pcr聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)課件

1、第一章 PCR技術(shù)原理,定義： PCR技術(shù)又稱聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction)，是通過模擬體內(nèi) DNA 復(fù)制的 方式，在體外選擇性地將 DNA 某個特殊區(qū)域擴 增出來的技術(shù)。,PCR技術(shù):,PCR概念的提出,1971年，美國麻省理工(MIT)教授、1968年諾貝爾醫(yī)學(xué)獎得主Khorana提出“經(jīng)過DNA變性，與合適引物雜交，用DNA聚合酶延伸引物，并不斷重復(fù)該過程便可克隆tRNA基因”。 1983，Kary Mullis 1993年獲得諾貝爾獎,引物,引物,Mullis的構(gòu)思,DNA聚合酶,DNA聚合酶,技術(shù)難點,Mullis最初使用的DNA聚合酶是大腸桿菌

2、 DNA 聚合酶 I 的Klenow片段。不耐高溫。,thermus aquaticus,Taq DNA聚合酶的發(fā)現(xiàn),1988年Saiki 等從溫泉（Hotspring）中分離的一株水生嗜熱桿菌(thermus aquaticus) 中提取到一種耐熱DNA聚合酶。,耐高溫， 在熱變性時不會被鈍化，不必在每次擴增反應(yīng)后再加新酶。 大大提高了擴增片段特異性和擴增效率，增加了擴增長度(2.0Kb)。 酶命名為Taq DNA多聚酶(Taq DNA Polymerase)。此酶的發(fā)現(xiàn)使被PCR廣泛應(yīng)用。 在1989年，Science將PCR中的Taq DNA多聚酶命 名為當(dāng)年的風(fēng)云分子(Molecule

3、oftheyear),Taq DNA聚合酶優(yōu)點,1、PCR技術(shù)的基本原理,在微量離心管中,加入適量的緩沖液, 微量的模板DNA,四種脫氧單核苷酸,耐熱性多聚酶, 一對合成DNA的引物,通過高溫變性、低溫退火和中溫延伸三個階段為一個循環(huán)的反應(yīng)過程,每一次循環(huán)使特異區(qū)段的基因拷貝數(shù)放大一倍,一般樣品是經(jīng)過30次循環(huán),最終使基因放大了數(shù)百萬倍; 擴增了特異區(qū)段的DNA帶。,PCR技術(shù)的基本原理和工作方式,模板DNA,2.PCR工作方式,PCR的基本原理,PCR反應(yīng)條件 PCR過程 PCR的特點,引物1,引物2,PCR的基本原理,PCR反應(yīng)條件 PCR過程 PCR的特點,引物1,引物2,Taq酶,Ta

4、q酶,PCR的基本原理,PCR反應(yīng)條件 PCR過程 PCR的特點,第1輪結(jié)束,第2輪開始,PCR的基本原理,PCR反應(yīng)條件 PCR過程 PCR的特點,Taq,Taq,Taq,Taq,PCR的基本原理,PCR反應(yīng)條件 PCR過程 PCR的特點,第2輪結(jié)束,PCR的基本原理,PCR反應(yīng)條件 PCR過程 PCR的特點,模板DNA,第1輪擴增,第2輪擴增,第3輪擴增,第4輪擴增,第5輪擴增,第6輪擴增,3.PCR基本材料,模板：單鏈或雙鏈DNA 引物：16-30 bp合成的寡核苷酸 DNA聚合酶：耐熱的DNA聚合酶 底物：四種脫氧三磷酸核苷 （dNTP: dATP、dTTP、dCTP、dGTP) Mg

5、2+： DNA聚合酶的激活劑,4.PCR反應(yīng)程序,9496 30-3 預(yù)變性（使模板DNA充分變性） 94 30 變性 50-60 30-1 復(fù)性（使引物與模板充分退火） 72 n(按1擴增1kb計算）延伸 72 3-7 總的延伸（使產(chǎn)物延伸完整） 4-10 保存,5.PCR要素解析,1）復(fù)性和延伸溫度 復(fù)性的溫度是 PCR 擴增是否順利的關(guān)鍵因素，通常在 50-60 之間。具體的溫度主要由引物的 Tm 值決定（低于Tm 值2-3 ）。 延伸溫度絕大多數(shù)設(shè)定為 72 。如果復(fù)性的溫度很高，可以將延伸溫度和復(fù)性溫度設(shè)置成同一溫度，變成二步法 PCR 。 2）反應(yīng)時間 變性一般使用 30 秒鐘，如

