蛋白質(zhì)各種定量方法的優(yōu)缺點的比較

1、;.蛋白質(zhì)各種定量方法的優(yōu)缺點的比較1 蛋白質(zhì)的常規(guī)檢測方法1.1凱氏（ kjeldahl ）定氮法一種最經(jīng)典的蛋白質(zhì)檢測方法。原理 ：樣品中含氮有機化合物與濃硫酸在催化劑作用下共熱消化,含氮有機物分解產(chǎn)生氨,氨又與硫酸作用變成硫酸銨。然后加堿蒸餾放出氨,氨用過量的硼酸溶液吸收,再用鹽酸標準溶液滴定求出總氮量換算為蛋白質(zhì)含量。優(yōu)點 ：范圍廣泛、測定結(jié)果準確、重現(xiàn)性好缺點 ：操作復雜費時、試劑消耗量大1.2雙縮脲法常用于需要快速但并不需要十分精確的蛋白質(zhì)檢測。原理 ：雙縮脲（ nh3conhconh3）是3 分子的脲經(jīng)180左右加熱，放出1 分子氨后得到的產(chǎn)物。 在強堿性溶液中，雙縮脲與硫酸銅形

2、成紫色絡合物（肽鍵中的氮原子和銅離子配價結(jié)合） ，稱為雙縮脲反應。紫色絡合物顏色的深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比，因此可用來測定蛋白質(zhì)含量。測定范圍： 110mg（有的文獻記載為 120mg）優(yōu)點 ：較快速，干擾物質(zhì)少，不同蛋白質(zhì)產(chǎn)生的顏色深淺相近缺點 ：靈敏度差；三羥甲基氨基甲烷、一些氨基酸和edta等會干擾該反應。1.3 folin- 酚試劑法原理： folin-酚法的原理與雙縮脲法大體相同，利用蛋白質(zhì)中的肽鍵與銅結(jié)合產(chǎn)生雙縮脲反應。同時也由于folin-酚試劑中的磷鉬酸-磷鎢酸試劑被蛋白質(zhì)中的酪氨酸和苯丙氨酸殘基還原，產(chǎn)生深藍色的鉬藍和鎢藍的混合物。在一定的條件下,藍色深度與蛋白的量成正比，由此

3、可測定蛋白質(zhì)的含量。測定范圍： 20250ug優(yōu)點 ：靈敏度高，對水溶性蛋白質(zhì)含量的測定很有效缺點 ：費時，要精確控制操作時間； folin -酚法試劑的配制比較繁瑣 ,且酚類和檸檬酸、硫酸銨、 tris 緩沖液、甘氨酸、糖類、甘油、還原劑 (二硫代蘇糖醇、巰基乙醇 )、 edta和脲素均會干擾反應。;. .;.1.4紫外吸收法原理 ：蛋白質(zhì)分子中的酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸殘基使其在280nm 處具有紫外吸收，其吸光度與蛋白質(zhì)含量成正比)。此外，蛋白質(zhì)溶液在280nm 的吸光度值與肽鍵含量成正比，利用一定波長下蛋白質(zhì)溶液的吸光度值與蛋白質(zhì)濃度的正比關(guān)系可以測定蛋白質(zhì)含量。優(yōu)點 ：簡便、靈敏、快

4、速，不消耗樣品，測定后能回收。缺點 ：測定蛋白質(zhì)含量的準確度較差，專一性差；干擾物質(zhì)多，若樣品中含有嘌呤、嘧啶及核酸等能吸收紫外光的物質(zhì)，會出現(xiàn)較大的干擾。定氮法、雙縮脲法、filon-酚試劑法和紫外吸收法為常用的4 種古老的經(jīng)典方法。1.5考馬斯亮藍法原理 ：染料考馬斯亮藍g-250 在酸性溶液中與蛋白質(zhì)中的堿性氨基酸（特別是精氨酸）及芳香族氨基酸殘基相結(jié)合，使染料最大吸收峰的位置由465nm 變?yōu)?595nm ，溶液的顏色也由棕黑色變?yōu)樗{色，在595nm 下測定的吸光度值與蛋白質(zhì)濃度呈正比。優(yōu)點 ：靈敏度高，測定快速、簡便，干擾物質(zhì)少，不受酚類、游離氨基酸和緩沖劑、絡合劑的影響，適合大量樣

