PCR優(yōu)化問題匯總

1、PCR優(yōu)化問題匯總一、 PCR在產(chǎn)物序列中引入了錯誤？參考見解：1. 聚合酶忠實性低：使用帶有校正活性的熱穩(wěn)定聚合酶，如Platinum Pfx DNA聚合酶。2. 循環(huán)數(shù)太多：降低循環(huán)數(shù)。3. 四種dNTP的濃度不同：制備新的dNTP混合物，保證四種核苷濃度相同。使用預(yù)混合物。二、PCR跑膠，目的條帶很亮，但是邊沿不清楚，前后有拖尾現(xiàn)象？參考見解：1. 模板可能有降解，建議避免反復(fù)凍融，放置時間不能太長。模板的質(zhì)量是最重要的。2. 抽提RNA時有污染，包括基因組DNA污染和蛋白質(zhì)污染，需重做抽提。3. 提高退火溫度，減少非特異性擴增。4. 減少循環(huán)次數(shù)，減少非特異性擴增。5. 電泳緩沖液時間

2、太長，PH值和鹽離子濃度明顯改變。6. 電泳時電壓不能太高，8V/cm。7. 一般來講，基于promega和TaKaRa的PCR反應(yīng)體系中，Mg和dNTP的濃度是相匹配的，不需改動。8. 加樣的量過大。過多的量會造成加樣孔超載，從而導(dǎo)致拖尾和彌散，對于較大的DNA此現(xiàn)象更明顯。9. 制膠過程中膠孔沒制好。10. EB沒有沖洗干凈。11. 模板混有基因組DNA，或模板中混有蛋白。12. 非特異反映。引物設(shè)計的不好，非特異，這種情況容易出現(xiàn)非特異擴增造成有非特異性擴增帶或拖尾現(xiàn)象。13. 電泳液用久了不換，電泳膠臟了 。14. 擴增的條件不合適，一般退火溫度低時容易使引物在非特異位置結(jié)合引發(fā)擴增反

3、應(yīng)造成拖尾。15. 針對以上情況，可以先提高退火溫度試試，如果實在不行，再看看引物是不是合適。如果內(nèi)參可以擴出來，只能說明程序可能是適合的，但不能完全說明體系合適。體系內(nèi)的各組分，如模板、dNTP、Mg離子、引物等都可能造成拖尾。先得考慮換了那種成分后出現(xiàn)了拖尾，逐項試驗。引物當(dāng)然是最重要的因素，但絕非造成拖尾的唯一原因。而且，一般而言，拖尾不會是引物的問題，尤其是已經(jīng)被用過證明能擴出特異片段的 引物，更不可能是它的問題了。先不要加Taq酶，等到其他東西都加完了以后，放到PCR儀上去，到那時再加，馬上開啟PCR程序試試。檢查一下你的dNTP的量夠不夠。適當(dāng)減少23個循環(huán)試試，可能會有效果。三、

4、PCR結(jié)果總是不滿意，請問要注意些什么？參考見解：1. 將PCR反應(yīng)的試管與反應(yīng)板緊貼。2. 當(dāng)酶反應(yīng)混合物以70“熱啟動”開始循環(huán)時，切記在加入酶之后稍微振蕩一下，因為在0.2-ml的PCR管中不能均勻傳熱。3. 不要隨意減少dNTP的用量，它是一個系統(tǒng)的因素，必須與其它成份保持平衡。4. 對于有問題的PCR反應(yīng)，例如模板的量少，模板不純和環(huán)狀模板等，先嘗試加Taq酶前的體系進行預(yù)變性，后加模板進行正常PCR擴增。5. 沒有擴增產(chǎn)物： 在提供MgCl2緩沖液中，以0.25mmol/L為梯度增加MgCl2濃度；無MgCl2的緩沖液以0.5 mmol/L為梯度增加MgCl2濃度。6. 泳道中出現(xiàn)

5、模糊條帶，如果DNA模板中存在RNA，則按上述提示濃度補加MgCl2，因為在PCR反應(yīng)中可能缺少游離的Mg2+。7. 檢查退火溫度和變性條件，如果有需要的話，可降低退火溫度。8. 檢查模板和引物的用量。9. 增加循環(huán)次數(shù)和/或模板DNA的用量。10. 泳道中出現(xiàn)模糊條帶： 減少循環(huán)次數(shù)或模板DNA的用量。 提高退火溫度，但不要超過68。 重新設(shè)計引物或設(shè)計更長的引物。11. 建議使用0.2-ml薄壁管。厚壁管在92時不能有效地使模板變性。 最佳反應(yīng)體積為50ml，推薦用30ml礦物油覆蓋（對蓋子加熱的PCR儀可以不加）。 大多數(shù)反應(yīng)中，0.75ml（0.51ml）的酶量在大多數(shù)情況下可以得到滿

