細胞周期及其調(diào)控(講義).ppt

1、醫(yī)學分子細胞生物學,細胞周期及其調(diào)控 Cell Cycle ATM基因是AT唯一致病基因； 對AT純合子突變細胞的研究表明，這類突變細胞缺乏細胞周期檢查點調(diào)控對輻射損傷的正常反應(yīng)，缺乏輻射誘導P53蛋白增加、p21wAFl和Gadd45轉(zhuǎn)錄和翻譯水平增強的動態(tài)變化，表明ATM很可能是DNA損傷反應(yīng)途徑中p53的上游分子。,ATM（ataxia telangiectasia-mutated gene） 最早發(fā)現(xiàn)于毛細血管擴張性共濟失調(diào)癥患者，人類中大約有1%的人是ATM缺失的雜合子，表現(xiàn)出對電離輻射敏感和易患癌癥。 ATM編碼蛋白激酶，與損傷DNA結(jié)合，信號通路有兩條: 激活Chk1（check

2、point kinase）, 使cdc25的Ser216磷酸化失去活性，抑制M-CDK的活性，中斷細胞周期。 激活Chk2，使P53被磷酸化而激活，然后P53作為轉(zhuǎn)錄因子，導致P21的表達，P21抑制G1-S期CDK的活性，中斷細胞周期。,(3) P16INK4a P16INK4a基因位于人類染色體9p21區(qū)，編碼由148個氨基 酸組成的分子量為16kD蛋白質(zhì)。 P16INK4a與周期蛋白 D1競爭性結(jié)合G1期激酶CDK4CDK6，抑制其對pRB 的磷酸化作用，使游離的E2F-1與未磷酸化的PRB結(jié) 合，依賴于E2F-1轉(zhuǎn)錄的基因不能轉(zhuǎn)錄，P16INK4a間接抑 制包括DNA合成在內(nèi)的多種生化

3、反應(yīng)，使細胞周期正 常運行。,（4）pRB pRB的去磷酸化在M及s期由蛋白磷酸酶1催化進行。 在周期蛋白CDK復合物與蛋白磷酸酶1的協(xié)同作用下， pRB的磷酸化去磷酸化之間的動態(tài)平衡有效控制著G1 限制點的“開啟和關(guān)閉”，從而保證細胞周期的有序運行 及細胞的正常增殖。,生長因子與相應(yīng)受體結(jié)合,通過信號傳遞促進cyclin基因表達；cyclin與相應(yīng)的CDK結(jié)合為激酶復合物對pRb進行磷酸化； 磷酸化的pRb釋放其結(jié)合并抑制的蛋白,主要是轉(zhuǎn)錄因子E2F以 及具激酶活性的CAB-1蛋白等；游離的E2F進入核內(nèi),與多種具 特殊序列的基因啟動子區(qū)結(jié)合(如c-myc、b-myb、cdc2、二氫 葉酸還

4、原酶、TK及E2F-1基因等),促進這些基因的表達；這些 基因的產(chǎn)物促進細胞通過G1/S調(diào)控點.CKI通過抑制cyclin-CDK 激酶活性,使pRb不能磷酸化,pRb仍與E2F結(jié)合,E2F則不能進入 核內(nèi)發(fā)揮轉(zhuǎn)錄作用,使細胞停滯于G1期.,G1/S調(diào)控點以pRb為中心構(gòu)成一個復雜網(wǎng)絡(luò)的共同模式,細胞周期長短測定,脈沖標記DNA復制和細胞分裂指數(shù)觀察測定法 流式細胞儀測定法(Flow Cytometry) 縮時攝像技術(shù)，可以得到準確的細胞周期時間及分 裂間期和分裂期的準確時間。,細胞周期同步化1,人工選擇同步化（ 藥物誘導法） 條件依賴性突變株在細胞周期同步化中的應(yīng)用： 將與細胞周期調(diào)控有關(guān)的

5、條件依賴性突變株轉(zhuǎn)移 到限定條件下培養(yǎng)，所有細胞便被同步化在細胞周期中某一特定時期。,人工選擇同步化2有絲分裂選擇法：用于單層貼壁生長細胞。優(yōu)點：細胞未經(jīng)任何藥物處理，細胞同步化效率高。缺點：是 分離的細胞數(shù)量少。密度梯度離心法： 根據(jù)不同時期細胞在體積和重量上存在差別進行分離。優(yōu)點：方法 簡單省時，效率高，成本低。缺點：對大多數(shù)種類的細胞并不適用。,藥物誘導法（DNA合成阻斷法） G1/S-TdR雙阻斷法：將細胞群阻斷于G1/S交界處。優(yōu)點：同步化效率高，適合所有體外培養(yǎng)細胞體系。缺點：是誘導過程可造成細胞非均衡生長。分裂中期阻斷法 通過抑制微管聚合來抑制細胞分裂器的形成，將細胞阻斷在細胞分

