組織學(xué)技術(shù)(特殊染色)

1、,授課人：韓伊林,組織學(xué)技術(shù)（特殊染色）,特殊染色用于顯示標(biāo)本中的一些結(jié)構(gòu)， 使其在顯微鏡下與其它組織或細(xì)胞區(qū)別.,特殊染色,單一特殊染色,復(fù)合特殊染色,一種染料對(duì)一種組織結(jié)構(gòu)或細(xì)胞進(jìn)行染色,多種染料對(duì)多種組織結(jié)構(gòu)或細(xì)胞進(jìn)行染色,糖原染色方法： 糖原為細(xì)胞內(nèi)的多糖或粘多糖， 肝細(xì)胞和肌細(xì)胞內(nèi)的糖原最多。 糖原的多少，可以反映機(jī)體糖代謝的情況。 例如： 先天性糖代謝紊亂-葡萄糖-6-磷酸酶缺乏、 淋巴肉瘤、間皮瘤、腎上腺瘤，肝細(xì)胞內(nèi) 都可聚集過多的糖原。, 過碘酸-雪夫反應(yīng) （periodic acid Schiff reaction， PAS) 原理： 用過碘酸氧化多糖結(jié)構(gòu)的碳鍵， 使其形成2

2、-醛基，與無色的品紅結(jié)合生成 紫紅色品紅復(fù)合物，沉淀于細(xì)胞內(nèi)糖原分布部位， 從而可證明多糖或粘多糖的存在。,1、試劑配制 （1）1%過碘酸水溶液： 過碘酸 1g 雙蒸水 100ml 將過碘酸溶于雙蒸水中,（2）Schiff試劑： 雙蒸水 200ml 堿性品紅 1g 1mol/L 鹽酸 20ml 偏重亞硫酸鈉 2g （或亞硫酸氫鈉） 活性炭 300mg, 雙蒸水煮沸后離火，慢慢加入品紅， 攪拌至完全溶解，冷卻至50時(shí)過濾， 加入鹽酸，冷卻至25時(shí)加入偏重亞硫酸鈉 搖蕩，密封置于暗處或4冰箱內(nèi)24h 。 溶液呈草黃色時(shí)，加入活性炭搖蕩1min 快速過濾。避光4保存?zhèn)溆谩?(3)亞硫酸氫納溶液 10

3、%偏重亞硫酸氫納 5ml 1mol/L鹽酸 5ml 蒸餾水 90ml 用前配制,(4)1mol/L鹽酸 36%鹽酸 85.6ml 蒸餾水 914.4ml,2、染色步驟,（1) 切片入1%過碘酸液 氧化2-5 min。 充分水洗后，過蒸餾水。 （2）入Schiff 液10-20 min（室溫 暗處） （3）入亞硫酸氫納液洗3次每次2min （去非特異性染色）流水沖洗10min， 過蒸餾水。 （4)Mayer蘇木精復(fù)染2-3min。流水沖洗， 過蒸餾水，吸干。 從95%乙醇開始脫水、透明、封片。,3、對(duì)照,用1%淀粉糖化酶處理對(duì)照片20 min.或用唾液 （無氣泡）消化對(duì)照片30 min 2次。,

4、4、結(jié)果,細(xì)胞內(nèi)糖原呈紫紅色；對(duì)照片為陰性,5、注意事項(xiàng)： （1）糖原易溶于水，要用冷Carnoy液固定 （2）配制Schiff試劑堿性品紅雜質(zhì)太多， 或亞硫酸氫納潮解，都不能使堿性品紅脫色； 盛Schiff試劑的瓶子不宜過大，以免SO2逸出； 若Schiff試劑變成粉紅色即失效。,Carnoy固定液: 取純乙醇、氯仿、冰醋酸，按6:3:1的比例配制， 現(xiàn)配現(xiàn)用。一般固定1-2 h。固定后的組織塊 可直接入95%的乙醇脫水。,疏松結(jié)締組織各種成分顯示方法： 疏松結(jié)締組織中含有： 膠原纖維、彈性纖維、網(wǎng)狀纖維； 巨噬細(xì)胞、肥大細(xì)胞。,一、 網(wǎng)狀纖維 分布：肝、腎、脾、淋巴結(jié)等器官內(nèi)。 纖維直徑0