6、意的結(jié)果。 建議使用1.75mmol/L MgCl2350mmol/L dNTP或2.25mmol/L MgCl2500mmol/L dNTP組合的混合物。然而要得到最佳結(jié)果，優(yōu)化Mg2+的濃度是必需的。12. 基因組DNA模板的質(zhì)量顯著影響PCR反應(yīng)。因此推薦使用瓊脂糖凝膠電泳來檢測DNA的長度。DNA片段長度可以超過50kb，傳統(tǒng)的基因組DNA能擴增片段至10kb。 要擴增更長的片段應(yīng)使用超純或高分子量的DNA。請查閱高分子量DNA提取操作過程相關(guān)文獻。 降低二級結(jié)構(gòu)和引物二聚物形成的可能性。進行長片段PCR擴增時，引物長度一般為2434個核苷酸，溶點在6068間。使用這類引物可提高PCR

7、反應(yīng)的退火溫度來增加反應(yīng)的特異性。這點非常重要，長片段擴增的效果往往受到非特異性短片段優(yōu)先擴增的影響。13. 變性：第一步變性在94下進行2分鐘。在循環(huán)過程中盡可能縮短變性時間（94下進行20-30秒），除非模板中富含GC，則95下變性30秒。這可以防止DNA脫嘌啉和鏈斷裂，對于所需擴增的基因組DNA片段終長度超過12 kb時，應(yīng)該盡可能的降低變性溫度。14. 延伸：68-72下進行延伸操作。 循環(huán)延伸：盡量采用循環(huán)延伸的條件，若PCR儀無此功能，則必須增加延伸的時間，例如在擴增10kb片斷時，延伸時間用10分鐘替代原來的8分鐘。 長片斷PCR系統(tǒng)擴增的片斷其3-末端帶有一個突出的A，因此建議

8、采用T/A克隆。若要進行平端可隆，可用Klenow酶和T4 DNA多聚酶將PCR產(chǎn)物補平后再進行。 測序時酶的混合物帶有35外切酶活性，用Sanger方法進行測序不能產(chǎn)生均一的（染色體）帶型。15. 引物設(shè)計： 一般長度20-30bp； 至少50%的GC含量； 避免引物二聚體和二級結(jié)構(gòu)； 引物對的Tm值應(yīng)該接近。四、假陰性，不出現(xiàn)擴增條帶？PCR反應(yīng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)有模板核酸的制備，引物的質(zhì)量與特異性，酶的質(zhì)量及， PCR循環(huán)條件。尋找原因亦應(yīng)針對上述環(huán)節(jié)進行分析研究。參考見解：1. 模板：模板中含有雜蛋白質(zhì)，模板中含有Taq酶抑制劑，模板中蛋白質(zhì)沒有消 化除凈，特別是染色體中的組蛋白，在提取制備模

9、板時丟失過多，或吸入酚。模 板核酸變性不徹底。在酶和引物質(zhì)量好時，不出現(xiàn)擴增帶，極有可能是標(biāo)本的消化處 理，模板核酸提取過程出了毛病，因而要配制有效而穩(wěn)定的消化處理液，其程序亦應(yīng) 固定不宜隨意更改。2. 酶失活：需更換新酶，或新舊兩種酶同時使用，以分析是否因酶的活性喪失或不夠而 導(dǎo)致假陰性。需注意的是有時忘加Taq酶或溴化乙錠。3. 引物：引物質(zhì)量、引物的濃度、兩條引物的濃度是否對稱，是PCR失敗或擴增條帶不 理想、容易彌散的常見原因。有些批號的引物合成質(zhì)量有問題，兩條引物一條濃度 高，一條濃度低，造成低效率的不對稱擴增，對策為：選定一個好的引物合成單 位。引物的濃度不僅要看OD值，更要注重引

