第10章發(fā)光免疫技術(shù)

1、第十章化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)第十章化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)第一節(jié) 慨述 一、化學(xué)發(fā)光二、化學(xué)發(fā)光效率第二節(jié) 化學(xué)發(fā)光劑和標(biāo)記技術(shù)一、化學(xué)發(fā)光劑二、發(fā)光劑的標(biāo)記技術(shù)思考題小結(jié)第三節(jié) 化學(xué)發(fā)光免疫分析的類型一、直接化學(xué)發(fā)光免疫分析二、化學(xué)發(fā)光酶免疫分析 三、電化學(xué)發(fā)光免疫分析 四、臨床應(yīng)用發(fā)光免疫分析:是將發(fā)光分析和免疫反應(yīng)相結(jié)合而建立起來的一種新的檢測微量抗原或抗體的新型標(biāo)記免疫分析技術(shù)。第一節(jié)概 述三大經(jīng)典標(biāo)記技術(shù)放射免疫技術(shù)酶免疫技術(shù)發(fā)光免疫技術(shù)發(fā)光:是指分子或原子中的電子吸收能量后，由基態(tài)（較低能級）躍遷到激發(fā)態(tài)（較高能級），然后再返回到基態(tài)，并釋放光子的過程。根據(jù)形成激發(fā)態(tài)分子的能量來源不同可

2、分為:光照發(fā)光、生物發(fā)光、化學(xué)發(fā)光等。生物發(fā)光（bioluminescence）是指發(fā)生在生物體內(nèi)的發(fā)光現(xiàn)象，如螢火蟲的發(fā)光，反應(yīng)底物為螢火蟲熒光素，在熒光素酶的催化下，利用ATP 能，生成激發(fā)態(tài)氧化型熒光素，它在回復(fù)基態(tài)時多余的能量以光子的形式釋放出來。光照發(fā)光（photoluminescence）是指發(fā)光劑（熒光素）經(jīng)短波長的入射光照射后，電子吸收能量躍遷到激發(fā)態(tài)，在其回復(fù)至基態(tài)時， 發(fā)射出較長波長的可見光（熒光）。一、化學(xué)發(fā)光，化學(xué)發(fā)光（chemiluminescence）是指伴隨化學(xué)反 應(yīng)過程所產(chǎn)生的光的發(fā)射現(xiàn)象。某些物質(zhì)(發(fā)光劑) 在化學(xué)反應(yīng)時，吸收了反應(yīng)過程中所產(chǎn)生的化學(xué)能 使反應(yīng)

3、的產(chǎn)物分子或反應(yīng)的中間態(tài)分子中的電子躍 遷到激發(fā)態(tài)，當(dāng)電子從激發(fā)態(tài)回復(fù)到基態(tài)時，以發(fā) 射光子的形式釋放出能量，這一現(xiàn)象稱為化學(xué)發(fā)光。一些化學(xué)反應(yīng)能釋放足夠 的能量把參加反應(yīng)的物質(zhì)激發(fā)到能發(fā)射光的電子激發(fā)態(tài)， 若被激發(fā)的是一個反應(yīng)產(chǎn)物分子，則這種反應(yīng)過程叫直接化學(xué)發(fā)光。反應(yīng)過程可簡單地描述如下：A十BC*C*C h其中為光子，C*表示C處于單線激發(fā)態(tài)。若激發(fā)能傳遞到另一個未參加化學(xué)反應(yīng)的分子D上，使D分子激發(fā)到電子激發(fā)態(tài)，D分子從激發(fā)態(tài)回到基態(tài)時發(fā)光，這種過程叫間接化學(xué)發(fā)光。反應(yīng)過程可表示如下：A十B C*十D D*C*C十D*D十h二、化學(xué)發(fā)光效率化學(xué)發(fā)光效率決定于生成激發(fā)態(tài)產(chǎn)物分子的化學(xué)激發(fā)

