巴西橡膠樹(shù)單染色體分離及其高通量測(cè)序分析的研究

1、煤炭及含硫模型化合物生物降解轉(zhuǎn)化的研究,專業(yè)： 礦物加工工程 姓名： 邵雪嫚 導(dǎo)師： 張明旭教授,安徽理工大學(xué)13級(jí)碩士研究生 學(xué)位論文答辯報(bào)告,報(bào)告主要內(nèi)容,課題來(lái)源 立題依據(jù) 國(guó)內(nèi)外研究進(jìn)展 本研究的目的和意義 研究?jī)?nèi)容 研究方法和技術(shù)路線 預(yù)期目標(biāo) 新穎之處 所需解決的主要問(wèn)題 研究基礎(chǔ)和條件 研究進(jìn)度及經(jīng)費(fèi)預(yù)算,選題背景,最近幾年，由于煤炭的降解機(jī)理與降解酶有著直接的關(guān)系，所以煤炭的生物降解研究主要集中在白腐菌所產(chǎn)生的一系列降解酶，由此也聯(lián)想到通過(guò)提高酶活性和產(chǎn)酶量來(lái)達(dá)到高降解轉(zhuǎn)化率的目的。一般來(lái)說(shuō)，MnP氧化大部分酚類(lèi)、胺類(lèi)等底物，LiP與其互為補(bǔ)充，氧化相對(duì)應(yīng)的物質(zhì)，而漆酶不僅可以

2、氧化胺類(lèi)物質(zhì)也可氧化酚類(lèi)物質(zhì) 9,10。微生物降解煤中有機(jī)硫研究已經(jīng)取得很大的進(jìn)展11-12，其中研究最多的屬嗜硫菌對(duì)模型化合物DBT的降解，并且其確定了4S途徑的降解機(jī)理13，對(duì)于其他含硫模型化合的研究較少，因此本課題研究了DBTO2的脫硫情況。,1.課題來(lái)源,基于基因工程構(gòu)建煤炭降解工程菌降解轉(zhuǎn)化煤炭的機(jī)理研究(51374014) 生物酶脫除煤炭中有機(jī)硫的機(jī)理研究（ 51474012）,2.立題依據(jù),橡膠是我國(guó)重要的戰(zhàn)略物資。國(guó)內(nèi)外已從橡膠中克隆了近420種基因或cDNA，然而這些基因基本均是從橡膠樹(shù)cDNA文庫(kù)或其總基因組中獲得，無(wú)法確定其在橡膠樹(shù)染色體上的位置和分布特點(diǎn)，從而導(dǎo)致無(wú)法進(jìn)

3、一步確定其所在的連鎖群。研究者也先后發(fā)表了利用各種分子標(biāo)記構(gòu)建的橡膠樹(shù)連鎖遺傳圖，但均是從總基因組中獲得，并存在著不同程度的連鎖群不穩(wěn)定，豐度小而且分布不均勻，許多功能基因在染色體組上的連鎖關(guān)系和位置都不清楚，直接利用分子標(biāo)記輔助橡膠樹(shù)育種難度較大。,3.國(guó)內(nèi)外研究進(jìn)展,目前木質(zhì)素降解酶已成為國(guó)內(nèi)研究的熱點(diǎn)，石開(kāi)儀等人發(fā)現(xiàn)白腐真菌通過(guò)Lac和Lip的催化作用可以使百里酚脫酚基、脫甲基、開(kāi)環(huán)、氧化等。何寶燕、尹華、彭輝等人研究了黃孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)對(duì)十溴聯(lián)苯醚(BDE209)的降解；發(fā)現(xiàn)在含1mg/LBDE209的降解體系中，生物量為1.74g

