生物化學課件：6 酶

1、第4章 酶,什么是酶？ 酶是由活細胞產(chǎn)生的、能對特異底物進行高效催化的生物大分子（催化劑），絕大多數(shù)酶的化學本質(zhì)為蛋白質(zhì)。酶是生物催化劑,Enzyme：in yeast enzyme是希臘文 en = in ， zyme = yeast,酶催化的生物化學反應，稱為酶促反應 在酶的催化下發(fā)生化學變化的反應物，稱為底物，（Substrate，S）,酶及生物催化劑概念的擴展,克隆酶、遺傳修飾酶蛋白質(zhì)工程新酶,生物催化劑 （Biocatalyst）,蛋白質(zhì)類： Enzyme,(天然酶、人工酶),核酸類：Ribozyme ; Deoxyribozyme,模擬酶：一類利用有機化學方法合成的比天然酶簡單的非

2、蛋白分子,1. 提高反應速度，不改變平衡點; 2. 只起催化作用，本身不消耗； 3. 降低反應的活化能。,與一般催化劑相同的特點,酶催化作用的特點,活化能(activation energy) 分子從常態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)槿菀装l(fā)生化學反應的活躍狀態(tài)所需要的能量稱為活化能。 酶催化反應的實質(zhì)：降低反應的活化能,酶作為生物催化劑的特點,常溫、常壓、中性,1. 反應條件溫和,2. 高效性,3.專一性（ Specificity ）,解釋酶專一性的三種模型： （1）鎖與鑰匙學說 （2）誘導契合學說 （3）“三點附著”模型,酶的化學本質(zhì)及其組成,據(jù)酶分子組成分類,單純蛋白質(zhì)酶類,結合蛋白質(zhì)酶類,酶蛋白質(zhì),輔助因子,金

3、屬離子 小分子有機物,據(jù)酶蛋白特征分類,單體酶 寡聚酶 多酶復合體,由一條肽鏈組成,由多個亞基以非共價鍵結合組成，單個亞基沒有催化活性。大多為代謝調(diào)節(jié)酶,由幾個獨立的酶組合起來形成復合體，催化連續(xù)的反應，反應效率高,國際系統(tǒng)分類,根據(jù)酶催化的有機化學反應類型，國際生物化學協(xié)會酶學委員會規(guī)定，將酶分為六大類： 1、氧化還原酶: A.2H + B=A + B.2H 2、轉(zhuǎn)移酶: A.X + B=A + B.X 3、水解酶: A-B + H2O=A.H + B.OH 4、裂合酶: A-B=A + B 5、異構酶: A=B 6、連接酶: A + B + ATP=A-B + ADP + Pi,酶活性,酶

4、活性：也就是酶活力(enzyme activity)，是指酶催化指定化學反應的能力。 酶促反應速度：單位時間、單位體積中底物的減少量或產(chǎn)物的增加量。（單位：濃度/單位時間） 酶活力單位（U）：在一定條件下，一定時間內(nèi)將一定量的底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物所需的酶量 國際單位（IU）：在25、測量的最適條件（如pH及底物濃度等）下，1分鐘催化1 mol底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物所需的酶量，稱一個國際單位。,比活力：每mg蛋白含有的酶活單位數(shù) U/mg蛋白質(zhì),酶的比活力（Specific activity）,表示酶的純度,比活力= 酶活力（U/mL）/蛋白質(zhì)濃度（mg/mL）,酶蛋白純化的一般流程,酶活性部位,活性部位（活

5、性中心）：酶分子中結合和催化底物的活性部位，包括底物結合部位、催化部位,過渡態(tài),酸堿催化 共價催化 靠近與定向效應 底物形變和誘導契合,酶的催化機制,酶促反應動力學,酶促反應動力學：主要研究酶催化的反應速度以及影響反應速度的各種因素的科學。 影響酶反應速度的因素有： 底物濃度、酶濃度、溫度、pH值、激活劑、抑制劑等。 在探討各種因素對酶促反應速度的影響時，通常測定其初速度來代表酶促反應速度，即底物轉(zhuǎn)化量5%時的反應速度。,酶濃度對反應速率的影響,（一）底物濃度對反應速度的影響,酶的底物飽合現(xiàn)象中間絡合物學說,酶與底物首先生成一個中間絡合物，然后中間絡合物進一步分解成產(chǎn)物和游離的酶,米氏方程推導

