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文檔簡介

1、第4章 酶,什么是酶? 酶是由活細胞產(chǎn)生的、能對特異底物進行高效催化的生物大分子(催化劑),絕大多數(shù)酶的化學本質(zhì)為蛋白質(zhì)。酶是生物催化劑,Enzyme:in yeast enzyme是希臘文 en = in , zyme = yeast,酶催化的生物化學反應,稱為酶促反應 在酶的催化下發(fā)生化學變化的反應物,稱為底物,(Substrate,S),酶及生物催化劑概念的擴展,克隆酶、遺傳修飾酶蛋白質(zhì)工程新酶,生物催化劑 (Biocatalyst),蛋白質(zhì)類: Enzyme,(天然酶、人工酶),核酸類:Ribozyme ; Deoxyribozyme,模擬酶:一類利用有機化學方法合成的比天然酶簡單的非

2、蛋白分子,1. 提高反應速度,不改變平衡點; 2. 只起催化作用,本身不消耗; 3. 降低反應的活化能。,與一般催化劑相同的特點,酶催化作用的特點,活化能(activation energy) 分子從常態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)槿菀装l(fā)生化學反應的活躍狀態(tài)所需要的能量稱為活化能。 酶催化反應的實質(zhì):降低反應的活化能,酶作為生物催化劑的特點,常溫、常壓、中性,1. 反應條件溫和,2. 高效性,3.專一性( Specificity ),解釋酶專一性的三種模型: (1)鎖與鑰匙學說 (2)誘導契合學說 (3)“三點附著”模型,酶的化學本質(zhì)及其組成,據(jù)酶分子組成分類,單純蛋白質(zhì)酶類,結合蛋白質(zhì)酶類,酶蛋白質(zhì),輔助因子,金

3、屬離子 小分子有機物,據(jù)酶蛋白特征分類,單體酶 寡聚酶 多酶復合體,由一條肽鏈組成,由多個亞基以非共價鍵結合組成,單個亞基沒有催化活性。大多為代謝調(diào)節(jié)酶,由幾個獨立的酶組合起來形成復合體,催化連續(xù)的反應,反應效率高,國際系統(tǒng)分類,根據(jù)酶催化的有機化學反應類型,國際生物化學協(xié)會酶學委員會規(guī)定,將酶分為六大類: 1、氧化還原酶: A.2H + B=A + B.2H 2、轉(zhuǎn)移酶: A.X + B=A + B.X 3、水解酶: A-B + H2O=A.H + B.OH 4、裂合酶: A-B=A + B 5、異構酶: A=B 6、連接酶: A + B + ATP=A-B + ADP + Pi,酶活性,酶

4、活性:也就是酶活力(enzyme activity),是指酶催化指定化學反應的能力。 酶促反應速度:單位時間、單位體積中底物的減少量或產(chǎn)物的增加量。(單位:濃度/單位時間) 酶活力單位(U):在一定條件下,一定時間內(nèi)將一定量的底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物所需的酶量 國際單位(IU):在25、測量的最適條件(如pH及底物濃度等)下,1分鐘催化1 mol底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物所需的酶量,稱一個國際單位。,比活力:每mg蛋白含有的酶活單位數(shù) U/mg蛋白質(zhì),酶的比活力(Specific activity),表示酶的純度,比活力= 酶活力(U/mL)/蛋白質(zhì)濃度(mg/mL),酶蛋白純化的一般流程,酶活性部位,活性部位(活

5、性中心):酶分子中結合和催化底物的活性部位,包括底物結合部位、催化部位,過渡態(tài),酸堿催化 共價催化 靠近與定向效應 底物形變和誘導契合,酶的催化機制,酶促反應動力學,酶促反應動力學:主要研究酶催化的反應速度以及影響反應速度的各種因素的科學。 影響酶反應速度的因素有: 底物濃度、酶濃度、溫度、pH值、激活劑、抑制劑等。 在探討各種因素對酶促反應速度的影響時,通常測定其初速度來代表酶促反應速度,即底物轉(zhuǎn)化量5%時的反應速度。,酶濃度對反應速率的影響,(一)底物濃度對反應速度的影響,酶的底物飽合現(xiàn)象中間絡合物學說,酶與底物首先生成一個中間絡合物,然后中間絡合物進一步分解成產(chǎn)物和游離的酶,米氏方程推導