4、效率（CE）和激發(fā)態(tài)分子的發(fā)射效率（EM）?；瘜W(xué)發(fā)光反應(yīng)的發(fā)光效率、光輻射的能量大小以及光譜范圍，完全由發(fā)光物質(zhì)的性質(zhì)所決定，每一個發(fā)光反應(yīng)都具有其特征性的化學(xué)發(fā)光光譜和不同的化學(xué)發(fā)光效率。第二節(jié)化學(xué)發(fā)光劑和標(biāo)記技術(shù)一、化學(xué)發(fā)光劑在化學(xué)發(fā)光反應(yīng)中參與能量轉(zhuǎn)移并最終以發(fā)射光子的形式釋放能量的化合物，稱為化學(xué)發(fā)光劑或發(fā)光底物。能作為化學(xué)發(fā)光劑的條件：發(fā)光的量子產(chǎn)率高；它的物理-化學(xué)特性要與被標(biāo)記或測定的物質(zhì)相匹配；能與抗原或抗體形成穩(wěn)定的偶聯(lián)結(jié)合物；其化學(xué)發(fā)光常是氧化反應(yīng)的結(jié)果；在所使用的濃度范圍內(nèi)對生物體沒性。直接化學(xué)發(fā)光劑直接化學(xué)發(fā)光劑在發(fā)光免疫分析過程中不需酶的催化作用，直接參與發(fā)光反應(yīng)，它

5、們在化學(xué)結(jié)構(gòu)上有產(chǎn)生發(fā)光的特有基團，可直接標(biāo)記抗原或抗體。1. 吖啶酯在堿性條件下被H2O2氧化時,發(fā)出波長為470nm的光，具有很高的發(fā)光效率，其激發(fā)態(tài)產(chǎn)物N-甲基吖啶酮是該發(fā)光反應(yīng)體系的發(fā)光體。三聯(lián)吡啶釕2三聯(lián)吡啶釕 三聯(lián)吡啶釕 RU(bpy)32+是電化學(xué)發(fā)光劑，它和電子供體三丙胺（TPA） 在陽電極表面可同時失去一個電子而發(fā)生氧化反應(yīng)。電化學(xué)發(fā)光劑反應(yīng)原理1. 魯米諾及其衍生物2. AMPPD 酶促反應(yīng)發(fā)光劑：是利用標(biāo)記酶的催化作用，使發(fā)光劑（底物）發(fā)光，這一類需酶催化后發(fā)光的發(fā)光劑稱為酶促反應(yīng)發(fā)光劑。1魯米諾魯米諾發(fā)光原理魯米諾增強發(fā)光反應(yīng)原理2AMPPD3-(2-螺旋烷)-4-甲氧

6、基-4-(3“-磷酰氧基)苯-1,2-二氧雜環(huán)丁烷二、發(fā)光劑的標(biāo)記技術(shù)1. 碳二亞胺（EDC）縮合法2. 過碘酸鈉氧化法3重氮鹽偶聯(lián)法4. N-羥基琥珀酰亞胺活化法影響標(biāo)記的因素1. 發(fā)光劑的選擇2. 被標(biāo)記蛋白質(zhì)的性質(zhì)3. 標(biāo)記方法的選擇4. 原料比5. 標(biāo)記率6. 溫度7. 純化與保存第三節(jié)化學(xué)發(fā)光免疫分析的類型一、直接化學(xué)發(fā)光免疫分析用吖啶酯直接標(biāo)記抗體(抗原)，與待測標(biāo)本中相應(yīng)的抗原(抗體)發(fā)生免疫反應(yīng)后，形成固相包被抗體-待測抗原-吖啶酯標(biāo)記抗體復(fù)合物，這時只需加入氧化劑（H2O2）和NaOH使成堿性環(huán)境，吖啶酯在不需要催化劑的情況下分解、發(fā)光 。由集光器和光電倍增管接收、記錄單位時

7、間內(nèi)所產(chǎn)生的光子能，這部分光的積分與待測抗原的量成正比，可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計算出待測抗原的含量。直接化學(xué)發(fā)光的機理- 夾心法+帶丫啶酯標(biāo)記物抗體抗體磁微粒被測抗原（1）加入H2O2（pH10）發(fā)光沖洗后 磁微粒技術(shù)磁微粒模式圖特點 抗原和抗體結(jié)合與未結(jié)合部分的易分離Y二、化學(xué)發(fā)光酶免疫分析化學(xué)發(fā)光酶免疫分析（chemiluminescenceenzyme immunoassay，CLEIA）是用參與催化某一化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的酶如辣根過氧化物酶（HRP）或堿性磷酸酶(ALP)來標(biāo)記抗原或抗體，在與待測標(biāo)本中相應(yīng)的抗原(抗體)發(fā)生免疫反應(yīng)后，形成固相包被抗體-待測抗原-酶標(biāo)記抗體復(fù)合物，經(jīng)洗滌后，加入底物