6、果模板的 G+C 含量較高，或直接用細(xì)胞做模板，變性時間可適當(dāng)延長。 復(fù)性時間有 30 秒種一般是足夠的。 延伸時間由擴增產(chǎn)物的大小決定，一般采用 1kb 用 1 分鐘來保證充足的時間。,5.PCR要素解析,3）循環(huán)次數(shù) 循環(huán)次數(shù)主要與模板的起始數(shù)量有關(guān)，循環(huán)數(shù)通常為 2535 次。 平臺效應(yīng)（plateau effect）：PCR 擴增過程后期出現(xiàn)的產(chǎn)物的積累按減弱的指數(shù)速率增長的現(xiàn)象。 原因：底物和引物的濃度已經(jīng)降低，dNTP 和 DNA 聚合酶的穩(wěn)定性或活性降低 ，產(chǎn)生的焦磷酸會出現(xiàn)末端產(chǎn)物抑制作用，非特異性產(chǎn)物或引物的二聚體出現(xiàn)非特異性競爭作用，擴增產(chǎn)物自身復(fù)性，高濃度擴增產(chǎn)物變性不徹

7、底。,5.PCR要素解析,4）PCR 反應(yīng)液的配制順序 最后加入 DNA 聚合酶。 早期的 PCR 儀沒有帶加熱的蓋子，要求在反應(yīng)液上覆蓋一層礦物油，防止水分蒸發(fā)。 熱啟動（hot start）PCR操作方式可較好解決非特異性擴增的問題。,5.PCR要素解析,5）各種成分濃度作用： 緩沖液：提供合適的PH值和DNA聚合酶的激活劑 10mM TrisHCl （ pH8.3-9.0），1.5mM MgCl2， 50mM K+ dNTP（底物）：等摩爾濃度的 4 種 dNTP（即 dATP、 dTTP、dCTP和dGTP）， 終濃度一般為 200mM（即飽和濃度）， dNTP 的濃度會影響擴增的產(chǎn)量

8、、特異性和忠實性。 引物： 1M/L,5.PCR要素解析,模板：單、雙鏈DNA均可。 模板的數(shù)量會直接影響擴增的效果。模板濃度過 高會導(dǎo)致反應(yīng)的非特異性增加。 DNA聚合酶： 最常用的是Taq DNA聚合酶，最適反應(yīng)溫度72。 Pfu DNA聚合酶：是目前使用最廣泛的具有 3-5 外切活性的 PCR 酶，目前為止錯配率最低的高溫DNA聚合酶。 酶量增加使反應(yīng)特異性下降;酶量過少影響反應(yīng)產(chǎn)量。, 長度：至少 16bp ，通常為 18-25bp。更短的引物一般會降低擴增的特異性，但會提高擴增的有效性 引物的解鏈溫度：兩個引物之間的 Tm 值差異最好在 2-5 。 對于小于 20 個堿基的引物其 T

9、m 值可用簡易公式計算，即 Tm=4（G+C）+2（A+T）。 避免引物內(nèi)部或引物之間形成引物二聚體（特別是引物的 3端）。 G+C 含量：盡量控制在 40% 至 60% 之間， 4 種堿基的分布應(yīng) 盡可能均勻。盡量避免嘌呤或嘧啶的連續(xù)排列，以及 T 在 3 末 端的重復(fù)排列。 引物的 3 末端最好是 G 或 C ，但不要 GC 連排。,5.PCR要素解析：引物設(shè)計,6. PCR技術(shù)特點,1）高度的靈敏性,引物的序列及其與模板結(jié)合的特異性是決定PCR反應(yīng)結(jié)果的關(guān)鍵。 引物設(shè)計的最大原則是最大限度地提高擴增效率和特異性；同時盡可能減少非特異性擴增。,6. PCR技術(shù)特點,1）特異性,3）操作簡便