6、設定的3個條件: 反應速率為初速率,因為此時反應速率與酶濃度呈正比關系,避免了反應產(chǎn)物以及其他因素的干擾 酶底物復合物處于穩(wěn)態(tài)即ES濃度不發(fā)生變化 符合質(zhì)量作用定律,(二)酶促反應的動力學方程式,酶反應動力學最簡單的模型由Lenor Michaelis和Maude Menten于1913年提出,因此又名為Michaelis-Menten模型或M-M模型。 1925年,G.E.Briggs和James B.S.Haldane使用穩(wěn)態(tài)近似法(steady-state approximation,SSA)提出一個略為復雜的模型。,S:底物濃度 v:不同S時的反應速度 Vmax:最大反應速度 Km:米

7、氏常數(shù),根據(jù)中間絡合物學說:,1. 米氏方程的推導,k,k,ES形成速度v1= K1 E S ES分解速度v2= (K2 + K3 ) ES,1925年Briggs和Haldame提出了穩(wěn)態(tài)的概念:,所謂穩(wěn)態(tài)是指反應進行一定時間后,ES的生成速度和ES的分解速度相等,此時ES的濃度不再改變,達到恒態(tài),也稱穩(wěn)態(tài)。,K1 E S = (K2 + K3 ) ES,由于E 與ES之和為總的酶濃度Et ,即: Et= E + ES E = Et - ES,將代入:, 酶促反應速度由ES決定,而= K3 ES,當S 升高,所有E為S所飽和時,即:Et = ES,此時達到最大反應速度Vmax:Vmax= K

8、3 Et ,將代入,得米氏方程:,米氏方程的變化:,1. Km S 時: v = Vmax S /Km 初速度與S成正比,一級反應。 2. 若Km S時: v = Vmax v與S無關,零級反應,酶反應速度與S的關系,當 = Vmax2時,,Km:酶促反應速度達最大值一半時的底物濃度。 Km的單位為mol/L。,米氏方程的變化:,(1) Km是酶在一定條件下的特征物理常數(shù),與酶的性質(zhì)有關,與酶的濃度無關。通過測定Km的數(shù)值,可鑒別酶。,2. 米氏常數(shù)(Km)的意義,與pH 、溫度、離子強度、酶及底物種類有關,(2) 不同的酶有不同的Km值;對于同一個酶來說,每一個底物都有一個相應的Km值。,2

9、.米氏常數(shù)(Km)的意義(續(xù)),(3) Km可以推斷某一代謝物在體內(nèi)可能的代謝 途徑,當丙酮酸濃度較低時,代謝走哪條途徑?jīng)Q定于 Km最小的酶。,2.米氏常數(shù)(Km)的意義(續(xù)),(4) 一般情況下,1/Km可以近似地表示酶對底物的親和力大小, 1/Km愈大,表明親和力愈大。(根據(jù)Km可判斷酶的天然底物,Km最小的底物稱該酶的最適底物或天然底物),2.米氏常數(shù)(Km)的意義(續(xù)),在一定的酶濃度下,Vmax是一個常數(shù),它只與底物的種類及反應條件有關。 K3代表酶被底物飽和時,每個酶分子每秒鐘轉(zhuǎn)換底物的分子數(shù),稱為轉(zhuǎn)換數(shù)(TN,或催化常數(shù),kcat) K3( Kcat)值越大,表明酶的催化效率越高

10、。,3. Vmax與K3( Kcat)的意義,Vmax=K3 E,4. Kcat/Km 表示酶的實際催化效率 S/Km=0.01-1.0,SKm 時:,Kcat/Km可以客觀地比較不同的酶或同一種酶催化不同底物的催化效率。,Kcat/Km可以客觀地比較不同的酶或同一種酶催化不同底物的催化效率,5. 米氏常數(shù)的測定,基本原則: 將米氏方程變化成相當于y=ax+b的直線方程,再用作圖法求出Km。,1/V,-1/Km 0 1/S,斜率= Km/ Vmax,1/Vmax,(1)Lineweaver-Burk 雙倒數(shù)作圖法,該作圖法的缺點: 實驗點過分集中在直線的左下方,而低濃度S的實驗點又因倒數(shù)后誤差