4、降解率達(dá)到最大(86.76%)；盧永等利用黃抱原毛平革菌對(duì)焦化廢水進(jìn)行降解研究，找到了降解的最優(yōu)條件19；曾斌等研究了白腐真菌對(duì)五氯酚的降解情況 20；這些都為進(jìn)一步探索微生物對(duì)有機(jī)物的降解打下了基礎(chǔ)。,研究?jī)?nèi)容,（1）紫外誘變對(duì)黃孢原毛平革菌酶活性的影響以及酶活性與降解率之間的關(guān)系。 （2）微波誘變后的誘變菌的酶活性變化以及對(duì)低階煤的降解狀況。 （3）紫外，微波處理的球紅假單胞菌對(duì)DBT的降解狀況及最適誘變時(shí)間。 （4）利用響應(yīng)面處理的方法探索影響DBT降解效果的因素。 （5）球紅假單胞菌對(duì)其他含硫模型化合物的降解。,創(chuàng)新點(diǎn),（1）目前，對(duì)于利用紫外、微波誘變方法，篩選誘變菌種已做了大量的研

5、究工作，但是這兩種處理方法對(duì)降解酶系的活性和產(chǎn)量有無(wú)影響，以及降解酶活性與降解轉(zhuǎn)化率之間的關(guān)系還有待于進(jìn)一步探索。 （2）球紅菌可以降解轉(zhuǎn)化DBT已被我們所熟知，但是紫外或是微波處理后的菌種對(duì)其降解效果還未被探究。 （3）球紅菌對(duì)其他的含硫模型化合有無(wú)降解能力，降解效果如何，降解產(chǎn)物具體是那些等問(wèn)題還未被探究。 （4）首次利用響應(yīng)面的方法探索了球紅菌降解DBT的影響因素的最佳組合 （5）結(jié)合生物酶提純技術(shù)，首次探索了紫外，微波誘變處理后降解酶的濃度變化與酶活性變化。.,已發(fā)表的采用高通量測(cè)序的植物全基因組 De nove 測(cè)序: 黃瓜(Cucumis sativus)（Huang S等,200

6、9） 蘋(píng)果(MalusdomesticaBorkh)(Velasco R等,2010) 野生大豆(Glycine soja)(Kim M Y等,2010) 森林草莓（Shulaev V等,2011)、 可可樹(shù)(Argout X等,2011) 麻風(fēng)樹(shù)(Jatropha curcas)(Sato S等,2011) 棗椰樹(shù)(Phoenix dactylifera)(Al-Dous E K等,2011)馬鈴薯(Solanum tuberosum)(Xu X等,2011) 白菜(Brassica rapa)(Wang X等,2011) 大麻(Cannabis sativa)(van Bakel H等,2

7、011) 木豆(Cajanus cajan)(Varshney R K等,2012) 蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)(Young N 等,2011) 橡膠樹(shù)的全基因組 De nove 測(cè)序目前還為發(fā)布。在植物方面對(duì)植物單條染色體進(jìn)行高通量測(cè)序僅在小麥的單條染色體臂（聶小軍等,2013）的研究中有過(guò)報(bào)道，在橡膠樹(shù)中尚未見(jiàn)報(bào)道。,基因組測(cè)序只能測(cè)出整個(gè)DNA的堿基對(duì)排列順序，不能直接測(cè)出DNA上的基因及其功能，必須通過(guò)生物信息學(xué)方法，結(jié)合蛋白組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)，對(duì)測(cè)出來(lái)的序列進(jìn)行分析，將基因及其功能加以挖掘、注釋，這稱作基因注釋?；蚪M注釋主要包括四個(gè)研究方向：重復(fù)序列的識(shí)別；非編

8、碼RNA的預(yù)測(cè)；基因結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)和基因功能注釋。在國(guó)內(nèi)外在植物方面已有對(duì)花生(陳華等,2009)、水稻(王宏斌等,2010)、大豆(王茵茵等,2010)、杜仲(李鐵柱,2012)、構(gòu)樹(shù)(彭建軍,2013)，擬南芥(張翔,2012,2013)等進(jìn)行基因注釋的相關(guān)報(bào)道。在橡膠樹(shù)上的基因注釋比較少。,4.本研究目的和意義,本研究采用顯微玻璃針?lè)蛛x技術(shù)對(duì)巴西橡膠樹(shù)部分染色體進(jìn)行單染色體顯微分離，再利用單細(xì)胞全基因組擴(kuò)增法對(duì)橡膠樹(shù)部分單染色體進(jìn)行體外擴(kuò)增，并對(duì)其第二輪PCR產(chǎn)物采用Illumina/Solexa高通量測(cè)序技術(shù)進(jìn)行測(cè)序，進(jìn)而對(duì)相應(yīng)染色體的序列進(jìn)行序列分析、功能注釋，從而進(jìn)一步明確橡膠樹(shù)已知的重

