PCR優(yōu)化問題匯總

1、PCR優(yōu)化問題匯總一、 PCR在產(chǎn)物序列中引入了錯(cuò)誤？參考見解：1. 聚合酶忠實(shí)性低：使用帶有校正活性的熱穩(wěn)定聚合酶，如Platinum Pfx DNA聚合酶。2. 循環(huán)數(shù)太多：降低循環(huán)數(shù)。3. 四種dNTP的濃度不同：制備新的dNTP混合物，保證四種核苷濃度相同。使用預(yù)混合物。二、PCR跑膠，目的條帶很亮，但是邊沿不清楚，前后有拖尾現(xiàn)象？參考見解：1. 模板可能有降解，建議避免反復(fù)凍融，放置時(shí)間不能太長(zhǎng)。模板的質(zhì)量是最重要的。2. 抽提RNA時(shí)有污染，包括基因組DNA污染和蛋白質(zhì)污染，需重做抽提。3. 提高退火溫度，減少非特異性擴(kuò)增。4. 減少循環(huán)次數(shù)，減少非特異性擴(kuò)增。5. 電泳緩沖液時(shí)間

2、太長(zhǎng)，PH值和鹽離子濃度明顯改變。6. 電泳時(shí)電壓不能太高，8V/cm。7. 一般來講，基于promega和TaKaRa的PCR反應(yīng)體系中，Mg和dNTP的濃度是相匹配的，不需改動(dòng)。8. 加樣的量過大。過多的量會(huì)造成加樣孔超載，從而導(dǎo)致拖尾和彌散，對(duì)于較大的DNA此現(xiàn)象更明顯。9. 制膠過程中膠孔沒制好。10. EB沒有沖洗干凈。11. 模板混有基因組DNA，或模板中混有蛋白。12. 非特異反映。引物設(shè)計(jì)的不好，非特異，這種情況容易出現(xiàn)非特異擴(kuò)增造成有非特異性擴(kuò)增帶或拖尾現(xiàn)象。13. 電泳液用久了不換，電泳膠臟了 。14. 擴(kuò)增的條件不合適，一般退火溫度低時(shí)容易使引物在非特異位置結(jié)合引發(fā)擴(kuò)增反

3、應(yīng)造成拖尾。15. 針對(duì)以上情況，可以先提高退火溫度試試，如果實(shí)在不行，再看看引物是不是合適。如果內(nèi)參可以擴(kuò)出來，只能說明程序可能是適合的，但不能完全說明體系合適。體系內(nèi)的各組分，如模板、dNTP、Mg離子、引物等都可能造成拖尾。先得考慮換了那種成分后出現(xiàn)了拖尾，逐項(xiàng)試驗(yàn)。引物當(dāng)然是最重要的因素，但絕非造成拖尾的唯一原因。而且，一般而言，拖尾不會(huì)是引物的問題，尤其是已經(jīng)被用過證明能擴(kuò)出特異片段的 引物，更不可能是它的問題了。先不要加Taq酶，等到其他東西都加完了以后，放到PCR儀上去，到那時(shí)再加，馬上開啟PCR程序試試。檢查一下你的dNTP的量夠不夠。適當(dāng)減少23個(gè)循環(huán)試試，可能會(huì)有效果。三、

4、PCR結(jié)果總是不滿意，請(qǐng)問要注意些什么？參考見解：1. 將PCR反應(yīng)的試管與反應(yīng)板緊貼。2. 當(dāng)酶反應(yīng)混合物以70“熱啟動(dòng)”開始循環(huán)時(shí)，切記在加入酶之后稍微振蕩一下，因?yàn)樵?.2-ml的PCR管中不能均勻傳熱。3. 不要隨意減少dNTP的用量，它是一個(gè)系統(tǒng)的因素，必須與其它成份保持平衡。4. 對(duì)于有問題的PCR反應(yīng)，例如模板的量少，模板不純和環(huán)狀模板等，先嘗試加Taq酶前的體系進(jìn)行預(yù)變性，后加模板進(jìn)行正常PCR擴(kuò)增。5. 沒有擴(kuò)增產(chǎn)物： 在提供MgCl2緩沖液中，以0.25mmol/L為梯度增加MgCl2濃度；無MgCl2的緩沖液以0.5 mmol/L為梯度增加MgCl2濃度。6. 泳道中出現(xiàn)