6、設定的3個條件： 反應速率為初速率，因為此時反應速率與酶濃度呈正比關系，避免了反應產(chǎn)物以及其他因素的干擾 酶底物復合物處于穩(wěn)態(tài)即ES濃度不發(fā)生變化 符合質(zhì)量作用定律,（二）酶促反應的動力學方程式,酶反應動力學最簡單的模型由Lenor Michaelis和Maude Menten于1913年提出，因此又名為Michaelis-Menten模型或M-M模型。 1925年，G.E.Briggs和James B.S.Haldane使用穩(wěn)態(tài)近似法（steady-state approximation，SSA）提出一個略為復雜的模型。,S：底物濃度 v：不同S時的反應速度 Vmax：最大反應速度 Km：米

7、氏常數(shù),根據(jù)中間絡合物學說：,1. 米氏方程的推導,k,k,ES形成速度v1= K1 E S ES分解速度v2= (K2 + K3 ) ES,1925年Briggs和Haldame提出了穩(wěn)態(tài)的概念：,所謂穩(wěn)態(tài)是指反應進行一定時間后，ES的生成速度和ES的分解速度相等，此時ES的濃度不再改變，達到恒態(tài)，也稱穩(wěn)態(tài)。,K1 E S = (K2 + K3 ) ES,由于E 與ES之和為總的酶濃度Et ,即: Et= E + ES E = Et - ES,將代入:, 酶促反應速度由ES決定，而= K3 ES,當S 升高,所有E為S所飽和時,即：Et = ES,此時達到最大反應速度Vmax：Vmax= K

8、3 Et ,將代入，得米氏方程:,米氏方程的變化：,1. Km S 時： v = Vmax S /Km 初速度與S成正比，一級反應。 2. 若Km S時： v = Vmax v與S無關，零級反應,酶反應速度與S的關系,當 = Vmax2時，,Km：酶促反應速度達最大值一半時的底物濃度。 Km的單位為mol/L。,米氏方程的變化：,（1） Km是酶在一定條件下的特征物理常數(shù)，與酶的性質(zhì)有關，與酶的濃度無關。通過測定Km的數(shù)值，可鑒別酶。,2. 米氏常數(shù)（Km）的意義,與pH 、溫度、離子強度、酶及底物種類有關,（2） 不同的酶有不同的Km值；對于同一個酶來說，每一個底物都有一個相應的Km值。,2

9、.米氏常數(shù)（Km）的意義（續(xù)）,（3） Km可以推斷某一代謝物在體內(nèi)可能的代謝 途徑,當丙酮酸濃度較低時，代謝走哪條途徑?jīng)Q定于 Km最小的酶。,2.米氏常數(shù)（Km）的意義（續(xù)）,（4） 一般情況下，1/Km可以近似地表示酶對底物的親和力大小， 1/Km愈大，表明親和力愈大。（根據(jù)Km可判斷酶的天然底物，Km最小的底物稱該酶的最適底物或天然底物）,2.米氏常數(shù)（Km）的意義（續(xù)）,在一定的酶濃度下，Vmax是一個常數(shù)，它只與底物的種類及反應條件有關。 K3代表酶被底物飽和時，每個酶分子每秒鐘轉(zhuǎn)換底物的分子數(shù)，稱為轉(zhuǎn)換數(shù)（TN，或催化常數(shù)，kcat） K3（ Kcat）值越大，表明酶的催化效率越高

10、。,3. Vmax與K3（ Kcat）的意義,Vmax=K3 E,4. Kcat/Km 表示酶的實際催化效率 S/Km=0.01-1.0,SKm 時：,Kcat/Km可以客觀地比較不同的酶或同一種酶催化不同底物的催化效率。,Kcat/Km可以客觀地比較不同的酶或同一種酶催化不同底物的催化效率,5. 米氏常數(shù)的測定,基本原則： 將米氏方程變化成相當于y=ax+b的直線方程，再用作圖法求出Km。,1/V,-1/Km 0 1/S,斜率= Km/ Vmax,1/Vmax,（1）Lineweaver-Burk 雙倒數(shù)作圖法,該作圖法的缺點： 實驗點過分集中在直線的左下方，而低濃度S的實驗點又因倒數(shù)后誤差