11、較大,往往偏離直線較遠。從而影響Km和Vmax的準確測定。,(2)v對 作圖(Eadie-Hofstee法),(3) S/v 對S作圖(Hanes-Woolf法),(4) Eisenthal和Cornish-Bowden直接線性作圖法,抑制作用:使酶的必需基團的化學性質(zhì)改變而降 低酶活性、甚至使酶完全喪失活性的作用; 引起作用物質(zhì)稱為抑制劑 變性作用:由于酶分子的次級鍵(酶分子結構)受到破壞而使酶活性下降或失活。,抑制劑對酶反應的影響,什么是酶的抑制作用?,根據(jù)抑制劑與酶作用方式的不同,能否用透析、超濾等物理方法除去抑制劑,使酶復活,抑制作用的類型,抑制劑與酶非共價鍵結合,抑制作用可通過透析等

12、方法除去。,1. 可逆抑制作用,抑制劑與底物競爭酶的活性中心,從而干擾了酶與底物的結合,使酶的催化活性降低,稱為競爭性抑制作用。,(1)競爭性抑制,磺胺類藥物的抑菌機制: 與對氨基苯甲酸競爭二氫葉酸合成酶,二氫蝶呤啶 對氨基苯甲酸 谷氨酸,對氨基苯甲酸(PABA),競爭性抑制細菌葉酸形成,抑制細菌繁殖,人通過食物直接補充葉酸,對人無毒害。,1939,競爭性抑制作用的動力學,競爭性抑制的速度方程與圖形特征,Km,(2)非競性抑制,抑制劑既可以與酶結合,也可以與ES復合物結合,使酶的催化活性降低,稱為非競爭性抑制。,Noncompetitive inhibition,非競爭性抑制的速度方程與圖形特

13、征,Vmax減小,部分酶始終失活Km不變,親和力不受影響,Vmax,非競爭性抑制劑的化學結構不一定與底物的分子結構類似; 底物和抑制劑分別獨立地與酶的不同部位相結合; 抑制劑對酶與底物的結合無影響,故底物濃度的改變對抑制程度無影響; 動力學參數(shù):Km值不變,Vm值降低。,非競爭性抑制的特點:,抑制劑不能與酶結合,只與ES復合物結合并阻止產(chǎn)物生成,使酶的催化活性降低,稱酶的反競爭性抑制。,(3)反競爭性抑制,反競爭性抑制的速度方程與圖形特征,Km、Vmax都變小,2、不可逆抑制作用: 抑制劑與酶必需基團以共價鍵相連,使酶喪失活性, 不能用透析、超濾等物理方法除去抑制劑,使酶恢復活性,很多為劇毒物

14、質(zhì),如重金屬、有機磷、有機汞、有機砷、氰化物、青霉素、毒鼠強等。,對甲苯磺酰-L-苯丙氨酰氯甲酮(TPCK)與Trypsin底物等對甲苯磺酰-L-賴氨酰甲酯結構相似,(1) 非專一性不可逆抑制劑 重金屬離子 Ag+ 、 Cu2+ 、 Hg2+ 、 Pb2+ 、 Fe3+ 高濃度時可使酶蛋白變性失活; 低濃度時對酶活性產(chǎn)生抑制。 通過加入EDTA解除,有機磷化合物 (二異丙基氟磷酸(DFP)和許多有機磷農(nóng)藥),或,R1、R2 : 烷基; X: -F, -CN等,抑制機理:與蛋白酶及酯酶活性中心Ser-OH形成磷脂鍵。 強烈抑制膽堿脂酶的活性(神經(jīng)毒氣)。,沙林毒氣 甲氟膦酸異丙酯,乙酰膽堿為神經(jīng)遞質(zhì),過度積累使神經(jīng)系統(tǒng)處于過度興奮狀態(tài),引起神經(jīng)中毒癥狀,有機磷化合物中常用的有機磷殺蟲劑,如1605、敵百蟲、敵敵畏、樂果等。,如何緊急救治?,解磷定 置換結合的有機磷化合物, 解除抑制作用,1. 基團特異性抑制劑 這類抑制劑在結構上與底物無相似之處,但能共價修飾酶活性中心上的必需側(cè)鏈基團而導致酶活性不可逆的失活。由于許多氨基酸殘基含有親核側(cè)鏈基團,所以充當基團特異性抑制劑的一般是親電試劑。 2. 底物類似物抑制劑 這類抑制劑在結構上相

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