10、易行 PCR擴增法,只需要數(shù)小時,就可以用電泳法檢出1g基因組DNA中僅含數(shù)個拷貝的模板序列。,6. PCR技術(shù)特點,4 ）用途廣泛,生命學(xué)科 醫(yī)學(xué)工程 遺傳工程 疾病診斷 法醫(yī)學(xué) 考古學(xué),6. PCR技術(shù)特點,1、2Taq PCR MasterMix 2、DNA模板 3、引物：,本次實驗所用材料,PCR反應(yīng)體系,PCR反應(yīng)程序,瓊脂糖凝膠電泳,瓊脂糖凝膠電泳是用瓊脂糖作支持介質(zhì)的一種電泳方法。其分析原理與其他支持物電泳最主要區(qū)別是：它兼有“分子篩”和“電泳”的雙重作用。,瓊脂糖,瓊脂糖凝膠具有網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，物質(zhì)分子通過時會受到阻力，大分子物質(zhì)在涌動時受到的阻力大，因此在凝膠電泳中，帶電顆粒的分離

11、不僅取決于凈電荷的性質(zhì)和數(shù)量，而且還取決于分子大小，這就大大提高了分辨能力。但由于其孔徑相當(dāng)大，對大多數(shù)蛋白質(zhì)來說其分子篩效應(yīng)微不足道，現(xiàn)廣泛應(yīng)用于核酸的研究中,電荷效應(yīng),瓊脂糖凝膠具有網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，物質(zhì)分子通過時會受到阻力，大分子物質(zhì)在涌動時受到的阻力大，因此在凝膠電泳中，帶電顆粒的分離不僅取決于凈電荷的性質(zhì)和數(shù)量，而且還取決于分子大小，這就大大提高了分辨能力。但由于其孔徑相當(dāng)大，對大多數(shù)蛋白質(zhì)來說其分子篩效應(yīng)微不足道，現(xiàn)廣泛應(yīng)用于核酸的研究中,分子篩效應(yīng),DNA分子在瓊脂糖凝膠中泳動時有電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)。DNA分子在高于等電點的pH溶液中帶負(fù)電荷，在電場中向正極移動。由于糖-磷酸骨架在結(jié)構(gòu)

12、上的重復(fù)性質(zhì)，相同數(shù)量的雙鏈DNA幾乎具有等量的凈電荷，因此它們能以同樣的速率向正極方向移動。,線狀DNA片段分離的有效范圍與瓊脂糖凝膠濃度關(guān)系,實驗材料,【材料】 1. 瓊脂糖 2. 10mg/ml EB 3. marker 4. TAE,實驗步驟,【步驟】 1、稱1.5g瓊脂糖，加100ml電泳緩沖液（1TAE）加熱熔化。 2、膠液冷卻至60時，加入4l EB，小心混勻，緩慢倒入制膠模具中，在膠一端插上梳子。 3、待膠凝固后，撥出梳子，將模具置于水平電泳槽中，加入1TAE，讓液面高于膠面至少1mm。 4、上樣。 5、接通電泳儀電源，1-5V/cm電壓（一般80100V），開始電泳。 6、根

13、據(jù)指示劑遷移位置，判斷是否終止電泳。切斷電源后，取出凝膠，使用凝膠成像儀進(jìn)行觀察或拍照。,瓊脂糖凝膠電泳DNA回收,實驗原理,離心吸附柱純化DNA的原理就是在離心吸附柱內(nèi)使用一種特殊的硅基質(zhì)濾膜，這種濾膜在低PH值、高濃度鹽（鹽酸胍，NaI, NaClO4等）存在的條件下，可以選擇性吸附DNA片段，而蛋白質(zhì)和其它雜質(zhì)不會被吸附。再通過一系列漂洗、離心等步驟將殘留的引物、核苷酸、蛋白質(zhì)等雜質(zhì)去除。最后用低鹽、高PH值的洗脫緩沖液將純凈的DNA從濾膜上洗脫下來。 利用硅基質(zhì)膜的過濾吸附操作，大大簡化了核酸純化過程，提供了一種快速、高通量的純化方式。除單管離心柱外，已經(jīng)有96孔板、384孔板等核酸純化產(chǎn)品。 目前，硅基質(zhì)膜吸附法已經(jīng)成為目前核酸分離純化最主流的技術(shù)。通過該技術(shù)純化的DNA片段可直接用于的酶切、連接、測序、標(biāo)記和雜交等各種常規(guī)分子生物學(xué)操作。,試劑盒組成及儲存方法,實驗步驟,注意事項,切