5、模糊條帶，如果DNA模板中存在RNA，則按上述提示濃度補(bǔ)加MgCl2，因?yàn)樵赑CR反應(yīng)中可能缺少游離的Mg2+。7. 檢查退火溫度和變性條件，如果有需要的話，可降低退火溫度。8. 檢查模板和引物的用量。9. 增加循環(huán)次數(shù)和/或模板DNA的用量。10. 泳道中出現(xiàn)模糊條帶： 減少循環(huán)次數(shù)或模板DNA的用量。 提高退火溫度，但不要超過68。 重新設(shè)計(jì)引物或設(shè)計(jì)更長(zhǎng)的引物。11. 建議使用0.2-ml薄壁管。厚壁管在92時(shí)不能有效地使模板變性。 最佳反應(yīng)體積為50ml，推薦用30ml礦物油覆蓋（對(duì)蓋子加熱的PCR儀可以不加）。 大多數(shù)反應(yīng)中，0.75ml（0.51ml）的酶量在大多數(shù)情況下可以得到滿

6、意的結(jié)果。 建議使用1.75mmol/L MgCl2350mmol/L dNTP或2.25mmol/L MgCl2500mmol/L dNTP組合的混合物。然而要得到最佳結(jié)果，優(yōu)化Mg2+的濃度是必需的。12. 基因組DNA模板的質(zhì)量顯著影響PCR反應(yīng)。因此推薦使用瓊脂糖凝膠電泳來檢測(cè)DNA的長(zhǎng)度。DNA片段長(zhǎng)度可以超過50kb，傳統(tǒng)的基因組DNA能擴(kuò)增片段至10kb。 要擴(kuò)增更長(zhǎng)的片段應(yīng)使用超純或高分子量的DNA。請(qǐng)查閱高分子量DNA提取操作過程相關(guān)文獻(xiàn)。 降低二級(jí)結(jié)構(gòu)和引物二聚物形成的可能性。進(jìn)行長(zhǎng)片段PCR擴(kuò)增時(shí)，引物長(zhǎng)度一般為2434個(gè)核苷酸，溶點(diǎn)在6068間。使用這類引物可提高PCR

7、反應(yīng)的退火溫度來增加反應(yīng)的特異性。這點(diǎn)非常重要，長(zhǎng)片段擴(kuò)增的效果往往受到非特異性短片段優(yōu)先擴(kuò)增的影響。13. 變性：第一步變性在94下進(jìn)行2分鐘。在循環(huán)過程中盡可能縮短變性時(shí)間（94下進(jìn)行20-30秒），除非模板中富含GC，則95下變性30秒。這可以防止DNA脫嘌啉和鏈斷裂，對(duì)于所需擴(kuò)增的基因組DNA片段終長(zhǎng)度超過12 kb時(shí)，應(yīng)該盡可能的降低變性溫度。14. 延伸：68-72下進(jìn)行延伸操作。 循環(huán)延伸：盡量采用循環(huán)延伸的條件，若PCR儀無此功能，則必須增加延伸的時(shí)間，例如在擴(kuò)增10kb片斷時(shí)，延伸時(shí)間用10分鐘替代原來的8分鐘。 長(zhǎng)片斷PCR系統(tǒng)擴(kuò)增的片斷其3-末端帶有一個(gè)突出的A，因此建議

8、采用T/A克隆。若要進(jìn)行平端可隆，可用Klenow酶和T4 DNA多聚酶將PCR產(chǎn)物補(bǔ)平后再進(jìn)行。 測(cè)序時(shí)酶的混合物帶有35外切酶活性，用Sanger方法進(jìn)行測(cè)序不能產(chǎn)生均一的（染色體）帶型。15. 引物設(shè)計(jì)： 一般長(zhǎng)度20-30bp； 至少50%的GC含量； 避免引物二聚體和二級(jí)結(jié)構(gòu)； 引物對(duì)的Tm值應(yīng)該接近。四、假陰性，不出現(xiàn)擴(kuò)增條帶？PCR反應(yīng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)有模板核酸的制備，引物的質(zhì)量與特異性，酶的質(zhì)量及， PCR循環(huán)條件。尋找原因亦應(yīng)針對(duì)上述環(huán)節(jié)進(jìn)行分析研究。參考見解：1. 模板：模板中含有雜蛋白質(zhì)，模板中含有Taq酶抑制劑，模板中蛋白質(zhì)沒有消 化除凈，特別是染色體中的組蛋白，在提取制備模