9、要功能基因和預(yù)測(cè)功能的基因在橡膠樹(shù)染色體組上的位置，初步對(duì)現(xiàn)有的橡膠樹(shù)連鎖群進(jìn)行歸類(lèi)。 本項(xiàng)目可為篩選橡膠樹(shù)染色體特異片段、單染色體或其區(qū)段的特異探針或特異標(biāo)記，為構(gòu)建橡膠樹(shù)單條染色體功能基因的分離和定位及基因組物理圖譜構(gòu)建提供有效工具，從而有效的應(yīng)用于橡膠樹(shù)分子輔助育種。,5.研究?jī)?nèi)容,5.1巴西橡膠樹(shù)熱研7-33-97單染色體分離技術(shù)體系的建立。 主要通過(guò)借助顯微操作儀的玻璃針?lè)蛛x法，進(jìn)行巴西橡膠樹(shù)熱研7-33-97部分單條染色體分離和技術(shù)體系的優(yōu)化。,5.2單條染色體體外擴(kuò)增與鑒定,采用單細(xì)胞全基因組擴(kuò)增法對(duì)已分離出的巴西橡膠樹(shù)染色體進(jìn)行體外擴(kuò)增，通過(guò)Southern雜交鑒定擴(kuò)增產(chǎn)物來(lái)自

10、巴西橡膠樹(shù)基因組，經(jīng)熒光原位雜交（FISH)驗(yàn)證并結(jié)合核型分析確定染色體序號(hào)。,5.3巴西橡膠樹(shù)單染色體PCR產(chǎn)物高通量測(cè)序與序列的功能注釋,對(duì)已鑒定的單染色體第二輪的PCR產(chǎn)物進(jìn)行Illumina/Solexa高通量測(cè)序，并對(duì)測(cè)序結(jié)果通過(guò)相應(yīng)生物信息學(xué)分析進(jìn)行其功能注釋。如單條染色體測(cè)得的序列片段進(jìn)行編號(hào)、片段大小分析，通過(guò)BLAST在線進(jìn)行各橡膠樹(shù)序列與基因庫(kù)中橡膠樹(shù)已知功能基因或未知基因序列比對(duì)，進(jìn)一步明確橡膠樹(shù)重要功能基因在橡膠樹(shù)染色體組上的位置，同時(shí)對(duì)同源染色體的序列進(jìn)行比對(duì)，進(jìn)而分析同源染色體之間在DNA水平上可能存在的差異等。,6.研究方法與技術(shù)路線,6.1實(shí)驗(yàn)材料 本研究的主要

11、實(shí)驗(yàn)材料是：黃孢原毛平革菌，球紅假單胞菌，DBT。,6.2研究方法,1紫外誘變 （1）首先打開(kāi)紫外燈預(yù)熱30min穩(wěn)定光波 取制備好的孢子懸液各6ml于9ml的平板培養(yǎng)平皿中，放在磁力攪拌器上，邊攪拌邊照射控制照射距離30cm。輻射處理時(shí)間梯度為：0s；20s；40s；80s；120s；160s；200s；250s。所有操作必須在紅燈下進(jìn)行，照射后的菌體不可直接接到平板培養(yǎng)基上，必須轉(zhuǎn)入無(wú)菌試管中并立即放入無(wú)光照的冰水中1-2h，防止細(xì)胞修復(fù)，影響實(shí)驗(yàn)效果。 （2）取上述誘變處理的菌懸液0.5ml均勻涂布于平板固體培養(yǎng)基上，四天后觀察菌落生長(zhǎng)狀況，圖片記錄。將上述各自生長(zhǎng)狀況良好的菌落同上制成

