Bio-rad-MicroPulser電穿孔儀中文說明書

1、MicroPulser電穿孔儀操作手冊2018年12月27日1、 介紹（1）基本原理MicroPulser電穿孔儀用于細菌、酵母和其他眾多微生物的電擊轉化，轉化時，高壓電脈沖作用于懸浮在小體積高阻介質中的樣品。本系統(tǒng)由一個脈沖發(fā)生器（pulse generator）模塊、一個電擊腔（shocking chamber）和一個裝有電極的電擊杯（cuvette）組成。樣本放置于電擊杯的電極之間。MicroPulser模塊包含一個電容器，將電容器充電至高電壓，然后模塊將電容器中的電流放電到試管中的樣品中。MicroPulser的電容放電電路產(chǎn)生具有指數(shù)衰減波形的電脈沖，如下圖。當電容器放電至樣品時，跨

2、越電極的電壓迅速上升至最大電壓（or峰值電壓，peak voltage；也稱為初始電壓，Vo），并隨時間（t）減小，如下式：其中=RC，為時間常數(shù)，是脈沖長度的簡便表達式。 R為電路電阻，單位為ohms（歐姆）。 C為電容，單位為microfarad（微法拉）。根據(jù)方程1，是電壓下降至峰值電壓1/e（37%）的時間。MicroPulser的內部電路被設計以使E.coli、釀酒酵母及其他許多微生物可以得到最佳電穿孔，最佳轉化效率發(fā)生在大約5ms的時間常數(shù)內。這些電穿孔條件是通過使用10微法拉電容器和將600歐姆電阻與樣品池并聯(lián)以及將30歐姆電阻與樣品池串聯(lián)來實現(xiàn)的。除時間常數(shù)外，電場強度是另一個

3、決定轉化效率的重要參數(shù)。電場強度E，是施加于電極間的電壓，公式為：其中，V為施加的電壓，d為電極間的距離，單位為cm。電場強度和細胞的尺寸（size）決定了橫貫每個細胞的電壓降，正是電壓降可能是電穿孔中電壓效應的重要表現(xiàn)。30歐姆串聯(lián)電阻的目的是在發(fā)生電弧的情況下保護設備電路。在正常操作條件下，當樣本在高電阻介質中，電阻不會影響施加在樣本上的電壓。但是，當樣本的電阻較低時，電阻將極大地降低施加在樣品上的電壓。施加在樣品上的電壓的分壓降（fractional drop）由下式得到：當Rsample為600歐姆，對于樣品就會有5%的電壓降（30/（30+600）=0.048）?；谶@個原因，當樣品

4、溶液的電阻低于600歐姆時，不應進行電穿孔試驗。這包括培養(yǎng)基未徹底從細胞中去除的樣本，殘留有NaCl的DNA樣本或連接混合物。MicroPulser能夠測量樣本的電阻，若樣本介質電阻過低則不會進行操作。（2）儀器參數(shù)操作（Manipulation of instrument parameters）MicroPulser儀器的一些參數(shù)可以進行設置以達到最大轉化效率，包括場強E，時間常數(shù)，截斷指數(shù)衰減脈沖的寬度。場強的設置可以有兩種方式進行操作。一是，介于200-3000V電壓可以直接在儀器上設置，這是最容易控制的。改變電壓而保持其他條件不變是大多數(shù)電穿孔優(yōu)化程序的基礎。第二，使用不同電極間隙寬度

5、的電轉杯也是改變場強的一種方法。對于微生物的電穿孔，0.1和0.2cm間隙的電轉杯最常被使用。E.coli的電穿孔當使用0.1cm電轉杯時通常使用1.8kV電壓（E=18kV/cm），而使用0.2cm電轉杯時使用2.5kV電壓（E=12.5kV/cm）。這些電穿孔條件作為預設程序內置于MicroPulser中，分別位于細菌設置菜單中的Ec1（V=1.8kV）和Ec2（V=2.5kV）。另外，細菌設備菜單中的第三個程序Ec3的電壓為3.0kV（當電轉杯為0.2cm時E=15kV/cm），我們發(fā)現(xiàn)可以得到比2.5kV更高的轉化效率。時間常數(shù)可以通過改變樣品的電阻而改變。樣品電阻的改變可以通過兩種方

