質(zhì)(瓊脂糖凝

2、膠)的樣品孔中，并置于靜電場上。DNA分子在高于等電點(diǎn)的pH溶液中帶負(fù)電荷，在電場中向正極移動(dòng)。DNA分子在瓊脂糖凝膠中泳動(dòng)時(shí)有電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)。由于糖-磷酸骨架在結(jié)構(gòu)上的重復(fù)性質(zhì)，相同數(shù)量的雙鏈DNA幾乎具有等量的凈電荷，因此，在一定的電場強(qiáng)度下，DNA分子的遷移速度取決于分子篩效應(yīng)，即DNA分子本身的大小和構(gòu)型。DNA分子的遷移速度與相對分子質(zhì)量的對數(shù)值成反比關(guān)系，分子量小的DNA分子比分子量大的DNA分子遷移速率快，遷移距離遠(yuǎn)，由此得到分離。凝膠電泳也可以分離相對分子質(zhì)量相同，但構(gòu)型不同的DNA分子，超螺旋質(zhì)粒DNA(cccDNA)泳動(dòng)最快，其次為線狀DNA(L DNA)，最慢的為開

3、環(huán)質(zhì)粒DNA(ocDNA)。核酸分子(DNA或RNA)由于含有嘌呤環(huán)和嘧啶環(huán)的共軛雙鍵，在260 nm波長處有特異的紫外吸收峰，其吸收強(qiáng)度與核酸的濃度成正比，這個(gè)物理特性為測定核酸溶液濃度提供了基礎(chǔ)。1 OD260相當(dāng)于dsDNA 50 g/mL，ssDNA 33 g/mL和ssRNA 40 g/mL。可以此來計(jì)算核酸樣品的濃度。紫外分光光度法不但能確定核酸的濃度，還可通過測定260 nm和280 nm的紫外線吸收值的比值(A260/A280)估計(jì)核酸的純度，若DNA的A260/A280比值高于2.0，則可能有RNA污染，低于1.8則有蛋白質(zhì)污染?！緝x器、材料與試劑】 一、儀器及耗材離心機(jī)、恒

4、溫水浴器、臺(tái)式離心機(jī)、電子天平、水平電泳槽、電泳儀、凝膠成像分析系統(tǒng)、高壓滅菌鍋、紫外線透射儀、微波爐、紫外分光光度儀、微量移液器(10、100、1000 L量程各一支)、100 mL或250 mL錐形瓶、量筒、液氮、研磨棒、點(diǎn)樣板或parafilm、吸頭、1.5 mL EP管、PE手套和乳膠手套。二、藥品三羥甲基氨基甲烷(Tris)、CTAB(十六烷基三甲基溴化銨)、-巰基乙醇、氯仿、苯酚、乙醇、氯化鈉(NaCl)、鹽酸、液氮、硼酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、溴酚藍(lán)、蔗糖、瓊脂糖、核酸染料。三、試劑1. 2CTAB buffer【1】2. 70%乙醇【2】3. RNaseA (天根)【3】4

5、. 0.5TBE緩沖液(工作濃度) 【4】5. 6loading buffer【5】6. 核酸染料(賽百盛)7. DNA marker DL 2000(Takara)8. 酚/氯仿 (1:1, V/V) 【6】【實(shí)驗(yàn)步驟】 1. 取約100 mg新鮮的擬南芥嫩葉放入1.5 mL EP管，在液氮冷凍條件下研磨成粉末狀。2. 加入0.6 mL 2CTAB提取液（用前加入0.2的巰基乙醇），混勻，65 水浴30 min，每10 min顛倒混勻一次。3. 取出離心管，冷卻后加入0.6 mL酚氯仿混合液，混勻。4. 11,500 rpm室溫離心8 min(若沒離好可重復(fù)一次)。5. 將上清液(約400

6、L)轉(zhuǎn)移到另一新的1.5 mL離心管中。6. 加入與上清等體積的氯仿，混勻，11,500 rpm 離心8 min，取上清(約350 L)。7. 加入600 L無水乙醇，上下顛倒混勻，-80放置30 min。8. 4，15,800 rpm離心20 min，棄上清。9. 1 mL 70乙醇(預(yù)冷)洗滌沉淀2次，上下顛倒幾次，不能vortex，7,000 g離心3 min，棄上清，風(fēng)干。10. 加入30 L無菌水(含20 g/mL RNase A)，37 溶解DNA 30 min。11. 取5 L DNA樣品進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測：(1) 制備瓊脂糖凝膠稱取0.3 g 瓊脂糖，放入三角瓶中，加入30