6、裂中期。優(yōu)點：是操作簡便，效率高。缺點：是這些藥物的毒性相對 較大。,第三節(jié) DNA受損阻止細胞 周期的分子學說,一、DNA損傷的后果:,信號傳導異常,長期效應(yīng),老化,腫瘤,疾病,DNA 修復機制,短期效應(yīng),異常增生和代謝,生理功能紊亂,細胞死亡,細胞增殖減少,基因表達異常,基因組不穩(wěn)定,哺乳類動物的細胞周期檢查點控制機制,二 、細胞衰老的理論 （一）基因轉(zhuǎn)錄或翻譯差錯、代謝廢物積累； （二） ROS引發(fā)脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和核酸分子氧化性損傷； （三）端 粒 鐘 學 說（telomere clock theory) （四）衰老基因與抗衰老基因 1.衰老基因 人類：載脂蛋白E4基因、淀粉樣蛋白基因 p

7、16, p53 p21 RB基因 2. 抗衰老基因 WRN bcl-2,CDK22，cyclinA、B 和 c-fos表達下降,不能是Rb磷酸化,E2F與Rb結(jié)合，從而不能發(fā)揮轉(zhuǎn)錄作用,細胞不能進入S期,細胞進入S期,生長因子,（二）細胞衰老的生化變化 DNA復制、轉(zhuǎn)錄、修復能力 端粒長度 DNA甲基化 DNA / chromosome 損傷 2. mRNA與核糖體結(jié)合能力 蛋白質(zhì)合成能力 3.蛋白質(zhì)分子損傷，功能 酶活性,第四節(jié) 細胞周期與疾病,一、癌與細胞周期 癌基因(oncogene) : 能促使細胞無限增殖、癌變的DNA序列。分若干基因家族（已發(fā)現(xiàn)近百種癌基因） 抑癌基因（suppre

8、ssion-oncogene)：存在于正常細胞中、能抑制細胞惡性增殖的基因。,1細胞周期驅(qū)動機制失控 Cyclins的過表達（Overexpression of cyclins） 腫瘤的發(fā)生與cyclin（D、E）過量表達有關(guān)。 Cyclin D1（Bcl-1）過表達原因（原癌基因） 乳腺癌、胃癌、食道癌存在Cyclin D1基因擴增過度。,基因突變: Cyclin D1 T286突變 Cyclin D1泛素化受阻 Cyclin D1,染色體倒位（Chromosome inversion） Cyclin D1基因倒位于甲狀旁腺啟動子控制，Cyclin D1蛋白合成 染色體易位（Chromoso

9、me translocation) 甲狀旁腺腺癌 Bcl-1 t(11:14) (q13:q32)易位 Cyclin D1受Ig重鏈基因增強子影響 Cyclin D1表達, CDK 表達異常 主要見于CDK4、CDK6過表達。 CDK4+ cyclin D結(jié)合 CDK4/cyclin D CDKs表達 pRb pRb磷酸化 細胞增殖過度 E2F G1/S過渡加速,【Cyclin D過表達致腫瘤機制】 Cyclin D過表達 + 生長因子 CDKs瀑布效應(yīng) 細胞增殖過度 易發(fā)生細胞癌變,可能, CDI表達不足和突變 腫瘤細胞中常出現(xiàn)CDI（腫瘤抑制基因）表達不足或突變。 p16 InK4基因失活

10、原因 突變或缺失、染色體易位、p16 InK4高度甲基化。,Mechanism p16 InK4基因表達 CDK4與cyclin D結(jié)合 細胞周期處在“易于”被啟動狀態(tài) 易發(fā)生細胞癌變,G1/S交界處失察 P53 進入S期 DNA損傷 修復成功 G1/S檢查 停頓G1期 損傷DNA修復 修復失敗 細胞凋亡 下調(diào)bcl-2表達、激活bax 基因 P53,表2 人類腫瘤p53基因突變熱點和頻率 腫瘤型 突變頻率（%） 突變熱點 腫瘤型 突變頻率（%） 突變熱點 肺癌 56 157，248，273 前列腺癌 30 不確定 結(jié)腸癌 50 175，245，248，273 肝細胞癌 45 249 食道癌 45 不確定 膠質(zhì)癌 25 175、248 卵巢癌 44 273 乳腺癌 22 175、248、273 胰腺癌