6、式。一是，增加電穿孔介質的鹽濃度或緩沖濃度會降低樣品的電導，反之亦然，結果導致時間常數(shù)的改變。第二，電轉杯中樣品體積與樣品電阻呈反比，降低樣品體積會增加樣品電導。樣品體積對電導的影響在低電阻介質中是最顯著的。這些影響因素將會在后面部分進一步介紹。MicroPulser還包括一種在電壓大于600V時比預期時間常數(shù)更快截斷指數(shù)衰減脈沖的方法。當脈沖被MicroPulser終止時，電壓只在樣品上作用指定長度的時間，可能在1.0 4.0 ms之間。下圖顯示了這種波形和真正的指數(shù)衰減脈沖的差異。2、 影響電穿孔的因素通過多年的研究，證實了微生物電穿孔的電條件（see Chang, et al., 199

7、2, and Nickoloff, 1995, for overviews as well as for protocols on electroporation of numerous species）。對大多數(shù)微生物而言，最佳電轉化發(fā)生在與E.coli和釀酒酵母所使用的電轉化條件相似的條件下，E.coli和釀酒酵母是當今研究中最常使用的兩個物種。對于E.coli的電穿孔，文獻報道最常使用的條件是0.2cm電轉杯，40l細胞樣本，電壓2.5kV，時間5ms。對釀酒酵母，報告中最常使用的條件是0.2cm電轉杯，40l細胞樣品，1.5kV電壓和時間常數(shù)5ms。對許多細菌而言，如沙門氏菌屬（Sal

8、monella）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、幽門螺桿菌（Helicobacter）、包柔式螺旋體屬（Borrelia）、鏈球菌屬（Streptococcus）、乳球菌屬（Lactococcus）和腸球菌屬（Enterococcus），電穿孔條件與E.coli一樣。而對于其他的細菌，改變電場強度可以得到更高的電轉化效率。一個相似的案例可見于其他種屬的酵母。MicroPulser的設計可以精確施加E.coli和釀酒酵母獲得最佳轉化效率所需的脈沖參數(shù)。當使用高阻樣本時，時間常數(shù)被設置為5ms。對于這些微生物，MicroPulser預先設定了在0.1或0.2 cm的電擊杯中電穿孔大腸桿菌，

9、或在0.2或0.4 cm的電擊杯中電穿孔釀酒酵母時輸送正確電壓的程序。（1） 細胞生長（Cell Growth）對于大多數(shù)細菌而言，在對數(shù)生長期的早期或中期收獲細胞，可以得到最高的轉化效率。對于E.coli，當細胞進行穩(wěn)定期，轉化效率劇烈下降（Dower，1990）。相反，大多數(shù)酵母通常在對數(shù)生長的中期至晚期收獲細胞。對于釀酒酵母（S.cerevisiae），對數(shù)生長晚期的培養(yǎng)物相比早期的培養(yǎng)物，轉化效率提高了60倍（Becker and Guarente，1991）。獲取細胞的最佳生長期通常隨細胞種類而異。當制備一種新的物種的感受態(tài)細胞時，最好使用為同種屬而制定的程序。對所需考慮因素的建議和

10、常用的制備感受態(tài)細胞的方法在Dower et al（1992）和Trevors et al（1992）的文章中被詳細討論。（2） DNA大多數(shù)的電穿孔應用是將質粒DNA轉入細胞中，需要提及的是，幾乎任何形式的分子都可以通過電穿孔被導入細胞中，包括DNA、蛋白、糖類、小分子等。除了少數(shù)例外，當導入自主復制質粒時，使用超螺旋質粒進行電穿孔可以提高轉化效率。但是，將整合入宿主基因組的質粒當使用線性化質粒時，轉化效率較高。例如，假絲酵母、畢赤酵母和四膜蟲使用線性質粒比超螺旋質粒效率更高。在E.coli和單核細胞增多性李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）電穿孔轉化時，使用松弛型環(huán)狀