9、板時(shí)丟失過多，或吸入酚。模 板核酸變性不徹底。在酶和引物質(zhì)量好時(shí)，不出現(xiàn)擴(kuò)增帶，極有可能是標(biāo)本的消化處 理，模板核酸提取過程出了毛病，因而要配制有效而穩(wěn)定的消化處理液，其程序亦應(yīng) 固定不宜隨意更改。2. 酶失活：需更換新酶，或新舊兩種酶同時(shí)使用，以分析是否因酶的活性喪失或不夠而 導(dǎo)致假陰性。需注意的是有時(shí)忘加Taq酶或溴化乙錠。3. 引物：引物質(zhì)量、引物的濃度、兩條引物的濃度是否對(duì)稱，是PCR失敗或擴(kuò)增條帶不 理想、容易彌散的常見原因。有些批號(hào)的引物合成質(zhì)量有問題，兩條引物一條濃度 高，一條濃度低，造成低效率的不對(duì)稱擴(kuò)增，對(duì)策為：選定一個(gè)好的引物合成單 位。引物的濃度不僅要看OD值，更要注重引

10、物原液做瓊脂糖凝膠電泳，一定要有 引物條帶出現(xiàn)，而且兩引物帶的亮度應(yīng)大體一致，如一條引物有條帶，一條引物無條 帶，此時(shí)做PCR有可能失敗，應(yīng)和引物合成單位協(xié)商解決。如一條引物亮度高，一條 亮度低，在稀釋引物時(shí)要平衡其濃度。引物應(yīng)高濃度小量分裝保存，防止多次凍融 或長(zhǎng)期放冰箱冷藏部分，導(dǎo)致引物變質(zhì)降解失效。引物設(shè)計(jì)不合理，如引物長(zhǎng)度不 夠，引物之間形成二聚體等。4. Mg2+濃度：Mg2+離子濃度對(duì)PCR擴(kuò)增效率影響很大，濃度過高可降低PCR擴(kuò)增的特 異性，濃度過低則影響PCR擴(kuò)增產(chǎn)量甚至使PCR擴(kuò)增失敗而不出擴(kuò)增條帶。5. 反應(yīng)體積的改變：通常進(jìn)行PCR擴(kuò)增采用的體積為20ul、30ul、50

11、ul?；?00ul，應(yīng)用多 大體積進(jìn)行PCR擴(kuò)增，是根據(jù)科研和臨床檢測(cè)不同目的而設(shè)定，在做小體積如20ul 后，再做大體積時(shí)，一定要模索條件，否則容易失敗。6. 物理原因：變性對(duì)PCR擴(kuò)增來說相當(dāng)重要，如變性溫度低，變性時(shí)間短，極有可能出現(xiàn)假陰性;退火溫度過低，可致非特異性擴(kuò)增而降低特異性擴(kuò)增效率退火溫度過高影 響引物與模板的結(jié)合而降低PCR擴(kuò)增效率。有時(shí)還有必要用標(biāo)準(zhǔn)的溫度計(jì)，檢測(cè)一下 擴(kuò)增儀或水溶鍋內(nèi)的變性、退火和延伸溫度，這也是PCR失敗的原因之一。7. 靶序列變異：比如靶序列發(fā)生突變或缺失，影響引物與模板特異性結(jié)合，或由于靶序列某段缺失使引物與模板失去互補(bǔ)序列，其PCR擴(kuò)增是不會(huì)成功的

