免疫組化操作步驟

1、免疫組化操作步驟第一節(jié) 免疫組化操作步驟及抗原修復(fù)（供參考）第二節(jié) 免疫組化抗原熱修復(fù)的技術(shù)要點(diǎn)（供參考）（一）、儀器設(shè)備1. 18cm不銹鋼高壓鍋或電爐或用微波爐.2. 水浴鍋（二）、試 劑1. PBS緩沖液（pH7.27.4）20.01mol/L檸檬酸鈉緩沖液（CB,pH6.0,1000ml）3. 3%甲醇H2O2溶液：用30%H2O2和80%甲醇溶液配制4. 風(fēng)裱劑：a. 甘油和0.5mmol/L碳酸鹽緩沖液（pH9.09.5）等量混合 b 油和TBS(PBS)配制5TBS/PBS pH9.09.5,適用于熒光纖維鏡標(biāo)本;pH7.0-7.4適合光學(xué)纖維標(biāo)本（三）、操作流程1、脫蠟和水化：

2、脫蠟前應(yīng)將組織芯片在室溫中放置60分鐘或60恒溫箱中烘烤20分鐘。a 組織芯片置于二甲苯中浸泡10分鐘,更換二甲苯后在浸泡10分鐘b 無水乙醇中浸泡五分鐘c 95%乙醇中浸泡五分鐘d 75%乙醇中浸泡五分鐘2、抗原修復(fù)：用于福爾馬林固定的石蠟包埋組織芯片： 抗 原 修 復(fù)（免疫組化石蠟切片）用于福爾馬林固定的石蠟包埋組織芯片需要抗原修復(fù)福爾馬林固定的組織有可能破壞了原來組織的抗原結(jié)構(gòu)，蛋白多肽發(fā)生交聯(lián)，導(dǎo)致部分抗原表位封閉，結(jié)合位點(diǎn)減少，所以需要抗原修復(fù)，以暴露原來的抗原表位，達(dá)到充分顯露抗原，以不出現(xiàn)明顯脫片現(xiàn)象為佳。抗原修復(fù)的幾種常用方法（供參考）1. 微波爐加熱：在微波爐里加熱0.01枸

3、櫞酸鈉緩沖液（pH6.0）至沸騰后將組織芯片放入，斷電，間隔5-10分鐘，反復(fù)1-2次。根據(jù)玻片情況可參考采用微波加熱“3-5-3法”3分鐘溫火沸騰后靜止5分鐘，再溫火沸騰3分鐘即可。 適用的抗原：來源于人、大鼠、小鼠的組織標(biāo)本；來源于其他動(dòng)物種屬的組織標(biāo)本：2. 沸熱修復(fù)： 電爐或水浴鍋加熱0.01M枸櫞酸鈉緩沖液（pH6.0）至95左右，放入組織芯片加熱10-15分鐘。3. 高壓熱修復(fù)：在沸水中加入EDTA(pH8.0)或0.01m枸櫞酸鈉緩沖溶液（pH6.0）.蓋上不銹鋼鍋蓋，但不能鎖定。將玻片置于金屬染色架上，緩慢加壓，使玻片在緩沖液中浸泡五分鐘，然后將蓋子鎖定，小閥門將會(huì)升起來。10

4、分鐘后除去熱源，置入涼水中，當(dāng)小閥門沉下去后打開蓋子。此方法適用于較難檢測或核抗原的抗原修復(fù)。（骨及軟骨組織的標(biāo)本最好選擇較溫和的微波加熱修復(fù)）4. 酶消化方法：常用0.1%胰蛋白酶和0.4%胃蛋白酶液。胰蛋白酶使用前預(yù)熱37，消化時(shí)間約為5-30分鐘。適用于被固定遮蔽的抗原：包括 Collagen.GFAP. Complement.Cytokeratin.c-erB-2.LCA.LN.等 石蠟切片免疫組化染色步驟1.三步法（以SP試劑盒為例）石蠟切片脫蠟至水。蒸餾水沖洗，PBS浸泡5分鐘，如果采用抗原修復(fù)，可在此步后進(jìn)行。3%H2O2室溫孵育510分鐘，以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性，PBS沖

