遺傳病的基因診斷參考幻燈片.ppt

1、遺傳病的基因診斷,藥學2班 辛鑫,1,一、基因診斷的概念及常用技術,2,基因診斷利用分子生物學技術，從DNA/RNA水平檢測基因的存在,分析基因的結構變異和表達狀態(tài)，從而對疾病作出診斷。,（一）基本概念,3,（二）基因診斷常用方法,核酸分子雜交 PCR DNA序列測定 DNA芯片技術,4,1、核酸雜交,基本原理-核酸變性和復性理論 即雙鏈的核酸分子在某些理化因素作用下雙鏈解開，而在條件恢復后又可依堿基配對規(guī)律形成雙鏈結構。因此應用已知堿基序列的單鏈核苷酸片段作為探針，就可檢測樣本中是否存在與其互補的同源核苷酸序列。,5,6,核酸雜交的關鍵要素,probe DNA target DNA sign

2、al detection,7,核酸雜交方法分類,按作用環(huán)境大致分為固相雜交和液相雜交兩種類型。 固相雜交是將參加反應的一條核酸鏈先固定在固體支持物上，一條反應核酸游離在溶液中。 液相雜交所參加反應的兩條核酸鏈都游離在溶液中。,8,固相雜交分類,Southern 印記雜交 Northern 印記雜交 斑點雜交 原位雜交,9,Southern blot 是最經典的基因分析方法，不但能檢出特異的DNA片段，而且能進行定量和測定分子量，可用于基因的酶切圖譜分析、基因突變分析等。,10,Northern雜交 用于RNA的檢測，能對組織細胞中總RNA或mRNA進行定性和定量分析。,11,斑點雜交（Dot

3、blot）,可用基因組中特定基因及其表達的定性及定量分析，方法簡單、快速靈敏、樣品用量少；其缺點是不能鑒定所測基因的分子量，特異性不高，有一定比例的假陽性。,12,原位雜交（Colony in situ hybridization）,可查明染色體中特定基因的位置，用于染色體疾病的診斷；原位雜交的結果是顯示有關核酸序列的空間位置情況，因此可檢出含核酸序列的具體細胞，細胞的具體定位，數目和類型，可檢出基因和基因產物的亞細胞定位。,13,2、利用PCR及結合其他技術進行基因診斷,直接采用PCR進行基因診斷 采用PCR產物的限制性片段長度多態(tài)性分析（PCR-RFLPs）進行基因診斷 采用PCR結合等位

4、基因特異性寡核苷酸探針（ASO）斑點雜交進行基因診斷 通過PCR產物的反相點雜交(RBD)進行基因診斷 采用PCR產物的單鏈構象多態(tài)性(SSCP)分析進行基因診斷 采用PCR技術對靶核酸進行定量分析,14,寡核苷酸雜交分析SNP和等位基因特異寡核苷酸雜交 （ASO）,15,3、 DNA序列測定,DNA序列測定是進行基因突變檢測的最直接、最準確的方法，可以確定突變的部位，突變的性質。,16,4、 DNA芯片技術,應用DNA芯片，可以檢測基因的結構及其突變多態(tài)性，對基因表達的情況進行分析。,17,（三） 基因診斷的特點,高特異性 高靈敏度 獲得穩(wěn)定的結果 早期快速 適用性強，應用范圍廣,18,二、

5、 遺傳病的基因診斷,（以血紅蛋白病為例）,19,（一）血紅蛋白病概述,血紅蛋白由四條鏈組成，兩條鏈和兩條鏈，每一條鏈有一個包含一個鐵原子的環(huán)狀血紅素。,20,21,血紅蛋白?。╤emoglobinopathy）是由于血紅蛋白分子結構異常（異常血紅蛋白病），或珠蛋白肽鏈合成速率異常（珠蛋白生成障礙性貧血，又稱海洋性貧血）所引起的一組遺傳性血液病。臨床可表現溶血性貧血、高鐵血紅蛋白血癥或因血紅蛋白氧親和力增高或減低而引起組織缺氧或代償性紅細胞增多所致紫紺。,22,（二）血紅蛋白病的分類,異常血紅蛋白?。篐b結構發(fā)生了變化 導致貧血病 如：鐮刀狀細胞貧血 地中海貧血：組成Hb的珠蛋白很成降低 或消失

6、，Hb的結構不發(fā)生 變化 亦稱：珠蛋白合成障礙性貧血,23,（三）鐮狀細胞貧血,紅細胞呈鐮刀狀，壽命短，引起溶血性貧血。 患者多在成年以前死亡,24,Mst酶切位點(CCTNAGG),5,3,正?；?突變基因,1.15kb,1.35kb,1、鐮狀紅細胞貧血分子機制,5 67 -Pro GluGlu -CCT GAG GAG-,5 67 -Pro AlaGlu -CCT GTG GAG-,25,2.鐮狀細胞貧血的基因診斷方法,常用方法有限制性內切法（RE），ASO，ARMS，跨越斷裂點的PCR技術（裂口-PCR） 最常用的是RE,26,限制性內切酶/Southern blot 采集制備血液DN

7、A內切酶Mst消化電泳轉膜32P標記的珠蛋白cDNA雜交放射自顯影,27,28,0.2kb,1.15kb,1.35kb,正常人,突變攜帶著,患者,鐮狀紅細胞貧血患者基因組的限制性酶切分析,29,PCR/限制性內切酶 設計引物PCR擴增產物進行限制性內切酶酶切電泳EB染色直接觀察 例： 引物1：5-GGG CTG GGC ATA AAA GTCA-3 引物2：5-AAT AGA CCA ATA GGC AGAG-3 擴增產物294bp,30,引物1,CCT GAG GAG,CCT GTG GAG,引物1,引物2,引物2,294bp,103bp,191bp,Mst酶切位點(CCTNAGG),31,

8、103bp,191bp,294bp,正常人,突變攜帶著,患者,鐮狀紅細胞貧血患者PCR產物的限制性酶切分析,32,（四）、地中海貧血(Thalassaemia,簡寫thal或T),珠蛋白基因突變導致該多肽鏈的合成大為減少（）或完全缺失（0） 珠蛋白合成速率降低，導致鏈和鏈合成的不平衡多余的珠蛋白鏈沉積在紅細胞膜上改變了膜的通透性和硬度導致溶血性貧血。 高危人群地中海人、中東人、印度人、中國人；中國人群中又一廣東、廣西、四川、貴州等省發(fā)病率最高。 缺乏有效治療措施。,33,1、 地貧病的分子基礎,珠蛋白基因全長2053bp，含2個內含子（IVSI和IVS-II），3個外顯子。 目前發(fā)現突變有百余種，中國人群發(fā)現約20種； 一般對特定種族來說，90%的地貧基因僅由46種突變組成。,34,2、 地中海貧血的基因診斷,PCR/ASO斑點雜交法 合成2對PCR引物（擴增區(qū)段700bp和580bp，分別包含14種和1種可能突變）合成等位特異寡核苷酸(ASO)探針（46對，分別標記） 制備DNA樣品 PCR擴增 斑點印跡雜交 RFLP分析法,35,c,左側缺失4.2kb,右側缺失3.7kb,b,b,b,a,2,1,1,2N端1