10、物原液做瓊脂糖凝膠電泳，一定要有 引物條帶出現(xiàn)，而且兩引物帶的亮度應(yīng)大體一致，如一條引物有條帶，一條引物無條 帶，此時做PCR有可能失敗，應(yīng)和引物合成單位協(xié)商解決。如一條引物亮度高，一條 亮度低，在稀釋引物時要平衡其濃度。引物應(yīng)高濃度小量分裝保存，防止多次凍融 或長期放冰箱冷藏部分，導(dǎo)致引物變質(zhì)降解失效。引物設(shè)計不合理，如引物長度不 夠，引物之間形成二聚體等。4. Mg2+濃度：Mg2+離子濃度對PCR擴增效率影響很大，濃度過高可降低PCR擴增的特 異性，濃度過低則影響PCR擴增產(chǎn)量甚至使PCR擴增失敗而不出擴增條帶。5. 反應(yīng)體積的改變：通常進行PCR擴增采用的體積為20ul、30ul、50

11、ul。或100ul，應(yīng)用多 大體積進行PCR擴增，是根據(jù)科研和臨床檢測不同目的而設(shè)定，在做小體積如20ul 后，再做大體積時，一定要模索條件，否則容易失敗。6. 物理原因：變性對PCR擴增來說相當(dāng)重要，如變性溫度低，變性時間短，極有可能出現(xiàn)假陰性;退火溫度過低，可致非特異性擴增而降低特異性擴增效率退火溫度過高影 響引物與模板的結(jié)合而降低PCR擴增效率。有時還有必要用標(biāo)準(zhǔn)的溫度計，檢測一下 擴增儀或水溶鍋內(nèi)的變性、退火和延伸溫度，這也是PCR失敗的原因之一。7. 靶序列變異：比如靶序列發(fā)生突變或缺失，影響引物與模板特異性結(jié)合，或由于靶序列某段缺失使引物與模板失去互補序列，其PCR擴增是不會成功的

12、。五、出現(xiàn)非特異性擴增帶？ PCR擴增后出現(xiàn)的條帶與預(yù)計的大小不一致，或大或小，或者同時出現(xiàn)特異性擴增帶 與非特異性擴增帶？參考見解：非特異性條帶的出現(xiàn)，其原因：一是引物與靶序列不完全互補、 或引物聚合形成二聚體。二是Mg2+離子濃度過高、退火溫度過低，及PCR循環(huán)次數(shù) 過多有關(guān)。其次是酶的質(zhì)和量，往往一些來源的酶易出現(xiàn)非特異條帶而另一來源的酶 則不出現(xiàn)，酶的量過多有時也會出現(xiàn)非特異性擴增。其對策有：必要時重新設(shè)計引 物。減低酶的量或調(diào)換另一來源的酶。降低引物量，適當(dāng)增加模板量，減少循環(huán)次 數(shù)。適當(dāng)提高退火溫度或采用二溫度點法(93變性，65左右退火與延伸)。六、PCR擴增有時出現(xiàn)涂抹帶或片狀

13、帶或地毯樣帶？參考見解：其原因往往由于酶的量過多或酶的質(zhì)量差，dNTP濃度過高，Mg2+濃度過高，退火溫度過低，循環(huán)次數(shù)過多引起。其對策有：減少酶量，或調(diào)換另一來源的酶。減少dNTP的濃度。適當(dāng)降低Mg2+濃 度。增加模板量，減少循環(huán)次數(shù)。七、克隆PCR產(chǎn)物的最優(yōu)條件是什么？參考見解：最佳插入片段：載體比需要實驗確定。1：1（插入片段：載體）常為最佳比，摩爾數(shù)比1：8或8：1也行。應(yīng)測定比值范圍。連接用5ul 2X連接液, 50ng質(zhì)粒DNA,1Weiss單位的T4連接酶，插入片段共10ul。室溫保溫1小時，或4oC過夜。在這2種溫度下，缺T-凸出端的載體會自連，產(chǎn)生藍斑。室溫保溫1小時能滿足

14、大多數(shù)克隆要求，為提高連接效率，需4過夜。八、如果沒有回收到目的片段，還需要作什么對照實驗？參考見解：1. 涂布未轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細胞。如有菌落，表明氨芐失效，或污染上帶有氨芐抗型的質(zhì)粒，或產(chǎn)生氨芐抗型的菌落。2. 轉(zhuǎn)化完整質(zhì)粒，計算菌落生長數(shù)，測定轉(zhuǎn)化效率。例如，將1ug/ul質(zhì)粒1:100稀釋,1ul用于100ul感受態(tài)細胞轉(zhuǎn)化。用SOC稀釋到1000ul后，用100ul鋪板。培養(yǎng)過夜，產(chǎn)生1000個菌落。轉(zhuǎn)化率為： 產(chǎn)生菌落的總數(shù)/鋪板DNA的總量。鋪板DNA的總量是轉(zhuǎn)化反應(yīng)所用的量除以稀釋倍數(shù)。具體而言轉(zhuǎn)化用10ng DNA，用SOC稀釋到1000u后含10 ng DNA，用1/10鋪板，

