【畢業(yè)學(xué)位論文】（Word原稿）茄子內(nèi)生細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及對(duì)其青枯病發(fā)病特性的影響

分類(lèi)號(hào)： 單位代碼： 10389 密 級(jí)： 學(xué) 號(hào)： (S/B) 福建農(nóng)林大學(xué)碩士學(xué)位論文 茄子內(nèi)生細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及對(duì)其青枯病 發(fā)病特性的影響 學(xué) 科 門(mén) 類(lèi)： 農(nóng)學(xué) 一級(jí)學(xué)科名稱(chēng)： 植物病理學(xué) 二級(jí)學(xué)科名稱(chēng)： 分子植物病理學(xué) 研 究 方 向： 分子植物病理學(xué)與植病生理學(xué) 研 究 生：唐秋榕 指 導(dǎo) 教 師：魯國(guó)東教授 劉波研究員 完 成 時(shí) 間：二 年四月 2005 級(jí)植物病理學(xué)碩士學(xué)位論文 - 獨(dú)創(chuàng)性聲明 本人聲明，所呈交的學(xué)位（畢業(yè)）論文，是本人在指導(dǎo)教師的指導(dǎo)下獨(dú)立完成的研究成果，并且是自己撰寫(xiě)的。盡我所知，除了文中作了標(biāo)注和致謝中已作了答謝的地方外，論文中不包含其他人發(fā)表或撰寫(xiě)過(guò)的研究成果。與我一同對(duì)本研究做出貢獻(xiàn)的同志，都在論文中作了明確的說(shuō)明并表示了謝意，如被查有侵犯他人知識(shí)產(chǎn)權(quán)的行為，由本人承擔(dān)應(yīng)有的責(zé)任。 學(xué)位（畢業(yè)）論文作者親筆簽名： 日期： 論文使用授權(quán)的說(shuō)明 本人完全 了解福建農(nóng)林大學(xué)有關(guān)保留、使用學(xué)位（畢業(yè)）論文的規(guī)定，即學(xué)校有權(quán)送交論文的復(fù)印件，允許論文被查閱和借閱 ; 學(xué)校可以公布論文的全部或部分內(nèi)容，可以采用影印、縮印或其他復(fù)制手段保存論文。 保密，在 年后解密可適用本授權(quán)書(shū)。 不保密，本論文屬于不保密。 學(xué)位（畢業(yè)）論文作者親筆簽名： 日期： 指導(dǎo)教師親筆簽名： 日期： 2005 級(jí)植物病理學(xué)碩士學(xué)位論文 - 目 錄 第一章 綜述 . 1 1 茄子青枯病的研究進(jìn)展 . 1 枯病的發(fā)生與危害 . 1 枯菌的致病機(jī)理 . 1 枯病的生物防治 . 1 2 內(nèi)生細(xì)菌與植物病害 . 2 生細(xì)菌概述 . 2 生細(xì)菌與宿主植物間的關(guān)系 . 3 生細(xì)菌與植物病原菌的關(guān)系 . 3 生細(xì)菌的應(yīng)用前景 . 4 3 研究新意 . 4 第二章 茄子植株內(nèi)生細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)多態(tài)性 . 5 前言 . 5 1 材料與方法 . 5 驗(yàn)材料 . 5 生細(xì)菌及青枯雷爾氏的分離 . 6 生細(xì)菌的鑒定 . 6 2 結(jié)果與分析 . 8 子內(nèi)生細(xì)菌鑒定 . 8 同部位茄子植物內(nèi)生細(xì)菌群落結(jié)構(gòu) . 10 同地區(qū)茄子植物內(nèi)生細(xì)菌群落結(jié)構(gòu) . 11 同植株?duì)顟B(tài)茄子內(nèi)生細(xì)菌群落結(jié)構(gòu) . 11 3 小結(jié)與討論 . 12 結(jié) . 12 論 . 12 第三章 優(yōu)勢(shì)內(nèi)生細(xì)菌與青枯雷爾氏菌的相互關(guān)系 . 