5、洗，2分鐘3次。510%正常山羊血清封閉，室溫孵育10分鐘。傾去血清，勿洗，滴加適當(dāng)比例稀釋的一抗或一抗工作液，37孵育12小時(shí)或4過夜。PBS沖洗，2分鐘3次。滴加適當(dāng)比例稀釋的生物素標(biāo)記二抗（1%BSA-PBS稀釋），37孵育1030分鐘；或滴加第二代生物素標(biāo)記二抗工作液，37或室溫孵育1020分鐘。PBS沖洗，2分鐘3次。滴加適當(dāng)比例稀釋的辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素（PBS稀釋），37孵育1030分鐘；或第二代辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液，37或室溫孵育1020分鐘。PBS沖洗，2分鐘3次。顯色劑顯色（DAB或AEC）。自來水充分沖洗，復(fù)染，脫水透明、封片。如果必要，可選用avdin封閉內(nèi)源性生

6、物素。2.SABC法（1） 脫蠟、水化 （2）PBS洗2次各5分鐘 （3）用蒸餾水或PBS配制新鮮的3%H2O2，室溫封閉5-10分鐘，用蒸餾水洗3次（4）抗原修復(fù)（5） PBS洗5分鐘 （6）滴加正常山羊血清封閉液，室溫20分鐘，甩去多余液體（7）滴加抗50ul,室溫靜置1小時(shí)或4過夜或371小時(shí)（8）PBS洗3次各2分鐘（9）滴加生物素化抗，20-37 20分鐘（10）PBS洗3次各2分鐘 （11）滴加試劑SABC 20-30 20分鐘（12） PBS洗4次各5分鐘 （13） DAB顯色：試劑盒或自配顯色劑顯色（14）脫水、透明、封片、鏡檢。 冰凍切片的免疫組化染色步驟速凍組織冰凍切片48

7、m，冰凍切片后如不染色，必須吹干，儲(chǔ)存低溫冰箱內(nèi)，或進(jìn)行短暫預(yù)固定后儲(chǔ)存于-20冰箱。室溫放置30分鐘后，入4丙酮固定10分鐘。也可根據(jù)需要選擇其他的固定方式。PBS沖洗，5分鐘3次。用3%過氧化氫孵育510分鐘，消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性。PBS沖洗，5分鐘3次。下接石蠟切片免疫組化染色操作步驟（滴加一抗開始）。 第二節(jié) 免疫組化抗原熱修復(fù)的技術(shù)要點(diǎn)（供參考）1、 抗原熱修復(fù)溫度和時(shí)間的關(guān)系我們?nèi)粘９ぷ髦兴褂玫慕M織固定液福爾馬林會(huì)引起組織蛋白內(nèi)或蛋白之間的亞甲基發(fā)生橋連，具體過程如下：第一步基本反應(yīng)福爾馬林和氫反應(yīng)形成新的化合物第二步基本反應(yīng)福爾馬林和氫反應(yīng)形成新的亞甲基橋上述反應(yīng)的結(jié)果導(dǎo)

8、致許多抗原決定簇被封閉，而加熱可以水解該橋連使抗原被激活。影響抗原熱修復(fù)的兩個(gè)最關(guān)鍵的因素是溫度和時(shí)間，有人將這兩種因素對(duì)抗原修復(fù)的影響總結(jié)為下面的公式：抗原熱修復(fù)的有效性=加熱溫度（T） 加熱時(shí)間（t）也就是說當(dāng)我們修復(fù)時(shí)的溫度越低則需要修復(fù)的時(shí)間就越長；反過來當(dāng)修復(fù)溫度增高時(shí)修復(fù)的時(shí)間可以適當(dāng)?shù)乜s短，才能使抗原決定簇完全暴露，這種反比的關(guān)系從MBI單克隆抗體的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表1中也可以清楚地看出。時(shí)間和溫度對(duì)染色的影響時(shí)間（分鐘）100 80 6052 + + + 56 + + + + + + +510 + + + +10小時(shí) + +如果修復(fù)強(qiáng)度不夠，免疫組織化學(xué)染色所顯示的只能是修復(fù)后暴露的部