12、。五、出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增帶？ PCR擴(kuò)增后出現(xiàn)的條帶與預(yù)計(jì)的大小不一致，或大或小，或者同時(shí)出現(xiàn)特異性擴(kuò)增帶 與非特異性擴(kuò)增帶？參考見解：非特異性條帶的出現(xiàn)，其原因：一是引物與靶序列不完全互補(bǔ)、 或引物聚合形成二聚體。二是Mg2+離子濃度過高、退火溫度過低，及PCR循環(huán)次數(shù) 過多有關(guān)。其次是酶的質(zhì)和量，往往一些來源的酶易出現(xiàn)非特異條帶而另一來源的酶 則不出現(xiàn)，酶的量過多有時(shí)也會(huì)出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增。其對(duì)策有：必要時(shí)重新設(shè)計(jì)引 物。減低酶的量或調(diào)換另一來源的酶。降低引物量，適當(dāng)增加模板量，減少循環(huán)次 數(shù)。適當(dāng)提高退火溫度或采用二溫度點(diǎn)法(93變性，65左右退火與延伸)。六、PCR擴(kuò)增有時(shí)出現(xiàn)涂抹帶或片狀

13、帶或地毯樣帶？參考見解：其原因往往由于酶的量過多或酶的質(zhì)量差，dNTP濃度過高，Mg2+濃度過高，退火溫度過低，循環(huán)次數(shù)過多引起。其對(duì)策有：減少酶量，或調(diào)換另一來源的酶。減少dNTP的濃度。適當(dāng)降低Mg2+濃 度。增加模板量，減少循環(huán)次數(shù)。七、克隆PCR產(chǎn)物的最優(yōu)條件是什么？參考見解：最佳插入片段：載體比需要實(shí)驗(yàn)確定。1：1（插入片段：載體）常為最佳比，摩爾數(shù)比1：8或8：1也行。應(yīng)測(cè)定比值范圍。連接用5ul 2X連接液, 50ng質(zhì)粒DNA,1Weiss單位的T4連接酶，插入片段共10ul。室溫保溫1小時(shí)，或4oC過夜。在這2種溫度下，缺T-凸出端的載體會(huì)自連，產(chǎn)生藍(lán)斑。室溫保溫1小時(shí)能滿足

14、大多數(shù)克隆要求，為提高連接效率，需4過夜。八、如果沒有回收到目的片段，還需要作什么對(duì)照實(shí)驗(yàn)？參考見解：1. 涂布未轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞。如有菌落，表明氨芐失效，或污染上帶有氨芐抗型的質(zhì)粒，或產(chǎn)生氨芐抗型的菌落。2. 轉(zhuǎn)化完整質(zhì)粒，計(jì)算菌落生長(zhǎng)數(shù)，測(cè)定轉(zhuǎn)化效率。例如，將1ug/ul質(zhì)粒1:100稀釋,1ul用于100ul感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化。用SOC稀釋到1000ul后，用100ul鋪板。培養(yǎng)過夜，產(chǎn)生1000個(gè)菌落。轉(zhuǎn)化率為： 產(chǎn)生菌落的總數(shù)/鋪板DNA的總量。鋪板DNA的總量是轉(zhuǎn)化反應(yīng)所用的量除以稀釋倍數(shù)。具體而言轉(zhuǎn)化用10ng DNA，用SOC稀釋到1000u后含10 ng DNA，用1/10鋪板，

15、共用1 ng DNA。轉(zhuǎn)化率為：1000克隆X10（3次方） ng /鋪板1 ng DNA ug=10（6次方）cfu/ ug轉(zhuǎn)化pGEM-T應(yīng)用10（8次方）cfu/ ug感受態(tài)細(xì)胞如沒有菌落或少有菌落，感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化率太低。3. 如用pGEM-T正對(duì)照，或PCR產(chǎn)物，產(chǎn)生20-40藍(lán)斑（用指定步驟10（8次方）cfu/ ug感受態(tài)細(xì)胞），表明載體失去T?？赡苁沁B接酶污染了核酸酶。T4 DNA連接酶（M1801，M1804，M1794）質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)好無核酸酶污染，不應(yīng)用其它來源的T4 DNA連接酶替換。4. 用pGEM-T或pGEM-T Easy載體，連接pGEM-T正對(duì)照，轉(zhuǎn)化高頻率感受態(tài)細(xì)