11、質粒（relaxed circular plasmid）僅比使用超螺旋質粒的轉化效率略低（Leonardo and Sedivy，1990，Park and Stewart，1990）。但是，在E.coli和Streptococcus pyogenes（釀膿鏈球菌）的電穿孔轉化時，線性質粒比環(huán)狀質粒的轉化效率低103-104倍（Shigekawa and Dower, 1988, Simon and Ferretti, 1991）。在大多數(shù)物種中，每mol數(shù)量的質粒的電穿孔效率隨著質粒大小的增加而降低，包括E. coli （Leonardo and Sedivy, 1990, Siguret

12、et al., 1994），Pseudomonas aeruginosa（假單胞菌屬）（Dennis and Sokol, 1995），和Streptococcus thermophilus（嗜熱鏈球菌屬）（Somkuti and Steinberg，1988）。但是，有些物種，包括Lactococcus lactis（乳球菌屬）（Holo and Nes，1995），Enterococcus faecalis（腸球菌屬）（Cruz-Rodz and Gilmore，1990）和Clostridium perfringens（產(chǎn)氣莢膜梭菌）（Allen and Blaschek，1990），轉

13、化效率似乎與質粒大?。词垢哌_20-30Kb）無關。盡管微生物的轉化使用各種方法提取的質粒都可以完成，但質粒的純度是影響轉化效率的一個因素。未純化的小量制備的質粒DNA的轉化效率明顯低于經(jīng)過各種方法純化的質粒DNA。利用Bio-Rad Quantum matrix制備的質粒與CsCl純化質粒轉化效率相當。 通常，對于所有種類的微生物，轉化頻率隨著DNA濃度的增加而增加。對于E.coli，轉化頻率（轉化子/活細胞）受DNA濃度影響的范圍在106（10 pg/ml to 7.5 g/ml），在這個范圍內，DNA濃度決定了細胞被轉化的概率。在較高的DNA濃度，高達80%的活細胞可被轉化（Dower

14、et al，1988）。因為獲得的轉化子的數(shù)量是轉化頻率和細胞數(shù)量的產(chǎn)物，轉化效率（轉化子/ug DNA）在109-31010細胞/ml范圍內隨細胞濃度增加而增加。因此，為了獲得高的轉化頻率（transformation frequency），請使用高的DNA濃度。為了獲得高的轉化效率（transformation efficiency），請使用高的細胞濃度（和低的DNA濃度以防止共轉化cotransformation）。在每個實例中，小的樣本體積（20-50l）允許經(jīng)濟地使用DNA和細胞（see Dower et al., 1988, for a detailed discussion of

15、 these factors）。（3） 電穿孔介質（Electroporation Media）MicroPulser被設計以使用具有高阻介質的樣本?；诖?，當制備感受態(tài)細胞時，洗滌以徹底去除培養(yǎng)基是非常重要的。若未徹底去除細胞中的培養(yǎng)基將導致電穿孔時在樣本中產(chǎn)生電弧。細胞應該用水或低離子強度的溶液如蔗糖、甘油、葡萄糖、山梨醇或PEG洗滌至少3次。對許多微生物而言，甘油是一種方便的電穿孔介質，因甘油通常被用于細胞保存的冷凍保存液。下圖展示了幾種不同生物學上的重要離子溶液對樣品電阻的濃度效應。注意幾點： 體積對樣品的電阻有重要影響對離子溶液，樣品電阻和電轉杯中樣品的體積呈反比； 含有二價離子的溶

16、液的電阻比含有相同濃度單價離子的溶液電阻低； 緩沖溶液的電阻受pH值影響。即使極低濃度的離子化合物的加入都可以顯著降低樣品的電導，進而引發(fā)電弧作用。通過乙醇沉淀法制備的DNA中殘留的鹽應該在用水或TE buffer溶解DNA前洗滌DNA以降低鹽濃度。表1表明，雖然將含有10mM Tris，1mM EDTA，pH8.0溶液的質粒加入水中，確實會降低樣品的電導，但這應該不會導致不能使用MicroPulser進行電穿孔試驗。可以直接使用酶反應的DNA進行轉化，但進行高壓脈沖操作時，最終電穿孔樣品中的鹽濃度應該保持在低于5meq的水平。最后，連接混合物可能可以用于轉化，但DNA加入量必須極低或者通過稀