5、.2-2.0m，分支多，交織成網(wǎng)。 網(wǎng)狀纖維主要由型膠原蛋白組成，表面被覆糖蛋白，在鍍銀切片呈黑色稱為嗜銀纖維。,Gomoris鍍銀法顯示網(wǎng)狀纖維 1、取材：淋巴結(jié) 2、試劑配制 （1）硝酸銀溶液： 硝酸銀 10.2g，溶于100ml蒸餾水。 （2）氫氧化鈉溶液： 氫氧化鈉 3.1g，溶于100ml蒸餾水。,（3）銀氨溶液的配置： 取5ml 硝酸銀溶液， 緩慢滴加氨水至溶液變得清亮； 再加入5ml氫氧化鈉溶液， 此時(shí)溶液變黑色再滴加氨水至溶液清亮后， 補(bǔ)加4滴氨水，加蒸餾水稀釋至100ml， 保存于棕色瓶中備用。,（4）高錳酸鉀溶液：高錳酸鉀0.5g， 蒸餾水95ml，3%硫酸5ml （5）氯

6、化金溶液：氯化金 0.2g， 蒸餾水100ml （6）草酸溶液：草酸2ml，蒸餾水98ml （7）硫酸鐵溶液：硫酸鐵2g， 蒸餾水100ml （8）甲醛溶液：甲醛20ml， 蒸餾水80ml,3、染色程序 （1）新鮮組織10%甲醛固定，石蠟切片， 常規(guī)脫蠟入水； （2）入高錳酸鉀溶液中5min，水洗1min； （3）入草酸溶液中漂白2min，水洗2min； （4）硫酸鐵中媒染2min，水洗1min；,（5）銀氨溶液中處理1-5min（25 ）， 蒸餾水洗2次，各2min； （6）甲醛溶液中還原5min， 蒸餾水洗2次，各2min； （7）氯化金溶中調(diào)色1-3min，蒸餾水洗2次； （8）95%及

7、無水乙醇脫水， 二甲苯透明，中性樹膠封片。,4、結(jié)果 淋巴結(jié)內(nèi)可見黑色網(wǎng)狀纖維， 粗細(xì)不等，交織成網(wǎng)。 5、注意事項(xiàng) 配制氨銀時(shí)氨液不可過多。,二、彈性纖維 分布廣泛，彈性纖維較細(xì)，直徑0.2-1.0m， 交織成網(wǎng)。富有彈性，與膠原纖維交織在一起。 彈性纖維核心部分由均質(zhì)的彈性蛋白組成； 外周覆蓋微原纖維。 在皮膚學(xué)和檢測(cè)幼年機(jī)體組織中的彈性結(jié)構(gòu)。 常用的顯示彈性纖維的染色有： 地衣紅染色、 Gomoris醛品紅染色、 Weigert染色等。,地衣紅染色顯示彈性纖維 1、取材 皮下組織 2、染液配制 地衣紅染液： 地衣紅0.1g ，70%乙醇100ml，硝酸2ml。 3、染色程序 （1）石蠟切

8、片脫蠟下行至70%乙醇。 （2）地衣紅染液，室溫，12h或過夜，或37,15-30min. （3）70%乙醇分色，必要時(shí)可用0.5%-1%鹽酸乙醇分色， 去除膠原纖維顏色。 （4）常規(guī)乙醇脫水，二甲苯透明，樹膠封片。 4、結(jié)果 彈性纖維為棕紅色，背景淡棕色。,三、膠原纖維 膠原纖維，粗細(xì)不等，直徑0.5-10m，波浪狀，有分支交織成網(wǎng)。膠原纖維由型膠原蛋白組成。膠原纖維對(duì)酸性染料的親和力強(qiáng)， 如常用的酸性復(fù)紅及苯胺藍(lán)等，對(duì)膠原纖維有選染性，而其它組織不易著色，從而有利于其他組織的復(fù)染。 顯示膠原纖維的主要方法： 如van Gieson法、 Mallory法、 Masson法等。,Masson