15、共用1 ng DNA。轉(zhuǎn)化率為：1000克隆X10（3次方） ng /鋪板1 ng DNA ug=10（6次方）cfu/ ug轉(zhuǎn)化pGEM-T應(yīng)用10（8次方）cfu/ ug感受態(tài)細胞如沒有菌落或少有菌落，感受態(tài)細胞的轉(zhuǎn)化率太低。3. 如用pGEM-T正對照，或PCR產(chǎn)物，產(chǎn)生20-40藍斑（用指定步驟10（8次方）cfu/ ug感受態(tài)細胞），表明載體失去T?？赡苁沁B接酶污染了核酸酶。T4 DNA連接酶（M1801，M1804，M1794）質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)好無核酸酶污染，不應(yīng)用其它來源的T4 DNA連接酶替換。4. 用pGEM-T或pGEM-T Easy載體，連接pGEM-T正對照，轉(zhuǎn)化高頻率感受態(tài)細

16、胞（10（8次方）cfu/ug）,按照指定的實驗步驟，可得100個菌落，其中60%應(yīng)為白斑，如產(chǎn)生20-40藍斑, 沒有菌落或少有菌落，連接有問題。九、對照實驗結(jié)果好，卻沒有回收到目的片段，實驗出了什么問題？參考見解：1. 連接用室溫保溫1小時，能滿足大多數(shù)克隆，為提高效率，需4oC過夜。2. 插入片段帶有污染，使3-T缺失，或抑制連接，抑制轉(zhuǎn)化。為此，將插入片段和pGEM-T正對照混合，再連接。如降低了對照的菌落數(shù)，插入片段需純化，或重新制備。如產(chǎn)生大量的藍斑，插入片段污染有核酸酶，使pGEM-T或pGEM-T Easy載體3-T缺失。3. 插入片段不適于連接。用凝膠純化的插入片段，因受UV

17、過度照射，時有發(fā)生。UV過度照射會產(chǎn)生嘧啶二聚體，不利于連接，DNA必需重新純化。4. 帶有修復(fù)功能的耐熱DNA聚合酶的擴增產(chǎn)物末端無A，后者是pGEM-T或pGEM-T Easy載體克隆所需。加Taq DNA聚合酶和核苷酸可在末端加A。詳情查pGEM-T pGEM-T Easy載體技術(shù)資料（TM042）。5. 高度重復(fù)序列可能會不穩(wěn)定，在擴增中產(chǎn)生缺失和重排，如發(fā)現(xiàn)插入片段高頻率地產(chǎn)生缺失和重排，需用重組缺陷大腸桿菌菌株，如SURE細胞十、PCR體系是10ul的，每次PCR完了以后，管壁上有一層水氣，需不需要覆蓋礦務(wù)油？加多少，具體步驟應(yīng)怎樣？參考見解：是否覆蓋礦物油，要看你用的是那種PCR

18、儀了，目前新出的PCR儀都用不著加，因為有熱蓋技術(shù)、密封嚴格，如PE2700，2400，9600，9700等PCR儀，可以看看所用PCR儀的說明書，應(yīng)該提到的。去除石蠟油比較有效的方法：1。PCR反應(yīng)之后，把反應(yīng)管放的-20C，凍上20-30分，石蠟是不會凍住的，等水相結(jié)凍之后，拿出管子，迅速把上面的石蠟油吸掉。用一張干凈的Parafilm，將反應(yīng)液點到上面，輕輕移動或提起膜，石蠟油比較粘膜而水相會流開，分開后吸取水相。十一、PCR加樣孔上有很亮的條帶，但沒有產(chǎn)物條帶？參考見解：最大的可能性是蛋白質(zhì)（Taq酶）與產(chǎn)物結(jié)合，滯留在加樣孔。解決方案，loading buffer加入0.1SDS為了