17、釋（Willson and Gough，1988）、透析（Heery and Dunican，1989；Jacobs et al., 1990）或乙醇沉淀（Bttger, 1988；Zabarovsky and Winberg，1990）降低離子強度。3、 MicroPulser操作說明參見圖1了解MicroPulser的各個組件，圖5標注了各個按鈕和LED的名稱。3.1 設置MicroPulser系統(tǒng) 將黑色電源線連接到MicroPulser脈沖發(fā)生器模塊的后面板。將電源線插入墻上的插座或電源線。 拉下MicroPulser底部的折疊腳。將該腳插入電擊腔底部的軌道中。將電擊腔滑塊滑入電擊腔。

18、 將從電擊腔引出的導線連接到MicroPulser前面板上的輸出接口上；極性對電穿孔過程并不重要。 打開電源開關。LED燈應亮起并且顯示為“Ec1”，隨后LED指示細菌設置狀態(tài)（Bacteria Setteing）。3.2 MicroPulser的操作（1）選擇預設的程序MicroPulser預設了數(shù)種常見的微生物的電擊程序如下:循環(huán)按“Settings”鍵選擇“Bacteria”、“Fungi”和“Manual”。當“Fungi”旁的LED燈亮時，預存儲的真菌轉化程序即被調出。按“上”和“下”鍵可在不同的真菌轉化程序間切換。電擊的參數(shù)自動按顯示的程序設定。同樣的，選擇“Bacteria”程序

19、相同。不管是選擇“Bacteria”，還是“Fungi”程序，同時按住“上”“下”鍵可以在LED屏上顯示選定程序的參數(shù)。顯示屏上首先顯示的是電壓值，然后是“t”。如果一個程序的時間和多次脈沖相關，則顯示“P”，然后顯示“2”，表示將會進行兩次連續(xù)的脈沖。如果沒有給定“t”，則脈沖是非截短的（not truncated），而如果沒有“P”被給定，則是單次脈沖。（2）使用MicroPulser的手動模式A. 改變電壓按“Settings”鍵，當“Manual”旁的LED燈亮時，顯示屏顯示電壓值（單位kV）。按“上”和 下鍵在0.20 kV-3.00kV之間改變電壓。如果儀器剛剛打開，顯示值為“0.

20、00”。B. 截短脈沖.當“Manual”旁的LED燈亮時，同時按“上”和 下鍵LED屏顯示“t-”，表示為脈沖選擇了時間。開機時的默認設置為標準的指數(shù)衰減脈沖，或衰減過程不被截短，顯示為“-”。同時按“上”和 下鍵后只松開“下”鍵，顯示數(shù)字為截短的脈沖持續(xù)時間，單位為毫秒，從1毫秒“t1.0”開始以0.1毫秒為增量一直到4毫秒“t4.0”。這將限定脈沖時間在1-4毫秒之間。同時按“上”和 下鍵后只松開“上”鍵，可以調整指定的脈沖截短時間到更短。（3）脈沖功能按“Pulse”鍵到電容充電至設定電壓；顯示屏上顯示“PLS”。當脈沖完成后會發(fā)出一次響聲，如果是一次設置好的多重脈沖則在整個脈沖過程中

21、每次脈沖后均會發(fā)出一次響聲，“PLS”則一直在顯示屏上顯示。要想手動進行多重脈沖，則可以在一次脈沖完成且響聲停止后，再次按“Pulse”鍵。如果發(fā)出比較低程度的響聲，伴隨著“Arc”在顯示器上顯示，則表明系統(tǒng)預防和淬滅（ARQ）系統(tǒng)被啟動，脈沖被中止。這通常是電擊杯被擊穿的跡象，如果樣品電阻太小，電擊杯仍可能被擊穿。因為在“ARQ”事件中釋放的能量很低，重新設置一個不會產(chǎn)生電弧的參數(shù)對樣品重新電擊也可能會得到可接受的結果。但是，不建議使用經(jīng)歷了兩次電弧事件的樣品。（4）測量按“Measurements”鍵可以點亮Actual kV LED. 顯示最后一次脈沖試驗的實際電壓（單位kV），如果儀器