14 前言 . 14 1 材料與方法 . 14 試材料 . 14 合培養(yǎng)基的優(yōu)化選擇 . 15 培養(yǎng)條件下優(yōu)勢(shì)內(nèi)生細(xì)菌與青枯雷爾氏菌強(qiáng)致病力菌株生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)分析 . 15 2 結(jié)果與分析 . 15 2005 級(jí)植物病理學(xué)碩士學(xué)位論文 - 合培養(yǎng)培養(yǎng)基的優(yōu)化選擇 . 15 培養(yǎng)條件下優(yōu)勢(shì)內(nèi)生菌與青枯雷爾氏菌強(qiáng)致病力菌株生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)分析 . 17 勢(shì)內(nèi)生細(xì)菌與青枯雷爾氏菌生長(zhǎng)相互關(guān)系 . 18 3 小結(jié)與討論 . 18 結(jié) . 18 論 . 19 第四章 優(yōu)勢(shì)內(nèi) 生細(xì)菌對(duì)青枯雷爾氏菌生物學(xué)特性的影響 . 20 前言 . 20 1 材料與方法 . 20 試材料 . 20 株的挑選 . 21 列鑒定 . 21 外吸收測(cè)定 . 22 肪酸含量測(cè)定 . 22 態(tài)性 . 23 致病特性的影響 . 23 2 結(jié)果與分析 . 24 株的挑選 . 24 列鑒定分析 . 24 外吸收變 化 . 26 肪酸特性變化 . 27 理后青枯雷爾氏菌 態(tài)性變化 . 27 病特性 . 29 3 小結(jié)與討論 . 30 結(jié) . 30 論 . 31 第五章 總結(jié)與展望 . 32 1 總結(jié) . 32 2 展望 . 32 參考文獻(xiàn) . 34 附錄 . 38 個(gè)人簡(jiǎn)歷 . 45 致謝 . 46 2005 級(jí)植物病理學(xué)碩士學(xué)位論文 - V - 中文摘要 摘要 ： 對(duì) 福州福清、莆田東洋鎮(zhèn)、泉州晉江采集的田間健康及發(fā)生青枯病的茄子植株進(jìn)行內(nèi)生細(xì)菌的分離，從中分離到以 為主要類(lèi)群的 19 類(lèi)內(nèi)生細(xì)菌。 茄子內(nèi)生細(xì)菌的種群及數(shù)量隨植株不同部位、不同地區(qū)及不同發(fā)病程度有所變化。采集于福州福清的健康茄子植株 根部的內(nèi)生細(xì)菌種類(lèi)多 ，可達(dá) 9 種 ，葉部最少 ，僅有 4種 ； 在內(nèi)生細(xì)菌 數(shù)量 方面，莖部最多，可達(dá) 05g，葉部只有 04g。 健康植株的內(nèi)生細(xì)菌種類(lèi)明顯多于發(fā)生青枯病的植株。不同地區(qū)的內(nèi)生細(xì)菌種類(lèi)也明顯不同。 通過(guò)因素輪換法和正 交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，確定內(nèi)生細(xì)菌與青枯雷爾氏菌共培養(yǎng)的培養(yǎng)基配方為：葡萄糖 5g，酵母膏 5g，蛋白胨 10g。 將分離到的內(nèi)生優(yōu)勢(shì)細(xì)菌 943、 946、 964與青枯雷爾氏菌 1305 進(jìn)行共培養(yǎng) 時(shí) ，發(fā)現(xiàn) 943 與 1305 共培養(yǎng)時(shí)，青枯雷爾氏菌 1305幾乎不生長(zhǎng)， 943 對(duì) 1305 有一定的拮抗作用；而 946、 964 與 1305 共培養(yǎng)時(shí)，兩者生長(zhǎng)菌量均較單獨(dú)培養(yǎng)時(shí)減少，因此 946、 964 可以與 1305 共生，但由于 生長(zhǎng) 條件的限制，表現(xiàn)為競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系。 