12、106/ml的孢子懸液，接1ml菌懸液于50ml的發(fā)酵液中，搖床培養(yǎng)7天后，分別取10ml樣品裝入小錐形瓶，加入各種酶提取用緩沖溶液（LiP采用緩沖液A，MnP采用緩沖液B，漆酶采用100mmol/L的醋酸鈉緩沖液，PH5.0）振蕩提取1h，150rpm。離心（4200rpm,20min），取上清液用0.45um濾膜過(guò)濾，濾液用于測(cè)定酶活。 2微波誘變 打開(kāi)微波爐，選取中檔功率，取制備好的106/ml孢子懸液30ml與錐形瓶中，取1000ml大燒杯，其中加入蒸餾水適量，將錐形瓶放入，確保蒸餾水液面淹沒(méi)錐形瓶中孢子懸液的液面。每照射20S后取出錐形瓶，用移液槍取1ml于配置好的發(fā)酵液中，然后用溫

13、度測(cè)量?jī)x檢測(cè)蒸餾水的溫度，當(dāng)超過(guò)40時(shí)必須換掉燒杯中的蒸餾水，如此反復(fù)操作，直到照射時(shí)間達(dá)到160S，預(yù)先設(shè)置的最大時(shí)間梯度。將處理好的發(fā)酵液放在搖床培養(yǎng)箱中30,120轉(zhuǎn)，培養(yǎng)一周，取出測(cè)其酶活性49-51。,研究方法,2.3.3酶活性測(cè)定方法 (1)LiP活性測(cè)定52：采用藜蘆醇法，一個(gè)酶活力單位定義為(U)每分鐘氧化藜蘆醇產(chǎn)生1mol藜蘆醛所需的酶量。取0.6ml藜蘆醇溶液（10mmol/L）加入1.2ml緩沖液A與1.2ml粗酶液混勻，得反應(yīng)液3ml，向反應(yīng)液中加入60LH2O2溶液（2mmol/L）啟動(dòng)反應(yīng)，在310nm下測(cè)定反應(yīng)1min吸光度值的變化。 （2）MnP活性測(cè)定53：一

14、個(gè)酶活力單位(U)定義為每分鐘氧化Mn2+產(chǎn)生1molMn3+所需酶量。取2.4ml含MnSO4(1.25mmol/L)的酒石酸緩沖液B加入0.6ml粗酶液混勻得到3ml反應(yīng)液，加入60LH2O2溶液（2mmol/L）啟動(dòng)反應(yīng)在290nm下測(cè)定反應(yīng)1min吸光度值的變化。 （3）Lac活性方法見(jiàn)文獻(xiàn)54：一個(gè)酶活力單位定義(U)為1mol的ABTS所需的酶量，以不加啟動(dòng)因子的混合液為空白樣。以ABTS為底物在420nm下測(cè)定3min內(nèi)吸光度的變化。3ml反應(yīng)液包括：緩沖液C，0.4ml粗酶液，0.6mlABTS(1.0mmol/L)55。 2.3.4降解率的測(cè)定 用紫外誘變后的平板制成106/

15、ml的菌懸液，分別取1ml于50ml的發(fā)酵液中，置于搖床培養(yǎng)2天后分別加入0.4g處理過(guò)的內(nèi)蒙褐煤煤樣，搖床培養(yǎng)一周，取發(fā)酵液3500rpm離心，將離心后的上清液加鹽酸，出現(xiàn)絮狀沉淀，將沉淀干燥后稱重，計(jì)算降解率56，即： =M1/M0100%(3) 式中： M0加入的每樣質(zhì)量g M1煤炭降解后上清液中的質(zhì)量g 煤炭降解轉(zhuǎn)化率% 2.3.5 2-HBP測(cè)試方法 Gibbs 試劑在弱堿性條件下可與酚羥基對(duì)位的活潑氫縮合成藍(lán)色絡(luò)合物，可用來(lái)檢測(cè)酚羥基對(duì)位無(wú)取代基的化合物，0.2g的2.6二氯醌亞胺溶于200ml的乙醇溶液中，備用。 Gbbs試劑方法為：將菌液離心后，取上清液1ml加入2ml的pH9