16、胞（10（8次方）cfu/ug）,按照指定的實(shí)驗(yàn)步驟，可得100個(gè)菌落，其中60%應(yīng)為白斑，如產(chǎn)生20-40藍(lán)斑, 沒有菌落或少有菌落，連接有問題。九、對(duì)照實(shí)驗(yàn)結(jié)果好，卻沒有回收到目的片段，實(shí)驗(yàn)出了什么問題？參考見解：1. 連接用室溫保溫1小時(shí)，能滿足大多數(shù)克隆，為提高效率，需4oC過夜。2. 插入片段帶有污染，使3-T缺失，或抑制連接，抑制轉(zhuǎn)化。為此，將插入片段和pGEM-T正對(duì)照混合，再連接。如降低了對(duì)照的菌落數(shù)，插入片段需純化，或重新制備。如產(chǎn)生大量的藍(lán)斑，插入片段污染有核酸酶，使pGEM-T或pGEM-T Easy載體3-T缺失。3. 插入片段不適于連接。用凝膠純化的插入片段，因受UV

17、過度照射，時(shí)有發(fā)生。UV過度照射會(huì)產(chǎn)生嘧啶二聚體，不利于連接，DNA必需重新純化。4. 帶有修復(fù)功能的耐熱DNA聚合酶的擴(kuò)增產(chǎn)物末端無A，后者是pGEM-T或pGEM-T Easy載體克隆所需。加Taq DNA聚合酶和核苷酸可在末端加A。詳情查pGEM-T pGEM-T Easy載體技術(shù)資料（TM042）。5. 高度重復(fù)序列可能會(huì)不穩(wěn)定，在擴(kuò)增中產(chǎn)生缺失和重排，如發(fā)現(xiàn)插入片段高頻率地產(chǎn)生缺失和重排，需用重組缺陷大腸桿菌菌株，如SURE細(xì)胞十、PCR體系是10ul的，每次PCR完了以后，管壁上有一層水氣，需不需要覆蓋礦務(wù)油？加多少，具體步驟應(yīng)怎樣？參考見解：是否覆蓋礦物油，要看你用的是那種PCR

18、儀了，目前新出的PCR儀都用不著加，因?yàn)橛袩嵘w技術(shù)、密封嚴(yán)格，如PE2700，2400，9600，9700等PCR儀，可以看看所用PCR儀的說明書，應(yīng)該提到的。去除石蠟油比較有效的方法：1。PCR反應(yīng)之后，把反應(yīng)管放的-20C，凍上20-30分，石蠟是不會(huì)凍住的，等水相結(jié)凍之后，拿出管子，迅速把上面的石蠟油吸掉。用一張干凈的Parafilm，將反應(yīng)液點(diǎn)到上面，輕輕移動(dòng)或提起膜，石蠟油比較粘膜而水相會(huì)流開，分開后吸取水相。十一、PCR加樣孔上有很亮的條帶，但沒有產(chǎn)物條帶？參考見解：最大的可能性是蛋白質(zhì)（Taq酶）與產(chǎn)物結(jié)合，滯留在加樣孔。解決方案，loading buffer加入0.1SDS為了

19、排除其它可能（例如大片段），可以作一個(gè)無反應(yīng)對(duì)照，所有條件都一樣，就是不上PCR儀器。然后同時(shí)跑電泳，看看上樣孔內(nèi)情況。十二、PCR的產(chǎn)量有許多因素決定他們的主次關(guān)系是什么,各因素又是怎么調(diào)節(jié)的？參考見解1. 退火步驟的嚴(yán)格性：提高退火溫度可以減少不匹配的雜交，從而提高特異性。2. 減短退火時(shí)間及延伸時(shí)間可以減少錯(cuò)誤引發(fā)及錯(cuò)誤延伸。3. 引物二聚體是最常見的副產(chǎn)品，降低引物及酶的濃度也可以減少錯(cuò)誤引發(fā)，尤其是引物的二聚化。4. 改變MgCL2(有時(shí)KCL)濃度可以改進(jìn)特異性，這可能是提高反應(yīng)嚴(yán)格性或者對(duì)Taq酶的直接作用。5. 模板中如果存在次級(jí)結(jié)構(gòu)，例如待擴(kuò)增的片段易自行形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)時(shí)，可在