通過(guò)對(duì)菌株 列的測(cè)定，表明所挑選的菌株均為青枯雷爾氏菌，與青枯雷爾氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株 列的同源性達(dá) 99%以上。 經(jīng)優(yōu)勢(shì)內(nèi)生細(xì)菌處理后的青枯雷爾氏菌生理及致病性測(cè)定后，當(dāng) =，紫外吸收、當(dāng) =脂肪酸類(lèi)型 都可分成三大類(lèi) ， 當(dāng) = 態(tài)性經(jīng)聚類(lèi)分析 菌株可分成四類(lèi) 。 但從本質(zhì)上，可以分成兩大類(lèi)，一類(lèi)為強(qiáng)致病力菌株，另一類(lèi)為弱致病力菌株。 經(jīng)組培苗和盆栽苗的致病性測(cè)定，組培苗不論致病力強(qiáng)弱均發(fā)病，盆栽苗僅強(qiáng)致病力的菌株發(fā)病死亡。 關(guān)鍵詞 ：青枯雷爾氏菌，內(nèi)生細(xì)菌，致病特性 2005 級(jí)植物病理學(xué)碩士學(xué)位論文 - 英文摘要 We 9 of s of of s In of 05g, 04g. of of s By of g, g, 0g. on 43、 946、 964 . 305, 43 305, 46、 964 305 of of . . TS of 9%. of . of = UV of be = of be in be is is in of of in or of of 005 級(jí)植物病理學(xué)碩士學(xué)位論文 - 1 - 第一章 綜述 茄子（ .）原產(chǎn)于東南亞、印度，在世界各地均有栽培，在我國(guó)也是主要的蔬菜之一，但茄子的產(chǎn)量和質(zhì)量受多種病蟲(chóng)害的影響，其中茄子細(xì)菌性青枯病已成為影響茄子生產(chǎn)的主要障礙之一。 1 茄子青枯病的研究進(jìn)展 枯病的發(fā)生與危害 植物青枯?。?由青枯雷爾氏菌（ 起的一種土傳性的毀滅性病害，是許多植物的重大病害之一，廣泛分布于熱帶、亞熱帶及溫帶地區(qū)。植物青枯病菌寄主廣泛，可侵染 50 多個(gè)科的數(shù)百種植物（ et ,2006），其中以茄科作物受害最為嚴(yán)重。 枯菌的致病機(jī)理 青枯菌的致病機(jī)制非常復(fù)雜，存在著如胞外多糖（ 胞外蛋白（聚甲基半乳糖醛酸脂酶（ 纖維素酶（ 果膠酶等（何禮遠(yuǎn)等， 1995）、細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)性（ et ,2006）等多個(gè)與致病性相關(guān)的因素。 目前比較 一致結(jié)論是，胞外多糖在青枯菌致病過(guò)程中是重要因素，但不是唯一的，主要在引起萎蔫癥狀上起關(guān)鍵作用?？狄l(wèi)等（ 1995）通過(guò)轉(zhuǎn)座子誘變技術(shù)，采用定點(diǎn)標(biāo)記突變等手段，獲得了許多類(lèi)型的青枯雷爾氏菌突變體，同時(shí)，也克隆了有關(guān)胞外大分子蛋白的基因，從分子水平上開(kāi)展了胞外大分子在青枯雷爾氏菌致病中的作用研究，研究結(jié)果表明：植物青枯病的胞外酶可降解植物細(xì)胞壁，對(duì)青枯雷爾氏菌的侵入和擴(kuò)展起著主要作用，當(dāng)青枯雷爾氏菌的胞外多糖結(jié)構(gòu)基因發(fā)生突變后，所產(chǎn)生的胞外多糖缺失突變體失去了對(duì)寄主植物的致萎力，引起植物致萎的主要原因 是影響了其水分的輸導(dǎo)；然而，青枯雷爾氏菌產(chǎn)生的胞外多糖在結(jié)構(gòu)上非常特殊，它在致病中的作用是否為簡(jiǎn)單作用，還有待于進(jìn)一步研究。 