22、剛剛開機并且沒有使用過，顯示器顯示0.00。再次按“Measurements”鍵可以點亮“Time ms”LED，顯示上次脈沖持續(xù)時間。按住“測量”按鈕，LED顯示屏將在實際電壓和時間常數(shù)之間切換。3.3 使用MicroPulser進行電穿孔 將細胞懸液移入電轉杯中，輕敲液體使之落入電轉杯底部。0.2cm電轉杯最多可裝0.4ml溶液，0.1cm電轉杯最多可裝80l溶液。注意，溫度會對轉化頻率產(chǎn)生重要影響。某些微生物的電轉，包括E.coli和釀酒酵母，在冷的電轉杯中轉化效率更高。 將電轉杯插入電擊腔的滑槽中。將滑槽推入電擊腔使電轉杯與電擊腔的電極緊密接觸。 按黃色“Pulse”按鈕，給電容器充電

23、并發(fā)出脈沖；LED顯示屏將顯示“PLS”，直到一個聲響結束表明脈沖已經(jīng)給出。LED顯示屏將顯示程序，時間常數(shù)，或實際輸出的電壓，這取決于選擇的LED。 從電擊腔取出滑槽，并取出電擊杯，處理電擊好的樣品細胞。 按下“測量”按鈕，在顯示屏LED上顯示發(fā)送到樣品的時間常數(shù)和實際電壓。當“Actual kV”旁的LED亮起時，電壓顯示為“kV”。再次按下“measurement”按鈕即可顯示時間常數(shù)。“Time ms”旁邊的LED燈亮；時間常數(shù)以“ms”為單位。 按下電源按鈕關閉儀器。如果需要，樣品電擊腔現(xiàn)在可以安全地斷開。在導線斷開之前，不要拆卸電擊腔蓋。4、 E.coli的高效電轉化E.coli電

24、轉化的轉化效率可達109-1010轉化子/g，這比最好的化學轉化法的轉化效率都要高。下面的protocol描述了一種用于高效電轉化的E.coli感受態(tài)細胞的制備方法。我們也對通過電穿孔轉化的其他菌株感興趣，并將此信息收錄在我們的電轉化手冊的后續(xù)版本中。4.1 制備電轉化感受態(tài)細胞參考Ausubel et al.（1987）、Miller和Nickoloff（1995）的文章獲得更詳細信息。 向500ml LB培養(yǎng)基中按1%接種量接種新鮮的過夜E.coli菌液。 37、300rpm培養(yǎng)至OD600約為0.5-0.7（對數(shù)生長早期至中期收獲的細胞可獲得最佳的轉化結果，因此，適當?shù)募毎芏热Q于菌株

25、和生長條件）。 將菌液在冰上放置20min。隨后的步驟中，盡可能保持細胞接近0（置于冰/水浴中），在加入細胞之前，在冰上預冷所有的容器。轉移細胞至預冷的離心管中，4、4000g離心15min。 小心倒去上清液。為了徹底去除培養(yǎng)基，寧可倒去部分細胞、犧牲收率。 用500ml冰預冷的10%甘油溶液輕柔重懸細胞沉淀。4、4000g離心15min，小心倒去上清液。 用250ml冰預冷的10%甘油溶液輕柔重懸細胞沉淀。4、4000g離心15min，小心倒去上清液。 用20ml冰預冷的10%甘油溶液輕柔重懸細胞沉淀。轉移至一個30ml無菌Oakridge管中。4、4000g離心15min。小心倒去上清液。

26、 用1-2ml冰預冷的10%甘油溶液輕柔重懸細胞沉淀。細胞濃度應在1-31010 cells/ml范圍內。本懸液可以冷凍在干冰或-70冰箱中，在該條件下，細胞可以穩(wěn)定保存至少6個月。4.2 電轉化 冰上解凍感受態(tài)細胞。對將要電轉的每個樣品，預先準備一個1.5ml EP管和0.1或0.2cm電轉杯冰上預冷。 在預冷的1.5ml PP管內，混合40l細胞懸液和1-2l DNA（DNA應該為低離子強度溶液，如TE）?；靹?，冰上孵育1min。注意：最好是在一個微量離心管中混合質粒和細胞，因電擊杯的小槽不利于樣品的均勻混合。 若選擇0.1cm電擊杯，請設置MicroPulser程序為“Ec1”，若選擇0