16、.0的緩沖液中，加入12滴20%的Na2CO3以保證反應(yīng)體系中的pH9,最后加入60ul的Gibbs試劑，混勻后加入30水浴鍋振蕩30min,以不加上清液的作為對(duì)照，在610nm下測(cè)定光密度57。,紫外誘變白腐菌酶,酶活性檢測(cè),褐煤降解率檢測(cè),微波誘變白腐菌,酶活性檢測(cè),酶活性大小對(duì)比，最適誘變時(shí)間,6.3 技術(shù)路線,紅外分析 掃描電鏡分析,降解率對(duì)比，最適誘變時(shí)間,紫外，微波誘變效果大小對(duì)比分析,褐煤降解率檢測(cè),紅外分析 掃描電鏡分析,技術(shù)路線,紫外誘變白腐菌降解DBT,紫外誘變球紅菌降解DBT,2-HBP檢測(cè),2-HBP檢測(cè),脫硫效果對(duì)比分析,球紅假單胞菌降解DBT的響應(yīng)面實(shí)驗(yàn),響應(yīng)面結(jié)果

17、分析,7.研究成果,1）1）在紫外誘變條件下，白腐菌三種降解酶的濃度與酶活性均出現(xiàn)了規(guī)律的變化，酶濃度變化為L(zhǎng)iP濃度隨著誘變時(shí)間的增加，呈現(xiàn)先增大后減小，在40-160S之間LiP生成量較大，繼續(xù)增加誘變時(shí)間時(shí)。濃度下降，推測(cè)誘變時(shí)間太長(zhǎng)，殺死了大量的菌株，從而使產(chǎn)酶量下降。MnP濃度開(kāi)始階段無(wú)太大變化，但是隨著時(shí)間的增加出現(xiàn)大幅度上升，推測(cè)此誘變時(shí)間段為最適誘變時(shí)間，得到的誘變菌產(chǎn)酶量最大，120S酶濃度最大。Lac濃度整體呈下降趨勢(shì)，誘變菌的濃度均低于對(duì)照組，由此推測(cè)對(duì)于Lac來(lái)說(shuō)，紫外誘變?yōu)樨?fù)突變。酶活性測(cè)試結(jié)果與酶濃度大體相同，說(shuō)明酶活性與濃度有著直接的線性關(guān)系，即酶濃度基本上決定著

18、酶活性的大小 2）在微波誘變條件下，1）隨著微波誘變時(shí)間的增加LiP酶活性整體上呈現(xiàn)先增大后下降的現(xiàn)象，這與紫外誘變相類(lèi)似，并且酶活性均大于對(duì)照組，MnP酶的活性整體上變化幅度較小，在150S左右時(shí)酶活得到稍微提高，隨著時(shí)間的增加，進(jìn)而出現(xiàn)下降的趨勢(shì)，Lac的活性基本上未出現(xiàn)變化。說(shuō)明微波誘變對(duì)漆酶的產(chǎn)生沒(méi)有影響。綜合考慮降解酶活性的變化，微波誘變時(shí)間在150S時(shí)的酶活性最大，因此為了提高降解率，微波誘變時(shí)間應(yīng)控制在120S到180。與紫外誘變相比，微波誘變時(shí)酶活性變化幅度較小，且微波誘變操作復(fù)雜。條件難以控制。誤差較大，不建議使用。 3）通過(guò)兩個(gè)不同濃度DBT的脫硫體系的對(duì)比發(fā)現(xiàn)，適當(dāng)增加D

19、BT的濃度可以提高降解數(shù)量，有利于充分利用降解體系的降解作用，避免資源的浪費(fèi)。從兩個(gè)誘變體系，發(fā)現(xiàn)隨著DBT濃度的增加，脫硫效率并沒(méi)有呈現(xiàn)相應(yīng)幅度的增加，推測(cè)高濃度DBT對(duì)菌種的發(fā)酵培養(yǎng)起到抑制的作用，因此后續(xù)的工作應(yīng)該從解除抑制作用著手。微波誘變與紫外誘變對(duì)球紅菌的脫硫能力仍有一定的影響，兩者相比，紫外誘變的的效果較好，而微波誘變降解率基本無(wú)多大的波動(dòng)，說(shuō)明球紅菌對(duì)于紫外誘變較敏感，而微波由于操作復(fù)雜，過(guò)程難以控制，實(shí)驗(yàn)誤差較大，所以從本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果得出，不建議使用。為解除DBT對(duì)菌種生長(zhǎng)的抑制作用，設(shè)計(jì)了菌種的馴化實(shí)驗(yàn)，馴化菌的降解率均大于自然菌種，推測(cè)DBT作為誘導(dǎo)物起到了促進(jìn)作用。 4）