8、(發(fā)光劑)，酶催化和分解底物發(fā)光，由光量子閱讀系統(tǒng)接收，光電倍增管將光信號轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘柌⒓右苑糯?，再把它們傳送至計算機數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，計算出測定物的濃度。 辣根過氧化物酶標(biāo)記的化學(xué)發(fā)光免疫分析該分析系統(tǒng)采用辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記抗體(或抗原)，在與反應(yīng)體系中的待測標(biāo)本和固相載體發(fā)生免疫反應(yīng)后，形成固相包被抗體-待測抗原-酶（HRP）標(biāo)記抗體復(fù)合物，這時加入魯米諾發(fā)光劑、H2O2和化學(xué)發(fā)光增強劑使產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光。辣根過氧化物酶標(biāo)記化學(xué)發(fā)光免疫分析示意圖 堿性磷酸酶標(biāo)記的化學(xué)發(fā)光免疫分析該分析系統(tǒng)以堿性磷酸酶標(biāo)記抗體(或抗原)， 在與反應(yīng)體系中的待測標(biāo)本和固相載體發(fā)生免疫反應(yīng)后，形成固相包被抗體

9、-待測抗原-酶標(biāo)記抗體復(fù)合物，這時加入AMPPD發(fā)光劑，堿性磷酸酶使AMPPD脫去磷酸根基團而發(fā)光。堿性磷酸酶標(biāo)記化學(xué)發(fā)光免疫分析示意圖 分析步驟在磁場中清洗去除 未結(jié)合物質(zhì)分配樣品, 磁顆粒和試劑加入底物產(chǎn)生信號孵育, 促使信號的產(chǎn)生孵 育 使反應(yīng)物結(jié)合信號檢測三、電化學(xué)發(fā)光免疫分析電化學(xué)發(fā)光免疫分析（electrochemiluminescence immunoassay，ECLIA）是以電化學(xué)發(fā)光劑三聯(lián)吡啶釕標(biāo)記抗體(抗原)，以三丙胺(TPA)為電子供體， 在電場中因電子轉(zhuǎn)移而發(fā)生特異性化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，它包括電化學(xué)和化學(xué)發(fā)光兩個過程。在電化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng)中，磁性微粒為固相載體包被抗體(

10、抗原)，用三聯(lián)吡啶釕標(biāo)記抗體(抗原)，在反應(yīng)體系內(nèi)待測標(biāo)本與相應(yīng)的抗原 (抗體)發(fā)生免疫反應(yīng)后，形成磁性微粒包被抗體-待測抗原-三聯(lián)吡啶釕標(biāo)記抗體復(fù)合物，這時將上述復(fù)合物吸入流動室，同時引人TPA緩沖液。當(dāng)磁性微粒流經(jīng)電極表面時，被安裝在電極下面的電磁鐵吸引住，而未結(jié)合的標(biāo)記抗體和標(biāo)本被緩沖液沖走。與此同時電極加壓，啟動電化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，使三聯(lián)吡啶釕和TPA在電極表面進行電子轉(zhuǎn)移，產(chǎn)生電化學(xué)發(fā)光，光的強度與待測抗原的濃度成正比。電化學(xué)發(fā)光免疫分析示意圖電化學(xué)發(fā)光免疫測定示意圖標(biāo)記磁顆粒在電場中發(fā)光工作示意圖四、臨床應(yīng)用1. 甲狀腺激素2. 生殖激素3. 垂體激素和皮質(zhì)激素4. 貧血因子5. 腫瘤標(biāo)志物6. 感染性疾病7. 糖尿病胰島素、血清C-肽、血漿胰高糖素等。8. 心臟標(biāo)志物9. 病毒標(biāo)記物10. 過敏性疾病11. 治療藥物監(jiān)測思考題1. 什么是發(fā)光免疫分析？什么是化學(xué)發(fā)光免疫分析？2. 化學(xué)發(fā)光與熒光的區(qū)別？化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的條件？3. 什么叫化學(xué)發(fā)光劑？化學(xué)發(fā)光劑必須具備那些條件？4. 吖啶酯化學(xué)發(fā)光的原理和特點是什么？5. 酶促反應(yīng)的發(fā)光劑有哪些？其發(fā)光原理和特點是？6. 三聯(lián)吡啶釕發(fā)光的原理和特點是什么？7. 三丙胺在電化學(xué)發(fā)光中起什么作用？8. 發(fā)光劑的標(biāo)記有那些方法？影響因素有那些？9. 什么是直接化學(xué)發(fā)光免疫分析？其特點是什么？10. 什么是化學(xué)發(fā)光酶免疫分析