枯病 的生物防治 青枯病是一種土傳性病害，防治極其困難?；瘜W(xué)藥劑防治容易造成環(huán)境污染，農(nóng)藥殘留以及病原菌抗藥性的增強(qiáng)等種種問(wèn)題，而傳統(tǒng)的抗病育種的方法也因育種年限長(zhǎng)，抗性品種抗性喪失等問(wèn)題的限制，不能長(zhǎng)效地利用。目前，最有效的方法就是生物防治。青枯病的生物防治主要有利用無(wú)致病力青枯雷爾氏菌、芽孢桿菌以及青枯菌的拮抗菌和內(nèi)生拮抗菌。 致病力青枯雷爾氏菌的利用 任 欣正等（ 1993）用 株 治番茄青枯病，均取得溫室2005 級(jí)植物病理學(xué)碩士學(xué)位論文 - 2 - 或小區(qū)試驗(yàn)的良好的防效，但后期防效降低，大田試驗(yàn)未取得成功，這可能主要由于株在大田土壤中不能大量繁殖，缺乏與其它微生物的競(jìng)爭(zhēng)力所致。鄭繼法等（ 1994）研究了煙草細(xì)菌性青枯雷爾氏菌的無(wú)無(wú)毒產(chǎn)細(xì)菌素菌株對(duì)煙草青枯雷爾菌 4果指出：用浸根法處理 個(gè)無(wú)毒菌株對(duì)致病菌 4慶河等（ 2004）利用紫外誘變法獲得的青枯無(wú)致病力菌株 理番茄， 發(fā)現(xiàn)對(duì)青枯病產(chǎn)生抗性，且兩種突變體都可在番茄體內(nèi)定殖和繁殖。王羽等（ 2004）從有青枯病的番茄莖中分離出 198 株無(wú)致病力青枯菌，室內(nèi)平板拮抗試驗(yàn)有 39 株菌株可明顯抑制青枯菌的生長(zhǎng)，溫室盆栽試驗(yàn)篩選出 2 株有較好控病效果，防效分別為 43%和 47%。 孢桿菌的利用 利用芽孢桿菌防治青枯病受到了重視，用于防治青枯病試驗(yàn)的芽孢桿菌有：多粘類(lèi)芽孢桿菌（ et ,1985）、枯草芽孢桿菌（ et ,1993）、凝固芽孢桿菌（ （ M, et ,1998） 、蠟狀芽孢桿菌（ et ,1995）、巨大芽孢桿菌（ 楊合同等， 2002）等等，試驗(yàn)防效在 45% 95%。徐進(jìn)（ 2002）等利用 2 株從土壤中篩選到的芽孢桿菌對(duì)青 枯病進(jìn)行室內(nèi)試驗(yàn)及田間試驗(yàn)，在溫室盆栽試驗(yàn)中對(duì)番茄青枯病的防效達(dá) 在田間試驗(yàn)中對(duì)馬鈴薯青枯病的防效可達(dá) 朱育菁等（ 2004）利用生防菌 劑對(duì)連作重病區(qū)的茄子青枯病具有良好的防效 ，可棕 枯菌的拮抗菌及內(nèi)生拮抗菌的利用 郭堅(jiān)華等（ 2001）用抑菌圈 株對(duì)青枯菌有拮抗作用而又極易人工培養(yǎng)的菌株，在田間的防效在 間，平均增產(chǎn)效果在 間。黎起秦等（ 2005）用內(nèi)生細(xì)菌 室內(nèi)對(duì)番茄青枯病進(jìn)行防效測(cè)定，結(jié)果表明用淋根法先接 后接種病原菌和用注射法先接種 后接種病原菌的處理可取得 而用淋根法 、注射法同時(shí)接種 與病原菌的處理防效較低。 2 內(nèi)生細(xì)菌與植物病害 生細(xì)菌概述 植物內(nèi)生菌（ 指那些其生活史的一定階段或全部階段生活于健康植物的各種組織和器官內(nèi)部的微生物，被感染的宿主植物不表現(xiàn)出（或暫不表現(xiàn)）外在病狀（ , et 1995），可通過(guò)組織學(xué)方法或從嚴(yán)格表面消毒的植物組織中分離或從植物組織內(nèi)直接擴(kuò)增出微生物 方法在證明其內(nèi)生性（ , et 1997）。 內(nèi)生細(xì)菌普遍存 在于各種陸生和水生植物中，研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)生細(xì)菌具有豐富的生物多2005 級(jí)植物病理學(xué)碩士學(xué)位論文 - 3 - 樣性。