20、響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)篩選出了影響DBT降解的顯著性因素，即pH，接菌量，DBT含量，為以后含硫模型化合物的高效脫除提供了依據(jù)。 5)黃孢原毛平革菌與紅球假單胞菌均有降解低階煤的作用，但是黃孢菌的降解效果優(yōu)于球紅菌，而對(duì)于含硫模型化合物DBT與DBTO2的降解，球紅菌的脫硫效果卻明顯高于黃孢菌。 6）綜合兩者的優(yōu)缺點(diǎn)，使用混合菌種的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，旨在先利用黃孢菌的降解作用，再進(jìn)行脫硫，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示了優(yōu)于球紅菌單一菌種的脫硫效果。進(jìn)一步完善橡膠樹(shù)單染色體微分離技術(shù)體系，為功能基因的發(fā)現(xiàn)、分離與轉(zhuǎn)化奠定基礎(chǔ)。,8.展望,1）為了克服木質(zhì)素降解菌在煤炭降解體系中生長(zhǎng)繁殖受限制的問(wèn)題，采用原生質(zhì)體融合技術(shù)，如利用黃孢

21、原毛平革菌與哈慈木霉融合，不僅可以利用黃孢原毛平革菌作為模式菌種的優(yōu)勢(shì)，又可以利用哈慈木霉適應(yīng)性強(qiáng)、生長(zhǎng)繁殖快的特點(diǎn)。 （2）為了提高酶產(chǎn)量，可以通過(guò)從高產(chǎn)酶的降解菌種中克隆出產(chǎn)酶基因，然后導(dǎo)入一些耐受性較強(qiáng)的菌種中，也可以利用DNA改組技術(shù)，定向改變菌種一些特性。 （3）要實(shí)現(xiàn)煤炭生物降解的工業(yè)化生產(chǎn)還必須解決生物降解底物的抑制問(wèn)題，因此生物降解過(guò)程必須脫離活菌，這就要求我們?cè)谑炀氄莆丈锝到鈾C(jī)理的同時(shí)，模擬其降解轉(zhuǎn)化過(guò)程，研制出生物降解轉(zhuǎn)化催化劑。 （4）此外我們也可以應(yīng)用定向進(jìn)化技術(shù)和快速比色篩選法獲得突變基因，這些突變基因所編碼的酶對(duì)一些底物有更好的穩(wěn)定性以及更高的降解活性。 （5）為

22、了提高降解效率和優(yōu)化脫硫效率，以后的研究可以考慮從混合菌種著手，充分利用各個(gè)菌種的優(yōu)勢(shì)，達(dá)到理想效果。 6)從本研究?jī)?nèi)容發(fā)現(xiàn)，無(wú)論是低階煤的降解還是模型化合物的脫硫均存在底物抑制，因此可以此為出發(fā)點(diǎn)尋找高效誘導(dǎo)物，進(jìn)行菌種馴化，提高實(shí)驗(yàn)效果。,9.擬解決的關(guān)鍵性問(wèn)題,本項(xiàng)目的關(guān)鍵性問(wèn)題之一是制備高質(zhì)量橡膠染色體標(biāo)本并從中期分裂相中分離出無(wú)污染的單條染色體。在國(guó)內(nèi)外有關(guān)高通量測(cè)序和基因注釋方面的文獻(xiàn)大多是與全基因組和轉(zhuǎn)錄組相關(guān)，對(duì)于整條染色體進(jìn)行測(cè)序分析和基因注釋的，報(bào)道較少，因此對(duì)橡膠樹(shù)單條染色體測(cè)序后如何對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行基因注釋是本實(shí)驗(yàn)要解決的另一個(gè)關(guān)鍵性問(wèn)題。,10.研究基礎(chǔ)和條件,課題組主要成員長(zhǎng)期從事作物遺傳育種教學(xué)與研究工作，具有豐富的理