27、.2cm電擊杯，則選擇程序“Ec2”或“Ec3”。具體儀器操作可見操作說明部分。 轉移DNA和細胞的混合物至預冷的電擊杯中，輕彈懸液使其落入電擊杯底部。將電擊杯放入電擊腔滑槽。將滑槽推入電擊腔，直至電擊杯固定于電擊腔的接觸電極間。電擊一次。 從電擊腔中移出電擊杯，立即加入1ml SOC培養(yǎng)基。用移液器迅速而輕柔地懸浮細胞。電擊后至將細胞轉移至生長培養(yǎng)基的時間間隔對E.coli轉化子恢復生長是非常關鍵的（Dower et al，1988）。這一過程即使只延遲1min，都會導致轉化效率3倍的降低。延遲10min則降低20倍。 轉移細胞懸液至17100mm PP管，37、225rpm振蕩培養(yǎng)1小時。

28、 檢查和記錄脈沖參數(shù)。時間常數(shù)應接近5ms。電場強度可以通過實際電壓（kV）/電擊杯間隙寬度（cm）獲得。 在篩選平板上涂平板。4.3 電轉化所需溶液和試劑 LB：10g Bacto tryptone，5g Bacto yeast extract，5g NaCl；溶于1L水，高壓滅菌。 10%（v/v）甘油：12.6g甘油（密度為1.26g/cc）于90ml水。高壓或無菌過濾。 TE：10mM Tris-HCl，pH8.0，1mM EDTA。 SOC：2% Bacto tryptone，0.5% Bacto yeast extract，10mM NaCl，2.5mM KCl，10mM MgCl

29、2，10mM MgSO4，20mM葡萄糖。5、 釀酒酵母（Saccharomyces cerevisciae）的電轉化5.1 感受態(tài)細胞的制備參考Becker & Guarantee（1991）和Ausubel et al.（1987）的文獻獲取更多信息。 用2.8L三角培養(yǎng)瓶裝500ml YPD培養(yǎng)基，向其中接種0.1-0.5ml（原文為an aliquot一小份，未規(guī)定具體接種量）過夜菌液。釀酒酵母在30條件下的的倍增時間大約為2小時。 30過夜培養(yǎng)，250rpm，至細胞密度為1108cells/ml（OD600=？）。 于冰水浴中迅速冷卻以停止生長。 將細胞倒入2個250ml離心瓶中，4

30、、3000g離心5min。 小心倒掉上清液。將有細胞沉淀的離心瓶置冰上。 向每個離心瓶中加入50ml無菌、冰預冷的水，斡旋以重懸細胞沉淀。調整瓶內液體的體積至250ml。4、3000g離心5min。倒去上清液。 用250ml無菌、冰預冷的水按上一步驟重復洗滌細胞一次。 用20ml無菌、冰預冷的1M山梨醇溶液重懸細胞，轉移細胞懸液至一個預冷的30ml Oakridge管。4、3000g離心5min。小心倒去上清液。 用0.5ml無菌、冰預冷的1M山梨醇溶液重懸細胞沉淀。最終的細胞體積約1.3ml，細胞濃度約11010cells/ml。將細胞置于冰上并盡快使用。5.2 電轉 吸取待轉化的DNA樣品

31、（5-100ng/5l）至一個1.5ml無菌EP管，置于冰上預冷。 如果使用0.2cm電擊杯，向每個DNA樣品加入40l感受態(tài)細胞；如果使用0.4cm電擊杯，則加入80l感受態(tài)細胞。輕柔混勻，冰上孵育5min。 若使用0.2cm電擊杯，則設置MicroPulser程序為“Sc2”；若使用0.4cm電擊杯，則設置程序為“Sc4”。 轉移DNA-細胞混合物樣本至選定的且用冰預冷的電擊杯中，輕彈電擊杯使樣本落于電擊杯底部。將電擊杯放入電擊腔滑槽。將滑槽推入電擊腔直至電擊杯固定于電擊腔的接觸電極間。電擊一次。 從電擊腔中移出電擊杯，立即加入1ml冰預冷的1M山梨醇。輕柔轉移細胞懸液至一個無菌管中。 檢