對(duì)一種植物而言，分離到的內(nèi)生細(xì)菌可達(dá)數(shù)種至數(shù)十種，現(xiàn)代分子系統(tǒng)學(xué)研究也表明，同一種內(nèi)生細(xì)菌往往還具有多樣化的遺傳性（鄒文欣， 2001）。目前在各種農(nóng)作物及果樹(shù)等經(jīng)濟(jì)作物中發(fā)現(xiàn)的內(nèi)生細(xì)菌已超過(guò) 129 種（隸屬于 54 個(gè)屬），這些內(nèi)生細(xì)菌大多為土壤微生物種類(lèi)，其中假單胞菌屬（ 芽孢桿菌屬（ 腸桿菌屬（ 及土壤桿菌屬（ 最常見(jiàn)的屬（ K, et 2002； , et ,2003）。 內(nèi)生細(xì)菌的生物多樣性受多種因素的影響。大量的研究表明，不但不同植物種類(lèi)之間內(nèi)生細(xì)菌的類(lèi)群存在一定的差異，而且同一植物的不同器官、不同生育期、不同生長(zhǎng)地區(qū)和環(huán)境以及不同品種之間也存在明顯差異。氣候條件也影響內(nèi)生細(xì)菌的類(lèi)群；內(nèi)生細(xì)菌的類(lèi)群多樣性甚至也受樹(shù)冠的高度和郁閉度的影響，如在高、密度大、封閉均質(zhì)的樹(shù)冠上內(nèi)生細(xì)菌種類(lèi)數(shù)量和豐度要比在矮、開(kāi)放、暴露混合的樹(shù)冠上的高（ , et ,1998）。 植物內(nèi)生細(xì)菌的種群數(shù)量 與植物的種類(lèi)、基因型、器官、生長(zhǎng)階段、植物自身的營(yíng)養(yǎng)條件及外在環(huán)境條件等密切相關(guān)。不同的植物種類(lèi)內(nèi)生細(xì)菌的種群組成不同，且種群數(shù)量變化也較大。 生細(xì)菌與宿主植物間的關(guān)系 內(nèi)生細(xì)菌與宿主植物間存在著復(fù)雜的互作關(guān)系?；プ麝P(guān)系有：拮抗作用（ 中性關(guān)系（ 偏利共生關(guān)系（ 互惠共生關(guān)系（ 。 內(nèi)生細(xì)菌長(zhǎng)期生活在宿主體內(nèi)的特殊環(huán)境中，并與宿主協(xié)同進(jìn)化，在演化過(guò)程中形成了共生的關(guān)系。一方面內(nèi)生細(xì)菌可以從宿主中吸收營(yíng)養(yǎng)供自 己生長(zhǎng)的需要，另一方面內(nèi)生細(xì)菌在宿主的生長(zhǎng)發(fā)育和系統(tǒng)演化過(guò)程中起重要的作用。感染內(nèi)生細(xì)菌的宿主往往具有生長(zhǎng)速度快（何紅等， 2002） 、增加產(chǎn)量（徐進(jìn)等， 2004），抗逆境（ E, et ,1998）、抗病害（傅正擎等， 1999）等優(yōu)勢(shì)，比未感染植株更具有生存競(jìng)爭(zhēng)能力。 生細(xì)菌與植物病原菌的關(guān)系 微生物間的關(guān)系主要有互生、共生、拮抗、競(jìng)爭(zhēng)?；ド莾煞N可以單獨(dú)生活的微生物共存于同一環(huán)境中，通過(guò)各自的代謝活動(dòng)而有利于對(duì)方，或偏利于一方的一種生活方式。共生是兩種微生物共居在一起，相互分 工協(xié)作，相依為命，甚至形成在生理上表現(xiàn)出一定的分工，在組織和形態(tài)上產(chǎn)生了新的結(jié)構(gòu)的特殊的共生體。共生一般有二種情況：互惠共生即二者均得利和偏利共生即一方得利，但另一方并不受害。拮抗是二種可以單獨(dú)生活的生物，當(dāng)它們生活在一起時(shí)，一方產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物可抑制另一方的生長(zhǎng)甚至將后者殺死。