9、s三色染色法顯示膠原纖維 1、取材：皮下組織或腸系膜鋪片 2、固定：ZenkerBouin 10%中性福爾馬林緩沖液 3、染液配制 （1）Weigert鐵蘇木精 A液：蘇木精 10g, 95%乙醇100ml B液：29%三氯化鐵水溶液 4ml 25%鹽酸 1ml 蒸餾水 95ml 用時(shí)甲乙兩液等份混合，只能用數(shù)天。,（2）Masson 酸性復(fù)紅染液： 酸性復(fù)紅1g，冰醋酸 1ml，蒸餾水 99ml。 （3）磷鉬酸-磷鎢酸水溶液： 磷鉬酸 2.5g，磷鎢酸2.5g，蒸餾水 100ml。 （4）苯胺藍(lán)染液： 苯胺藍(lán) 2.5g，冰醋酸 2ml，蒸餾水 100ml。 （5）1%醋酸水溶液： 冰醋酸 1

10、ml ，蒸餾水 99ml。,4、染色步驟 （1）石蠟切片脫蠟下行至蒸餾水。 （2）Weigert 鐵蘇木精染色，10-20min。 （3）流水沖洗，10min，光鏡下查看。也可用 1%鹽酸乙醇（70%）分色。流水沖洗，5min， 蒸餾水浸洗。,（4）Masson 酸性復(fù)紅染液，15min，蒸餾水洗。 （5）磷鉬酸-磷鎢酸水溶液分色，10-15min， 或至膠原纖維無紅色。 （6）苯胺藍(lán)染液，10-20min，蒸餾水洗。 （7） 1%醋酸水溶液分色，3-5min。鏡下查看分色程度。 （8）95%乙醇脫水上行，二甲苯透明，樹膠封固。,5、結(jié)果： 膠原纖維為藍(lán)色；肌纖維為紅色，細(xì)胞核為黑色。 6、注

11、意事項(xiàng)： 標(biāo)本為10%福爾馬林固定，切片染色前需用 Bouin再固定，56 固定1h，或室溫過夜。,伊紅-醛復(fù)紅染色法 同時(shí)顯示膠原纖維和彈性纖維 Gomori氏醛-復(fù)紅染液是Gomori在試驗(yàn)期間偶然 發(fā)現(xiàn)的由堿性品紅、三聚乙醛、濃鹽酸配制而成。 一、試劑配制 Gomori醛-復(fù)紅染液： 70%乙醇100ml，堿性品紅0.5g， 三聚乙醛1ml，濃鹽酸1ml。 注意：先將堿性品紅溶于乙醇中， 然后加入三聚乙醛和濃鹽酸，靜置1-2d， 待溶液變?yōu)樯钭仙?，過濾置于冰箱待用。,三、制作過程 1、取皮下組織鋪于干凈的載玻片上，自然晾干。 2、放在甲醛-乙醇固定液內(nèi)固定5min； 3、水洗3min；

12、 4、置于醛-復(fù)紅染液中，室溫下染色5min； 5、水洗5min； 6、置伊紅染液中，染色30s； 7、常規(guī)脫水、透明、封片。 四、結(jié)果 膠原纖維為紅色，長(zhǎng)帶狀，波浪狀走行； 彈性纖維為紫色，細(xì)絲狀，直行，末端卷曲。,二、取材 皮下組織,甲苯胺藍(lán)染色顯示肥大細(xì)胞 肥大細(xì)胞內(nèi)含粗大的嗜堿性、異染性的水溶性顆粒， 顆粒內(nèi)含有組胺、肝素等活性物質(zhì)， 這些物質(zhì)含有高分子的多硫酸脂和硫酸黏多糖類，能夠與 甲苯胺藍(lán)、美籃、中性紅、硫堇等染料結(jié)合。,1、取材 皮下組織 2、固定 Carnoy液 或 10%中性福爾馬林液 皮下組織鋪于干凈的載玻片上，自然晾干后固定， 或石蠟切片，冰凍切片更好 3、染液配制 甲

