蛋白質(zhì)各種定量方法的優(yōu)缺點(diǎn)的比較

1、;.蛋白質(zhì)各種定量方法的優(yōu)缺點(diǎn)的比較1 蛋白質(zhì)的常規(guī)檢測(cè)方法1.1凱氏（ kjeldahl ）定氮法一種最經(jīng)典的蛋白質(zhì)檢測(cè)方法。原理 ：樣品中含氮有機(jī)化合物與濃硫酸在催化劑作用下共熱消化,含氮有機(jī)物分解產(chǎn)生氨,氨又與硫酸作用變成硫酸銨。然后加堿蒸餾放出氨,氨用過(guò)量的硼酸溶液吸收,再用鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定求出總氮量換算為蛋白質(zhì)含量。優(yōu)點(diǎn) ：范圍廣泛、測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好缺點(diǎn) ：操作復(fù)雜費(fèi)時(shí)、試劑消耗量大1.2雙縮脲法常用于需要快速但并不需要十分精確的蛋白質(zhì)檢測(cè)。原理 ：雙縮脲（ nh3conhconh3）是3 分子的脲經(jīng)180左右加熱，放出1 分子氨后得到的產(chǎn)物。 在強(qiáng)堿性溶液中，雙縮脲與硫酸銅形

2、成紫色絡(luò)合物（肽鍵中的氮原子和銅離子配價(jià)結(jié)合） ，稱為雙縮脲反應(yīng)。紫色絡(luò)合物顏色的深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比，因此可用來(lái)測(cè)定蛋白質(zhì)含量。測(cè)定范圍： 110mg（有的文獻(xiàn)記載為 120mg）優(yōu)點(diǎn) ：較快速，干擾物質(zhì)少，不同蛋白質(zhì)產(chǎn)生的顏色深淺相近缺點(diǎn) ：靈敏度差；三羥甲基氨基甲烷、一些氨基酸和edta等會(huì)干擾該反應(yīng)。1.3 folin- 酚試劑法原理： folin-酚法的原理與雙縮脲法大體相同，利用蛋白質(zhì)中的肽鍵與銅結(jié)合產(chǎn)生雙縮脲反應(yīng)。同時(shí)也由于folin-酚試劑中的磷鉬酸-磷鎢酸試劑被蛋白質(zhì)中的酪氨酸和苯丙氨酸殘基還原，產(chǎn)生深藍(lán)色的鉬藍(lán)和鎢藍(lán)的混合物。在一定的條件下,藍(lán)色深度與蛋白的量成正比，由此

3、可測(cè)定蛋白質(zhì)的含量。測(cè)定范圍： 20250ug優(yōu)點(diǎn) ：靈敏度高，對(duì)水溶性蛋白質(zhì)含量的測(cè)定很有效缺點(diǎn) ：費(fèi)時(shí)，要精確控制操作時(shí)間； folin -酚法試劑的配制比較繁瑣 ,且酚類和檸檬酸、硫酸銨、 tris 緩沖液、甘氨酸、糖類、甘油、還原劑 (二硫代蘇糖醇、巰基乙醇 )、 edta和脲素均會(huì)干擾反應(yīng)。;. .;.1.4紫外吸收法原理 ：蛋白質(zhì)分子中的酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸殘基使其在280nm 處具有紫外吸收，其吸光度與蛋白質(zhì)含量成正比)。此外，蛋白質(zhì)溶液在280nm 的吸光度值與肽鍵含量成正比，利用一定波長(zhǎng)下蛋白質(zhì)溶液的吸光度值與蛋白質(zhì)濃度的正比關(guān)系可以測(cè)定蛋白質(zhì)含量。優(yōu)點(diǎn) ：簡(jiǎn)便、靈敏、快

4、速，不消耗樣品，測(cè)定后能回收。缺點(diǎn) ：測(cè)定蛋白質(zhì)含量的準(zhǔn)確度較差，專一性差；干擾物質(zhì)多，若樣品中含有嘌呤、嘧啶及核酸等能吸收紫外光的物質(zhì)，會(huì)出現(xiàn)較大的干擾。定氮法、雙縮脲法、filon-酚試劑法和紫外吸收法為常用的4 種古老的經(jīng)典方法。1.5考馬斯亮藍(lán)法原理 ：染料考馬斯亮藍(lán)g-250 在酸性溶液中與蛋白質(zhì)中的堿性氨基酸（特別是精氨酸）及芳香族氨基酸殘基相結(jié)合，使染料最大吸收峰的位置由465nm 變?yōu)?595nm ，溶液的顏色也由棕黑色變?yōu)樗{(lán)色，在595nm 下測(cè)定的吸光度值與蛋白質(zhì)濃度呈正比。優(yōu)點(diǎn) ：靈敏度高，測(cè)定快速、簡(jiǎn)便，干擾物質(zhì)少，不受酚類、游離氨基酸和緩沖劑、絡(luò)合劑的影響，適合大量樣

5、品的測(cè)定。缺點(diǎn) ：由于各種蛋白質(zhì)中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同, 因此用于不同蛋白質(zhì)測(cè)定時(shí)有較大的偏差。2. 蛋白質(zhì)的電化學(xué)檢測(cè)方法2.1 蛋白芯片技術(shù)原理 ：將各種蛋白質(zhì)有序地固定于載玻片等各種介質(zhì)載體上成為檢測(cè)的芯片，然后用標(biāo)記特定熒光物質(zhì)的抗體與芯片上的蛋白質(zhì)相匹配結(jié)合，抗體上的熒光將指示對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)及其表達(dá)數(shù)量。優(yōu)點(diǎn) ：快速、低成本2.2電化學(xué)免疫傳感器原理 ：電化學(xué)免疫傳感器是基于抗原抗體反應(yīng)，可進(jìn)行特異性的定量分析的自給式的集成器件， 抗原、抗體是分子識(shí)別元件，且與電化學(xué)傳感元件直接接觸，并通過(guò)傳感元件把某種化學(xué)物質(zhì)濃度信號(hào)轉(zhuǎn)變?yōu)橄鄳?yīng)的電信號(hào)。;. .;.3. 蛋白質(zhì)的分子生物