競(jìng)爭(zhēng)是不同的微生物在同一環(huán)境中，對(duì)營(yíng)養(yǎng)等資源進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)，互相受到不利影響。在植物體外，內(nèi)生細(xì)菌與植物病原菌也具有這種關(guān)系，較為普通的是互生、拮抗與競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系。但在植物體內(nèi)，內(nèi)生細(xì)菌與植物病原菌的關(guān)系又如何呢？在病原菌侵入植2005 級(jí)植物病理學(xué)碩士學(xué)位論文 - 4 - 物體內(nèi)時(shí)，某些內(nèi) 生細(xì)菌菌株在數(shù)量上急劇增加，使植物體內(nèi)的優(yōu)勢(shì)菌種群不被病原菌所代替，以保證植物體原有的微生態(tài)平衡（ , et ,1998）。 生細(xì)菌的應(yīng)用前景 由于內(nèi)生細(xì)菌存在于植物體內(nèi)，所處環(huán)境穩(wěn)定并可在植物體內(nèi)長(zhǎng)期定殖并傳導(dǎo)，對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育、抵御病蟲(chóng)害及不良環(huán)境的影響等具有廣泛的作用，是不可多得的天然生物資源，具有廣泛的應(yīng)用前景及開(kāi)發(fā)潛力。 生生防菌劑 使用化學(xué)農(nóng)藥是控制作用病蟲(chóng)害的有效方法，但化學(xué)藥劑污染環(huán)境，易產(chǎn)生抗藥性，破壞生態(tài)平衡，還有殘留問(wèn)題，因此植物病害 的生物防治越來(lái)越重要。植物內(nèi)生細(xì)菌可以通過(guò)分泌抗生物質(zhì)（ V, et ,1999； , et ,1998）和誘導(dǎo)植物系統(tǒng)抗性（ G, et ,1996）等不同機(jī)制，起到減輕和防治植物病害的生物學(xué)作用。 目前，利用內(nèi)生細(xì)菌來(lái)防治病蟲(chóng)草害在國(guó)內(nèi)外也有報(bào)道。楊海蓮等（ 2001）利用從水稻中分離的內(nèi)生陰溝腸桿菌（ 菌液噴灑水稻葉片，結(jié)果表明能夠明顯提高對(duì)水稻對(duì)白葉枯病、稻瘟病、紋枯病的抗性。石晶盈等（ 2007）采用噴霧法接種 在番木瓜葉片、葉柄、果皮和果肉中定殖，進(jìn)行采后防病試驗(yàn)，對(duì)采后番木瓜疫病和炭疽病的防效分別達(dá) 能內(nèi)生細(xì)菌資源的構(gòu)建 內(nèi)生細(xì)菌是構(gòu)建 工程菌 的理想載體。因內(nèi)生細(xì)菌具有在植物體內(nèi)定殖、繁殖、轉(zhuǎn)移的特點(diǎn)，將某些抗病蟲(chóng)基因?qū)氲絻?nèi)生細(xì)菌中，能提高植物的抗病蟲(chóng)能力，而植物本身的基因并未發(fā)生改變，這樣可以保持植物的天然性狀（石晶盈等， 2006）。段燦星等（ 2002）利用 3 株轉(zhuǎn) Bt lA(c)基因的抗蟲(chóng)工程菌對(duì)亞洲玉米螟進(jìn)行離體生物測(cè)定，發(fā)現(xiàn) 注射接種抗蟲(chóng)工程菌的處理株對(duì)玉米螟有明顯的抗性。 3 研究新意 青枯雷爾氏菌具有潛伏侵染的特性 （ , et ,1992; 廖伯壽等， 1998） ，為什么會(huì)產(chǎn)生這種現(xiàn)象呢？是不是因?yàn)橹参矬w內(nèi)的內(nèi)生細(xì)菌對(duì)青枯雷爾氏菌的侵染有所影響？如果是，那么內(nèi)生細(xì)菌是如何影響影響青枯雷爾氏菌的呢？ 本試驗(yàn)通過(guò)從茄子中分離到優(yōu)勢(shì)內(nèi)生細(xì)菌在實(shí)驗(yàn)室條件下對(duì)青枯雷爾氏菌進(jìn)行處理，與青枯雷爾氏菌共培養(yǎng)，觀察青枯雷爾氏菌的生長(zhǎng)與青枯雷爾氏菌菌株致病力的變化。