5、品的測定。缺點 ：由于各種蛋白質(zhì)中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同, 因此用于不同蛋白質(zhì)測定時有較大的偏差。2. 蛋白質(zhì)的電化學檢測方法2.1 蛋白芯片技術(shù)原理 ：將各種蛋白質(zhì)有序地固定于載玻片等各種介質(zhì)載體上成為檢測的芯片，然后用標記特定熒光物質(zhì)的抗體與芯片上的蛋白質(zhì)相匹配結(jié)合，抗體上的熒光將指示對應的蛋白質(zhì)及其表達數(shù)量。優(yōu)點 ：快速、低成本2.2電化學免疫傳感器原理 ：電化學免疫傳感器是基于抗原抗體反應，可進行特異性的定量分析的自給式的集成器件， 抗原、抗體是分子識別元件，且與電化學傳感元件直接接觸，并通過傳感元件把某種化學物質(zhì)濃度信號轉(zhuǎn)變?yōu)橄鄳碾娦盘枴?. .;.3. 蛋白質(zhì)的分子生物

6、學檢測方法3.1 鄰位連接技術(shù)原理 ：首先將不同的dna 單鏈分別與蛋白質(zhì)識別分子相結(jié)合,形成 pla 探針，經(jīng)過類似酶聯(lián)免疫吸附法（elisa）中的溫育過程，2 條含有不同dna 序列的 pla 探針會同時結(jié)合到同一個待測蛋白質(zhì)分子上。此時，2 條探針的dna 尾部便在空間上緊密靠近。在過量的互補連接序列和nda 連接酶的作用下，2 條探針 dna 尾部的游離5端和3端與互補序列雜交并發(fā)生連接反應，形成一個環(huán)狀的蛋白質(zhì)-蛋白識別分子-單鏈dna 復合物。該復合物量的多少，完全取決于樣品中待測蛋白質(zhì)分子的量，故可用于蛋白質(zhì)的定量分析。優(yōu)點 ：檢測靈敏度高、檢測特異性強、樣品損耗低、操作簡單、檢

7、測設常見3.2核酸適體原理 ：直接在核酸適體上共價修飾熒光基團，利用它與靶分子結(jié)合時熒光信號的變化實現(xiàn)對靶分子的檢測。 修飾有熒光熄滅基團的核酸適體探針通過靜電作用與陽離子熒光共軛聚合物結(jié)合，導致后者熒光熄滅，當加入靶蛋白后，核酸適體探針與其特異性結(jié)合，熒光熄滅基團與陽離子熒光共軛聚合物遠離，聚合物熒光信號得以恢復。優(yōu)點 ：檢測限低，檢測線性范圍廣3.3電泳法原理 ：電泳法 ,就是指帶電荷的供試品（如蛋白質(zhì)、核苷酸等）在惰性支持介質(zhì)（如濾紙、醋酸纖維素、瓊脂糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠等）中，在電場的作用下，向其對應的電極方向按各自的速度進行泳動， 由于各組分之間的移動速度不同， 使各組分分離成狹窄

8、的區(qū)帶，并用適宜的檢測方法記錄其電泳區(qū)帶圖譜或計算其百分含量。優(yōu)點 ：操作簡便、快速、樣品用量少、高自動化。缺點 ：存在核酸、多糖、脂類等干擾分子，影響檢測結(jié)果。3.4二甲酸喹啉（ bca）法原理 ：在堿性溶液中，蛋白質(zhì)將cu2+還原成 cu+，bca 與 cu+結(jié)合形成穩(wěn)定的藍紫色復合物，在 562nm 處具有最大吸收峰，在一定條件下，此復合物的吸光度與蛋白質(zhì)濃度成正比。優(yōu)點 ：試劑單一， 終產(chǎn)物穩(wěn)定， 除對還原性糖類的干擾敏感外，對其他物質(zhì)包括常用蛋白質(zhì)增溶的表面活性物質(zhì)如 sds等均無影響。缺點 ：反應時間長且蛋白質(zhì)也會發(fā)生不可逆的變性。4. 免疫法;. .;.4.1免疫擴散法原理 ：環(huán)狀免疫單擴散法，將一定量的抗體（一般常用單價抗血清）與含緩沖液的瓊脂糖凝膠混勻鋪成適當厚度的凝膠板，再把抗原滴進凝膠板的小孔中，在合適的濃度和濕度環(huán)境中， 經(jīng)過一定的時間，抗原由小孔向四周擴散（呈輻射狀），與已沉勻在瓊脂糖凝膠中的抗體相互作用。 當抗原擴散到一定的距離， 并見抗原抗體的濃度比例合適時，形成濃沉淀環(huán)，這一沉淀是一種抗原抗體復合物。抗體的濃度一定，抗體向瓊脂糖凝膠擴散形成的沉淀不再增大，這時沉淀環(huán)的大小(面積 )與抗原濃度在一定范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，這樣即可定量測定抗原物質(zhì)-待測樣品中蛋白質(zhì)的含量。雙向擴散