6、學(xué)檢測(cè)方法3.1 鄰位連接技術(shù)原理 ：首先將不同的dna 單鏈分別與蛋白質(zhì)識(shí)別分子相結(jié)合,形成 pla 探針，經(jīng)過(guò)類似酶聯(lián)免疫吸附法（elisa）中的溫育過(guò)程，2 條含有不同dna 序列的 pla 探針會(huì)同時(shí)結(jié)合到同一個(gè)待測(cè)蛋白質(zhì)分子上。此時(shí)，2 條探針的dna 尾部便在空間上緊密靠近。在過(guò)量的互補(bǔ)連接序列和nda 連接酶的作用下，2 條探針 dna 尾部的游離5端和3端與互補(bǔ)序列雜交并發(fā)生連接反應(yīng)，形成一個(gè)環(huán)狀的蛋白質(zhì)-蛋白識(shí)別分子-單鏈dna 復(fù)合物。該復(fù)合物量的多少，完全取決于樣品中待測(cè)蛋白質(zhì)分子的量，故可用于蛋白質(zhì)的定量分析。優(yōu)點(diǎn) ：檢測(cè)靈敏度高、檢測(cè)特異性強(qiáng)、樣品損耗低、操作簡(jiǎn)單、檢

7、測(cè)設(shè)常見(jiàn)3.2核酸適體原理 ：直接在核酸適體上共價(jià)修飾熒光基團(tuán)，利用它與靶分子結(jié)合時(shí)熒光信號(hào)的變化實(shí)現(xiàn)對(duì)靶分子的檢測(cè)。 修飾有熒光熄滅基團(tuán)的核酸適體探針通過(guò)靜電作用與陽(yáng)離子熒光共軛聚合物結(jié)合，導(dǎo)致后者熒光熄滅，當(dāng)加入靶蛋白后，核酸適體探針與其特異性結(jié)合，熒光熄滅基團(tuán)與陽(yáng)離子熒光共軛聚合物遠(yuǎn)離，聚合物熒光信號(hào)得以恢復(fù)。優(yōu)點(diǎn) ：檢測(cè)限低，檢測(cè)線性范圍廣3.3電泳法原理 ：電泳法 ,就是指帶電荷的供試品（如蛋白質(zhì)、核苷酸等）在惰性支持介質(zhì)（如濾紙、醋酸纖維素、瓊脂糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠等）中，在電場(chǎng)的作用下，向其對(duì)應(yīng)的電極方向按各自的速度進(jìn)行泳動(dòng)， 由于各組分之間的移動(dòng)速度不同， 使各組分分離成狹窄

8、的區(qū)帶，并用適宜的檢測(cè)方法記錄其電泳區(qū)帶圖譜或計(jì)算其百分含量。優(yōu)點(diǎn) ：操作簡(jiǎn)便、快速、樣品用量少、高自動(dòng)化。缺點(diǎn) ：存在核酸、多糖、脂類等干擾分子，影響檢測(cè)結(jié)果。3.4二甲酸喹啉（ bca）法原理 ：在堿性溶液中，蛋白質(zhì)將cu2+還原成 cu+，bca 與 cu+結(jié)合形成穩(wěn)定的藍(lán)紫色復(fù)合物，在 562nm 處具有最大吸收峰，在一定條件下，此復(fù)合物的吸光度與蛋白質(zhì)濃度成正比。優(yōu)點(diǎn) ：試劑單一， 終產(chǎn)物穩(wěn)定， 除對(duì)還原性糖類的干擾敏感外，對(duì)其他物質(zhì)包括常用蛋白質(zhì)增溶的表面活性物質(zhì)如 sds等均無(wú)影響。缺點(diǎn) ：反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)且蛋白質(zhì)也會(huì)發(fā)生不可逆的變性。4. 免疫法;. .;.4.1免疫擴(kuò)散法原理 ：環(huán)狀免疫單擴(kuò)散法，將一定量的抗體（一般常用單價(jià)抗血清）與含緩沖液的瓊脂糖凝膠混勻鋪成適當(dāng)厚度的凝膠板，再把抗原滴進(jìn)凝膠板的小孔中，在合適的濃度和濕度環(huán)境中， 經(jīng)過(guò)一定的時(shí)間，抗原由小孔向四周擴(kuò)散（呈輻射狀），與已沉勻在瓊脂糖凝膠中的抗體相互作用。 當(dāng)抗原擴(kuò)散到一定的距離， 并見(jiàn)抗原抗體的濃度比例合適時(shí)，形成濃沉淀環(huán)，這一沉淀是一種抗原抗體復(fù)合物?？贵w的濃度一定，抗體向瓊脂糖凝膠擴(kuò)散形成的沉淀不再增大，這時(shí)沉淀環(huán)的大小(面積 )與抗原濃度在一定范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，這樣即可定量測(cè)定抗原物質(zhì)-待測(cè)樣品中蛋白質(zhì)的含量。雙向擴(kuò)散