9、分抗原決定簇，而不是組織所含的全部抗原。這樣的染色結(jié)果可能會(huì)非常弱，或出現(xiàn)假陰性，即使是陽性結(jié)果，充其量只能起到定性的作用，不能適應(yīng)今后對(duì)免疫組化進(jìn)行定量的需要。這就給我們?cè)\斷中定量指標(biāo)的應(yīng)用帶來困難，例如用來測定耐藥的指標(biāo)。2、組織固定時(shí)間和所需的抗原熱修復(fù)的關(guān)系大量的實(shí)驗(yàn)表明，固定時(shí)間越長的標(biāo)本，它所形成的橋連就越緊密，抗原就越難以被激活，所需要的修復(fù)強(qiáng)度也就越強(qiáng)。有意思的是隨著固定時(shí)間的延長，組織中蛋白對(duì)溫度的耐受也相應(yīng)增高（如圖1所示），這可能就是我們對(duì)固定時(shí)間長的標(biāo)本加大修復(fù)強(qiáng)度的理論基礎(chǔ)。固定時(shí)間和變性的關(guān)系這就提醒我們?cè)谧龌仡櫺缘难芯繒r(shí)一定要注意所使用的修復(fù)條件，它與新鮮標(biāo)本的修

10、復(fù)條件一定是有所區(qū)別的，同等條件下一定要加長修復(fù)的時(shí)間或提高修復(fù)所使用的溫度，才可能得到比較滿意的結(jié)果。3、 不同PH值抗原修復(fù)液對(duì)染色結(jié)果的影響抗原熱修復(fù)中所使用的修復(fù)液PH值也會(huì)對(duì)染色結(jié)果產(chǎn)生相當(dāng)大的影響。PH值對(duì)染色結(jié)果的影響大概可以分為以下四種情況。A穩(wěn)定型，PH值對(duì)染色結(jié)果影響不大，如PCNA、AE1、EMA、CD20等。BV型，高PH值和低PH值染色較好，而PH值4-5染色結(jié)果較差，如ER、Ki-67等。C上升型，隨著PH值的增加，染色結(jié)果逐漸增強(qiáng)，如HMB45等。D下降型，隨著PH值的增加染色結(jié)果逐漸減弱，當(dāng)然這種類型的抗體只是個(gè)別的現(xiàn)象，如MOC31。一個(gè)有趣的現(xiàn)象值得注意，即在高PH值都有較好的染色結(jié)果，所以目前比較推崇的抗原修復(fù)液為高PH值得修復(fù)液，如1mMEDTA, PH8.0或PH9.0等。但是由于傳統(tǒng)習(xí)慣，絕大多數(shù)醫(yī)院和實(shí)驗(yàn)室都在使用PH6.0的枸櫞酸緩沖液。綜合以上各種抗體的染色狀況，考慮到臨床工作的實(shí)際情況，許多國外免疫組化專家建議，在常規(guī)的免疫組化工作中，全部選用高PH值得修復(fù)液來代替目前廣為使用的PH6.0枸櫞酸緩沖液。為此，本公司已經(jīng)推出PH8.0和PH9.0的新型抗原修復(fù)液。經(jīng)驗(yàn)證，絕大多數(shù)的抗體使用PH9.0得修復(fù)液效果都要優(yōu)于PH6.0的枸櫞酸，尤其是核陽性的抗體。所以，在常規(guī)的免疫組化工作中，使用