13、苯胺藍(lán)溶液：甲苯胺藍(lán)0.2g 60%乙醇100ml 混勻即可反復(fù)使用。,4、染色過程 （1）石蠟切片脫蠟下行至蒸餾水； （2）入甲苯胺藍(lán)溶液染色，室溫10-30min； （3）蒸餾水洗； （4）丙酮或100%乙醇脫水兩次，各2min； （5）二甲苯透明，樹膠封固。 5、結(jié)果 肥大細(xì)胞顆粒呈紫色，核淺藍(lán)色。,胰島內(nèi)分泌細(xì)胞Massons三色染色法 胰島在胰尾部分布較多，胰島細(xì)胞由A、B、D、PP 四種細(xì)胞組成，細(xì)胞間有豐富的毛細(xì)血管。 用 Massons，Mallory 等特殊染色 方法可區(qū)別 A、B、D細(xì)胞。 1、取材 胰腺 2、固定 ZenkerBouin10%甲醛,3、染液配制 （1）麗春

14、紅酸性品紅液： 麗春紅 0.7g，酸性品紅0.4g，冰醋酸 1ml， 蒸餾水99ml， 用1%的冰醋酸 溶解麗春紅和酸性品紅。 （2）2%亮綠液：亮綠2g，冰醋酸 2ml 蒸餾水98ml， 用2%冰醋酸溶解亮綠。,4、染色程序 （1）切片脫蠟至水； （2）入0.5%碘乙醇5-10min， 自來水洗，蒸餾水洗； （3）入0.5%硫代硫酸鈉3-5min； （4）Weigert 鐵蘇木精10-20min，自來水洗； （5）1%鹽酸乙醇分化，自來水洗藍(lán)化；,（6）入麗春紅酸性品紅液3-5min，蒸餾水速洗； （7）入1%磷酸鉬水溶液5min； （8）傾去磷酸鉬，直接用2%亮綠液染3-5min； （9）

15、0.5%冰醋酸沖洗切片，將亮綠全部洗掉； （10）95%乙醇，無水酒精脫水， 二甲苯透明，樹膠封固。,5、結(jié)果 A 細(xì)胞染成紅色，位于胰島周邊； B細(xì)胞染成紫紅色，位于胰島中央； D細(xì)胞染成綠色，位于A 細(xì)胞與B細(xì)胞之間。 6、注意 用10%甲醛固定， 再用重鉻酸鉀液處理， 也獲得較好效果。,甲綠-派若寧染色顯示DNA和RNA 染色原理：甲綠和派若寧是堿性染料， 染色中甲綠-派若寧染色與 DNA和RNA的聚合程度有關(guān)。 甲綠與聚合程度高的DNA親和力較強(qiáng)； 派若寧與聚合程度低的RNA有親和力。 一、固定 ZenkerCarnoy (4),二、染液配制 1、2%甲綠水溶液： 甲綠2g，蒸餾水10

16、0ml 甲綠提純法：將甲綠溶解后，放入分液漏斗中， 加等量的純氯仿洗，充分搖蕩數(shù)分鐘，靜置， 待液體分層，放掉下層紫色氯仿液。按此法反復(fù)洗， 直至洗不下紫色為止，需洗5次左右。4保存。 2、2%派若寧水溶液： 派若寧 2g，蒸餾水100ml 此液提純，應(yīng)按甲綠方法進(jìn)行。,3、醋酸緩沖液（pH值4.8）： 0.2mol/L 醋酸 41ml， 0.2mol/L醋酸鈉 59ml。 4、甲綠-派若寧染液： 2%甲綠提純液 7.5 ml， 2%派若寧提純液 12.5ml， 醋酸緩沖液 30ml。 此液用前配制。,三、染色程序 1、切片脫蠟入水； 2、切片入甲綠-派若寧染液5-10min； 3、濾紙快速吸干，純丙酮速洗分色； 4、丙酮二甲苯混合液（1:1）速洗2次 5、二甲苯透明，樹膠封固。 四、染色結(jié)果 DNA呈藍(lán)綠色，RNA 呈紅色。, 蘇木精本身不是染料，不能單獨(dú)使用， 因?yàn)閷?duì)組織的親和力很小。 蘇木精必須氧化成蘇木紅才能染色， 常用的