11、較大，往往偏離直線較遠。從而影響Km和Vmax的準確測定。,（2）v對 作圖（Eadie-Hofstee法）,（3） S/v 對S作圖（Hanes-Woolf法）,（4） Eisenthal和Cornish-Bowden直接線性作圖法,抑制作用：使酶的必需基團的化學性質(zhì)改變而降 低酶活性、甚至使酶完全喪失活性的作用； 引起作用物質(zhì)稱為抑制劑 變性作用：由于酶分子的次級鍵（酶分子結構）受到破壞而使酶活性下降或失活。,抑制劑對酶反應的影響,什么是酶的抑制作用？,根據(jù)抑制劑與酶作用方式的不同,能否用透析、超濾等物理方法除去抑制劑，使酶復活,抑制作用的類型,抑制劑與酶非共價鍵結合，抑制作用可通過透析等

12、方法除去。,1. 可逆抑制作用,抑制劑與底物競爭酶的活性中心，從而干擾了酶與底物的結合，使酶的催化活性降低，稱為競爭性抑制作用。,（1）競爭性抑制,磺胺類藥物的抑菌機制： 與對氨基苯甲酸競爭二氫葉酸合成酶,二氫蝶呤啶 對氨基苯甲酸 谷氨酸,對氨基苯甲酸(PABA),競爭性抑制細菌葉酸形成，抑制細菌繁殖，人通過食物直接補充葉酸，對人無毒害。,1939,競爭性抑制作用的動力學,競爭性抑制的速度方程與圖形特征,Km,（2）非競性抑制,抑制劑既可以與酶結合，也可以與ES復合物結合，使酶的催化活性降低，稱為非競爭性抑制。,Noncompetitive inhibition,非競爭性抑制的速度方程與圖形特

13、征,Vmax減小，部分酶始終失活Km不變，親和力不受影響,Vmax,非競爭性抑制劑的化學結構不一定與底物的分子結構類似； 底物和抑制劑分別獨立地與酶的不同部位相結合； 抑制劑對酶與底物的結合無影響，故底物濃度的改變對抑制程度無影響； 動力學參數(shù)：Km值不變，Vm值降低。,非競爭性抑制的特點：,抑制劑不能與酶結合，只與ES復合物結合并阻止產(chǎn)物生成，使酶的催化活性降低，稱酶的反競爭性抑制。,（3）反競爭性抑制,反競爭性抑制的速度方程與圖形特征,Km、Vmax都變小,2、不可逆抑制作用： 抑制劑與酶必需基團以共價鍵相連，使酶喪失活性, 不能用透析、超濾等物理方法除去抑制劑，使酶恢復活性,很多為劇毒物

14、質(zhì)，如重金屬、有機磷、有機汞、有機砷、氰化物、青霉素、毒鼠強等。,對甲苯磺酰-L-苯丙氨酰氯甲酮（TPCK）與Trypsin底物等對甲苯磺酰-L-賴氨酰甲酯結構相似,（1） 非專一性不可逆抑制劑 重金屬離子 Ag+ 、 Cu2+ 、 Hg2+ 、 Pb2+ 、 Fe3+ 高濃度時可使酶蛋白變性失活； 低濃度時對酶活性產(chǎn)生抑制。 通過加入EDTA解除,有機磷化合物 （二異丙基氟磷酸（DFP）和許多有機磷農(nóng)藥）,或,R1、R2 : 烷基； X: -F, -CN等,抑制機理：與蛋白酶及酯酶活性中心Ser-OH形成磷脂鍵。 強烈抑制膽堿脂酶的活性（神經(jīng)毒氣）。,沙林毒氣 甲氟膦酸異丙酯,乙酰膽堿為神經(jīng)遞質(zhì)，過度積累使神經(jīng)系統(tǒng)處于過度興奮狀態(tài)，引起神經(jīng)中毒癥狀,有機磷化合物中常用的有機磷殺蟲劑，如1605、敵百蟲、敵敵畏、樂果等。,如何緊急救治？,解磷定 置換結合的有機磷化合物， 解除抑制作用,1. 基團特異性抑制劑 這類抑制劑在結構上與底物無相似之處，但能共價修飾酶活性中心上的必需側(cè)鏈基團而導致酶活性不可逆的失活。由于許多氨基酸殘基含有親核側(cè)鏈基團，所以充當基團特異性抑制劑的一般是親電試劑。 2. 底物類似物抑制劑 這類抑制劑在結構上相