32、查和記錄脈沖參數(shù)。時間常數(shù)應接近5ms。電場強度可以通過實際電壓（kV）/電擊杯間隙寬度（cm）獲得。 在含有1M山梨醇的篩選平板上涂平板。30培養(yǎng)48-72小時。5.3 電轉化所需溶液和試劑 YPD：10g yeast extract，20g peptone，溶于900ml水，高壓滅菌。使用前加入100ml無菌葡萄糖。 1M山梨醇：182.2g山梨醇，溶于800ml水，定容至1L。高壓滅菌。 20%葡萄糖：20g葡萄糖，溶于60ml水。定容至100ml。0.22m濾膜過濾除菌。6、 畢赤酵母（Pichia pastoris）的電轉化6.1 感受態(tài)細胞的制備參考Cregg & Russell（

33、1998）的文獻獲取更多信息。 用2.8L三角培養(yǎng)瓶裝500ml YPD培養(yǎng)基，向其中接種0.1-0.5ml（原文為an aliquot一小份，未規(guī)定具體接種量）過夜菌液。畢赤酵母在30條件下的的倍增時間大約為2小時。 30過夜培養(yǎng)，300rpm，至細胞密度為5-7107cells/ml（OD600=？）。 將細胞倒入2個250ml無菌離心瓶中，4、3000g離心5min。 小心倒掉上清液。 向每個離心瓶中加入50ml無菌YPD/HEPES，斡旋以重懸細胞沉淀；加入1.25ml 1M DTT至每個離心瓶中，輕柔混勻。30孵育15min。 用200ml無菌、冰預冷的1M山梨醇重懸細胞沉淀。4、3

34、000g離心5min。倒去上清。 用50ml無菌、冰預冷的1M山梨醇溶液斡旋重懸細胞，用無菌、冰預冷的1M山梨醇調節(jié)溶液體積至250ml。4、3000g離心5min。倒去上清液。 用10ml無菌、冰預冷的1M山梨醇重懸細胞，匯總轉移細胞懸液至一個預冷的30ml Oakridge管。4、3000g離心5min。小心倒去上清液。 用0.5ml無菌、冰預冷的1M山梨醇溶液重懸細胞沉淀。最終的細胞體積約1.3ml，細胞濃度約1109cells/ml。將細胞置于冰上并盡快使用。5.2 電轉 吸取待轉化的DNA樣品（可多達10ug）至一個1.5ml無菌EP管，置于冰上預冷。 加入40l感受態(tài)細胞每個DNA

35、樣本，輕柔混勻。 設置MicroPulser程序為“Pic”。 轉移DNA-細胞混合物樣本至冰預冷的0.2cm電擊杯中，輕彈電擊杯使樣本落于電擊杯底部。將電擊杯放入電擊腔滑槽。將滑槽推入電擊腔直至電擊杯固定于電擊腔的接觸電極間。電擊一次。 從電擊腔中移出電擊杯。當用營養(yǎng)缺陷突變株進行互補篩選時，立即加入1ml冰預冷的1M山梨醇。若用抗性篩選方法，則立即加入1ml冰預冷的YPD/山梨醇。輕柔轉移細胞懸液至一個無菌管中。 檢查和記錄脈沖參數(shù)。時間常數(shù)應接近5ms。電場強度可以通過實際電壓（kV）/電擊杯間隙寬度（cm）獲得。 用營養(yǎng)缺陷突變株進行互補篩選時，細胞應立即涂布至含有1M山梨醇的限定瓊脂

36、平板（minimal agar plate）上。當用抗性篩選方法時，電轉后的細胞在30振蕩培養(yǎng)1-2小時；在含有1M山梨醇的YPD瓊脂平板上，用適當?shù)目股剡M行電穿孔細胞的培養(yǎng)。30培養(yǎng)72-96小時。5.3 電轉化所需溶液和試劑 YPD/HEPES：100ml YPD培養(yǎng)基，20ml 1M HEPES，pH8.0。 1M DTT：1.55g DTT，溶于8ml水，定容至10ml，過濾除菌。 YPD/山梨醇：10g yeast extract，20g peptone，182.2g山梨醇，溶于700ml水，定容至900ml。高壓滅菌。臨用前加入100ml無菌20%葡萄糖。References1.

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