7、 mL 0.5 TBE緩沖液，置微波爐中加熱至完全熔化，取出搖勻，則為1瓊脂糖凝膠液。(2) 膠板的制備 取有機(jī)玻璃內(nèi)槽，洗凈，晾干，用橡皮膏或膠帶將有機(jī)玻璃內(nèi)槽的兩端邊緣封好（一定封嚴(yán)，不能留縫隙），形成一個(gè)模具。 將有機(jī)玻璃內(nèi)槽放置于一水平位置，并在固定位置放好樣品梳子。 待瓊脂糖凝膠液冷卻到60 左右時(shí)，加入核酸染料1.5 L，搖勻，緩緩倒入有機(jī)玻璃內(nèi)槽，直至有機(jī)玻璃板上形成一層均勻的膠面（注意不要形成氣泡）。 室溫下靜置直至凝膠完全凝固（室溫下30-45 min），垂直輕拔梳子，取下膠帶，將凝膠及內(nèi)槽放入電泳槽中。 加入0.5 TBE電泳緩沖液至電泳槽中，使緩沖液沒過膠面約1 mm。(

8、3) 加樣在點(diǎn)樣板或parafilm上混合DNA樣品和上樣緩沖液，上樣緩沖液的最終稀釋倍數(shù)應(yīng)不小于1。用10 L微量移液器分別將樣品加入膠板的樣品小槽內(nèi)，將DNA marker分別加至樣品孔的左側(cè)和右側(cè)孔內(nèi)。每加完一個(gè)樣品，應(yīng)更換一個(gè)加樣頭，以防污染，加樣時(shí)勿碰壞樣品孔周圍的凝膠面（注意：加樣前要先記下加樣的順序）。 (4) 電泳 接通電泳槽與電泳儀的電源，DNA片段從負(fù)極（黑色插頭）向正極（紅色插頭）移動(dòng)）。DNA的遷移速度與電壓成正比，但電壓升高使瓊脂糖凝膠的有效分離范圍降低，因此，最高電壓不超過5V/cm。 當(dāng)溴酚藍(lán)染料移動(dòng)到距凝膠前沿1-2cm處，停止電泳。 紫外燈下觀察瓊脂糖凝膠中的

9、帶（戴手套操作），采用凝膠成像系統(tǒng)拍照保存。12.紫外分光光度法測定DNA濃度及純度：(1) 用0.1TE對待測DNA樣品按1:20或合適的倍數(shù)稀釋。(2) 開機(jī)，儀器會(huì)自動(dòng)對光路及分析軟件進(jìn)行檢測，待顯示屏上出現(xiàn)“instrument Ready”時(shí)，進(jìn)入核酸測定窗口。(3) 調(diào)零。先用0.1TE緩沖液注入樣品杯，放入樣品槽，關(guān)閉蓋板。點(diǎn)擊“set ref”鍵，儀器自動(dòng)校正零點(diǎn)。將樣品槽內(nèi)的樣品杯取出，換上待測樣品。(4) 吸70 L已稀釋的DNA樣品轉(zhuǎn)入石英樣品杯，放入樣品槽，關(guān)閉蓋板。如果樣品很少，可以用5-7 L的石英樣品杯。點(diǎn)擊“enter” 鍵，儀器即進(jìn)入分析狀態(tài)。窗口同時(shí)顯示26

10、0 nm和280 nm處的光密度（OD值）及A260/A280 nm和A280/A260 nm的比率以及DNA樣品的濃度等。(5) 打開蓋板，取出石英樣品杯，吸出樣液，用超純水清潔石英樣品杯，風(fēng)干后，再加入下一個(gè)待測樣品。(6) DNA純度：以A260/ A280比值來反映。當(dāng)A260 /A280比值2.0，說明樣品存在RNA污染，可以用RNA酶處理樣品去除RNA。實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析1. 1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測擬南芥基因組DNAC組電泳結(jié)果如圖所示1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測所提取的DNA 5l樣品，電泳結(jié)果如圖所示有DNA條帶出現(xiàn)，表明已經(jīng)成功提取到了擬南芥的基因組DNA。2.DNA樣品的OD檢測