20、PCR混合物中的4d NTPs中加入7-脫氮-2-脫氧鳥苷-5-三磷酸（7-deaza-2-deoxyguanosine-5-trihosphate）(de7GTP)。用de7GTP與dGTP比例為3：1的混合物（150umol/l de7GTP +50mol/L dGTP）代替200mol/l dGTP，則可阻非特異性產(chǎn)物的生成。十三、PCR產(chǎn)物大約有900bP，哪種測(cè)序方法比較好？直接用純化的PCR產(chǎn)物測(cè)序還是克隆到T載體上再測(cè)序？純化PCR產(chǎn)物的方法哪種比較好？參考見解：1. PCR產(chǎn)物直接測(cè)序?qū)CR產(chǎn)物純度要求較高。體系中不得有雜帶，引物二聚體等。另外PCR產(chǎn)物在體系中需達(dá)到一定量，

21、一些低豐度的模板，則需通過增加循環(huán)數(shù)來達(dá)到，但循環(huán)數(shù)太多易出現(xiàn)突變?？寺〉絋載體上比較好。經(jīng)典，且利于保存。酶切鑒定后，選取有正確插入片段的克隆，在將此克隆菌種搖過夜，用1.5毫升EP管裝菌液，送公司測(cè)序。這樣的好處是：公司可以自行鋪板子保存菌種，如果第一次測(cè)序失敗，還可以挑菌落繼續(xù)測(cè)。2. 測(cè)序的一個(gè)反應(yīng)大約可以測(cè)500bp，在T載體多克隆位點(diǎn)兩側(cè)有T7和SP6兩種測(cè)序引物，如果片段小于500bp，只測(cè)一端就夠了。如果大于500bp，建議采用雙向測(cè)序，同時(shí)測(cè)T7和SP6兩個(gè)反應(yīng)，然后將測(cè)序結(jié)果拼接起來。這項(xiàng)可以讓公司完成，也可以自己用軟件完成（如DNASTAR）。3. 關(guān)于純化PCR產(chǎn)物，建

22、議采用經(jīng)典的切膠方法。這種方法回收率為50左右。用此法一般都要用酚氯仿抽提，這是從溶液中去除有機(jī)膠必需的。這也是造成產(chǎn)物損失的主要步驟。十四、引物間形成了比較多的二聚體，使產(chǎn)物很少。這種情況該怎么處理?參考見解:1. 不能重新設(shè)計(jì)就試試降低一下引物濃度，調(diào)整一下體系如優(yōu)化鎂離子濃度或改變模板量。形成引物二聚物的原因很多，如聚合酶是否活化,還有program，退火溫度太高，時(shí)間太短，延伸時(shí)間太短都可能是原因。2. 適當(dāng)提高退火溫度并調(diào)整體系中的Mg2+濃度，結(jié)合熱啟動(dòng)，通?？梢杂行p少引物二聚體的量。當(dāng)然，同時(shí)也可以減少引物的量，也會(huì)有一定的幫助。3. 還可以做套式PCR:即在目的片段兩端外面選

23、擇序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物,這對(duì)引物因?yàn)闆]有位置的限制,可以設(shè)計(jì)的理想一點(diǎn),擴(kuò)增出比目的片段稍長(zhǎng)的一段后,作為模板用樓主現(xiàn)在的引物來擴(kuò)增,比直接擴(kuò)更有效.十五、為什么會(huì)產(chǎn)生彌散（smear）條帶？如何解決？參考見解： 在PCR反應(yīng)體系中第一鏈產(chǎn)物的含量過高。1. 減少引物的用量。2. 優(yōu)化PCR反應(yīng)條件/減少PCR的循環(huán)次數(shù)。3. 在用DNase處理被DNA污染的RNA樣品時(shí)，其產(chǎn)生的寡核苷酸片段會(huì)產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增，一般會(huì)顯示為彌散背景。十六、出現(xiàn)多種擴(kuò)增產(chǎn)物條帶？怎么解決？參考見解：1. 應(yīng)用降落PCR，最好再結(jié)合熱啟動(dòng)PCR或加強(qiáng)PCR（booster PCR）。2. 優(yōu)化MgCl2、模板DNA、熱穩(wěn)定DNA聚合酶及dNTP的濃度。3. 用首次擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物進(jìn)行1：100稀釋后作為模板，再加入新的PCR緩沖液與引物在恒定復(fù)性溫度條件下進(jìn)行30個(gè)循環(huán)的第