共培養(yǎng)后進(jìn)一步對(duì)處理后青枯雷爾氏菌進(jìn)行生理特性和致病力 特性的研究，觀察處理后的青枯雷爾氏菌是否在生理特性和致病特性上發(fā)生變化，從而推斷內(nèi)生細(xì)菌對(duì)青枯雷爾氏菌致病特性的影響力，進(jìn)一步推斷植株內(nèi)生細(xì)菌群落的結(jié)構(gòu)對(duì)青枯雷爾氏菌的致病特性是否有影響。 2005 級(jí)植物病理學(xué)碩士學(xué)位論文 - 5 - 第二章 茄子植株內(nèi)生細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)多態(tài)性 前言 植物內(nèi)生細(xì)菌是植物體內(nèi)的微生物中比較龐大的一個(gè)群體，廣泛存在于種子、根、莖、葉、果實(shí)等器官中。植物內(nèi)生細(xì)菌具有宿主特異性，而且在同一宿主的不同器官、生育期及宿主所處環(huán)境的不同，其類(lèi)群結(jié)構(gòu)各有不同（ et 2003）。已有研究表明，植物內(nèi)生細(xì)菌具 有提高植物抗病性的功能，了解內(nèi)生細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)多樣性對(duì)有效地利用內(nèi)生細(xì)菌防治植物病害具有重要意義。 通過(guò)分離茄子從不同地區(qū)采集的健康及發(fā)生青枯病的植株中的內(nèi)生細(xì)菌，明確茄子植株內(nèi)生細(xì)菌菌群的組成、菌群密度的分布特點(diǎn)及種植地區(qū)、不同部位、植株的健康狀態(tài)對(duì)內(nèi)生細(xì)菌分布的影響，從而了解植物內(nèi)生細(xì)菌與植物病原菌間的消長(zhǎng)關(guān)系，為內(nèi)生細(xì)菌資源的進(jìn)一步研究和開(kāi)發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。 1 材料與方法 驗(yàn)材料 本采集：從福州福清、泉州晉江、莆田東洋鎮(zhèn)等地采集結(jié)果期的茄子健康植株及發(fā)生青枯病植株樣本分析內(nèi)生細(xì) 菌的種類(lèi)及數(shù)量。 養(yǎng)基 與試劑 普通細(xì)菌分離用 養(yǎng)基，青枯雷爾氏菌分離用 養(yǎng)基，細(xì)菌的保存用 養(yǎng)基：牛肉浸膏 3g，酵母浸膏 1g，蛋白胨 5g，葡萄糖 10g，瓊脂 18g，蒸餾水 1000養(yǎng)基：蛋白胨 10g，酪朊水解物 1g，葡萄糖 5g，瓊脂 18g，蒸餾水 1000mL，度調(diào)節(jié)到約 裝，滅菌（ 121 ） 20過(guò)濾滅菌的 1%的 2， 3， 5氯化三苯基四氮唑（ 水溶液到冷卻到 55 左右的滅菌培養(yǎng)基中，使最終濃度達(dá)到 養(yǎng)基：胰蛋白胨 10g，酵母提取物 5g， 0g，蒸餾水 1000mL，肪酸提取處理試劑： 試劑 1 45 g 甲醇（ 150 離子蒸餾水 150 005 級(jí)植物病理學(xué)碩士學(xué)位論文 - 6 - 水和甲醇混合后加入 ，同時(shí)攪拌至完 全溶解 試劑 2 酸 25醇（ 275 把鹽酸加入到甲醇中，并不斷攪拌 試劑 3 正己烷 ( 200 200 入到正己烷中，并攪拌均勻 試劑 4 離子蒸餾水 900 生細(xì)菌及青枯雷爾氏的分離 采用表面消毒研磨法及平板稀釋分離法。將茄子植株樣本分成根、莖基、莖中、莖頂、葉五個(gè)部分，置于 75%乙醇中浸泡 1，于 汞中消毒 2 3即用無(wú)菌水漂洗 3 次（除去剩余升汞）。將樣品移入無(wú)菌研缽中，用滅菌剪刀剪碎后加入 10分研磨。靜 止 20 30，吸取 1行梯度稀釋?zhuān)『笕齻€(gè)稀釋度涂板，每個(gè)濃度 3 個(gè)重復(fù)。完成后，平