11、檢測OD值C1：濃度:1061.7 ng/OD260/OD280：1.87表明：C1接種DNA質(zhì)量良好。（如下圖所示）C2：濃度:1017.6ng/ OD260/OD280：1.86表明:C2接種DNA質(zhì)量良好。（如下圖所示）C3：濃度:711.0ng/ OD260/OD280：1.86表明:C3接種DNA質(zhì)量良好。（如下圖所示）注意事項(xiàng)：1、磨樣時(shí)要反復(fù)插入液氮中冷凍，但要避免液氮進(jìn)入管中；2、取酚氯仿混合液時(shí)要吸取下層；3、加入酚氯仿和氯仿時(shí)要充分混勻；4、氯仿抽提后取上清時(shí)不要吸到蛋白層；5、晾干沉淀時(shí)，要盡可能的吸除酒精。實(shí)驗(yàn)二 PCR擴(kuò)增目的片段【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹客ㄟ^本實(shí)驗(yàn)學(xué)習(xí)PCR反應(yīng)的

12、基本原理與實(shí)驗(yàn)技術(shù)。【實(shí)驗(yàn)原理】聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR）是一種體外核酸擴(kuò)增系統(tǒng)，其原理類似DNA分子的天然復(fù)制過程，是將待擴(kuò)增的DNA片段與其兩側(cè)互補(bǔ)的兩個(gè)寡聚核苷酸引物，經(jīng)變性、退火和延伸若干個(gè)循環(huán)后，DNA擴(kuò)增2n倍。典型的PCR 反應(yīng)體系由如下組分組成：DNA 模板、反應(yīng)緩沖液、dNTP、兩個(gè)合成的DNA引物、耐熱DNA聚合酶。PCR的工作程序?qū)嶋H上是一個(gè)在模板DNA、一對已知序列的寡核苷酸引物和四種脫氧核苷酸等存在的情況下，DNA聚合酶依賴的酶促合成反應(yīng)。整個(gè)擴(kuò)增過程分三步： 變性，加熱使模板DNA雙鏈間的氫鍵斷裂而形成兩條單鏈，即變

13、性階段； 退火，快速降低溫度至50-60 后，模板DNA與引物按堿基配對原則互補(bǔ)結(jié)合，即退火階段； 延伸，溶液反應(yīng)溫度升至72，耐熱DNA聚合酶以單鏈DNA為模板，在引物的引導(dǎo)下，利用反應(yīng)混合物中的4 種脫氧核苷三磷酸（dNTP)，按53方向復(fù)制出互補(bǔ)DNA ，即引物的延伸階段。完成以上三步為一個(gè)循環(huán)，每經(jīng)過一個(gè)循環(huán)，樣本中的DNA量就增加一倍，新形成的DNA鏈又成為下一輪循環(huán)的模板。經(jīng)過25-30個(gè)循環(huán)后，DNA可擴(kuò)增106-109倍。PCR擴(kuò)增的特異性取決于引物與模板DNA的結(jié)合。【儀器、材料與試劑】 一、儀器及耗材PCR熱循環(huán)儀、臺(tái)式離心機(jī)、電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)、移液器（0.1-2.5

14、L）、200 L PCR管、吸頭、離心管、手套、制冰機(jī)、微量移液器（10、100、1000 L量程各一支）、100 mL或250 mL錐形瓶、量筒、點(diǎn)樣板或parafilm、吸頭、PE手套和乳膠手套。二、試劑1. 10 緩沖液2. DNA 模板 1 ng/L（以實(shí)驗(yàn)一 提取的擬南芥基因組DNA為模板）3. dNTP Mix (Takara)4引物 P3： 5-CGG GTA CCG GTG AAT TAA GAG GAG AGA GGA GG-3P5： 5-ACT CTA GAT GAG TAA AAC AGA GGA GGG TCT CAC-3引物溶液濃度：2 M 5. rTaq 酶 5 U

15、/L6. 低熔點(diǎn)瓊脂糖7. 去離子水或TE（pH7.6）【7】【實(shí)驗(yàn)步驟】 1在200 L PCR 管內(nèi)配制20 L 反應(yīng)體系：反應(yīng)物 體積/LddH2O 11.3 10PCR 緩沖液 2.0dNTP 1.6（終濃度20200 M） 引物1 2.0（引物終濃度0.2 M）引物2 2.0（引物終濃度0.2 M）模板DNA 1.0rTag 酶 0.1 Total 20 視PCR儀有無熱蓋，不加或添加石蠟油。2. 將上述試劑依次加入PCR薄壁管。加樣后用手輕彈混勻，6,000 rpm離心15 sec使反應(yīng)成分集于管底。3. PCR反應(yīng)熱循環(huán)程序設(shè)置： 94 預(yù)變性 3 min; 94 變性 30 sec; 64 退火 30 sec; 30 cycles 72 延伸 1 min; 72 延伸 10min; 16 pause反應(yīng)結(jié)束后短暫離心，置4 保存?zhèn)溆谩?. 配制1的瓊脂糖凝膠。5. 取5 L P