19、排除其它可能（例如大片段），可以作一個無反應(yīng)對照，所有條件都一樣，就是不上PCR儀器。然后同時跑電泳，看看上樣孔內(nèi)情況。十二、PCR的產(chǎn)量有許多因素決定他們的主次關(guān)系是什么,各因素又是怎么調(diào)節(jié)的？參考見解1. 退火步驟的嚴格性：提高退火溫度可以減少不匹配的雜交，從而提高特異性。2. 減短退火時間及延伸時間可以減少錯誤引發(fā)及錯誤延伸。3. 引物二聚體是最常見的副產(chǎn)品，降低引物及酶的濃度也可以減少錯誤引發(fā)，尤其是引物的二聚化。4. 改變MgCL2(有時KCL)濃度可以改進特異性，這可能是提高反應(yīng)嚴格性或者對Taq酶的直接作用。5. 模板中如果存在次級結(jié)構(gòu)，例如待擴增的片段易自行形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)時，可在

20、PCR混合物中的4d NTPs中加入7-脫氮-2-脫氧鳥苷-5-三磷酸（7-deaza-2-deoxyguanosine-5-trihosphate）(de7GTP)。用de7GTP與dGTP比例為3：1的混合物（150umol/l de7GTP +50mol/L dGTP）代替200mol/l dGTP，則可阻非特異性產(chǎn)物的生成。十三、PCR產(chǎn)物大約有900bP，哪種測序方法比較好？直接用純化的PCR產(chǎn)物測序還是克隆到T載體上再測序？純化PCR產(chǎn)物的方法哪種比較好？參考見解：1. PCR產(chǎn)物直接測序?qū)CR產(chǎn)物純度要求較高。體系中不得有雜帶，引物二聚體等。另外PCR產(chǎn)物在體系中需達到一定量，

21、一些低豐度的模板，則需通過增加循環(huán)數(shù)來達到，但循環(huán)數(shù)太多易出現(xiàn)突變。克隆到T載體上比較好。經(jīng)典，且利于保存。酶切鑒定后，選取有正確插入片段的克隆，在將此克隆菌種搖過夜，用1.5毫升EP管裝菌液，送公司測序。這樣的好處是：公司可以自行鋪板子保存菌種，如果第一次測序失敗，還可以挑菌落繼續(xù)測。2. 測序的一個反應(yīng)大約可以測500bp，在T載體多克隆位點兩側(cè)有T7和SP6兩種測序引物，如果片段小于500bp，只測一端就夠了。如果大于500bp，建議采用雙向測序，同時測T7和SP6兩個反應(yīng)，然后將測序結(jié)果拼接起來。這項可以讓公司完成，也可以自己用軟件完成（如DNASTAR）。3. 關(guān)于純化PCR產(chǎn)物，建

22、議采用經(jīng)典的切膠方法。這種方法回收率為50左右。用此法一般都要用酚氯仿抽提，這是從溶液中去除有機膠必需的。這也是造成產(chǎn)物損失的主要步驟。十四、引物間形成了比較多的二聚體，使產(chǎn)物很少。這種情況該怎么處理?參考見解:1. 不能重新設(shè)計就試試降低一下引物濃度，調(diào)整一下體系如優(yōu)化鎂離子濃度或改變模板量。形成引物二聚物的原因很多，如聚合酶是否活化,還有program，退火溫度太高，時間太短，延伸時間太短都可能是原因。2. 適當(dāng)提高退火溫度并調(diào)整體系中的Mg2+濃度，結(jié)合熱啟動，通?？梢杂行p少引物二聚體的量。當(dāng)然，同時也可以減少引物的量，也會有一定的幫助。3. 還可以做套式PCR:即在目的片段兩端外面選

23、擇序列設(shè)計一對引物,這對引物因為沒有位置的限制,可以設(shè)計的理想一點,擴增出比目的片段稍長的一段后,作為模板用樓主現(xiàn)在的引物來擴增,比直接擴更有效.十五、為什么會產(chǎn)生彌散（smear）條帶？如何解決？參考見解： 在PCR反應(yīng)體系中第一鏈產(chǎn)物的含量過高。1. 減少引物的用量。2. 優(yōu)化PCR反應(yīng)條件/減少PCR的循環(huán)次數(shù)。3. 在用DNase處理被DNA污染的RNA樣品時，其產(chǎn)生的寡核苷酸片段會產(chǎn)生非特異性擴增，一般會顯示為彌散背景。十六、出現(xiàn)多種擴增產(chǎn)物條帶？怎么解決？參考見解：1. 應(yīng)用降落PCR，最好再結(jié)合熱啟動PCR或加強PCR（booster PCR）。2. 優(yōu)化MgCl2、模板DNA、熱穩(wěn)定DNA聚合酶及dNTP的濃度。3. 用首次擴增的PCR產(chǎn)物進行1：100稀釋后作為模板，再加入新的PCR緩沖液與引物在恒定復(fù)性溫度條件下進行30個循環(huán)的第