【畢業(yè)學位論文】（Word原稿）茄子內(nèi)生細菌群落結(jié)構(gòu)及對其青枯病發(fā)病特性的影響

分類號： 單位代碼： 10389 密 級： 學 號： (S/B) 福建農(nóng)林大學碩士學位論文 茄子內(nèi)生細菌群落結(jié)構(gòu)及對其青枯病 發(fā)病特性的影響 學 科 門 類： 農(nóng)學 一級學科名稱： 植物病理學 二級學科名稱： 分子植物病理學 研 究 方 向： 分子植物病理學與植病生理學 研 究 生：唐秋榕 指 導 教 師：魯國東教授 劉波研究員 完 成 時 間：二 年四月 2005 級植物病理學碩士學位論文 - 獨創(chuàng)性聲明 本人聲明，所呈交的學位（畢業(yè)）論文，是本人在指導教師的指導下獨立完成的研究成果，并且是自己撰寫的。盡我所知，除了文中作了標注和致謝中已作了答謝的地方外，論文中不包含其他人發(fā)表或撰寫過的研究成果。與我一同對本研究做出貢獻的同志，都在論文中作了明確的說明并表示了謝意，如被查有侵犯他人知識產(chǎn)權(quán)的行為，由本人承擔應有的責任。 學位（畢業(yè)）論文作者親筆簽名： 日期： 論文使用授權(quán)的說明 本人完全 了解福建農(nóng)林大學有關(guān)保留、使用學位（畢業(yè)）論文的規(guī)定，即學校有權(quán)送交論文的復印件，允許論文被查閱和借閱 ; 學?？梢怨颊撐牡娜炕虿糠謨?nèi)容，可以采用影印、縮印或其他復制手段保存論文。 保密，在 年后解密可適用本授權(quán)書。 不保密，本論文屬于不保密。 學位（畢業(yè)）論文作者親筆簽名： 日期： 指導教師親筆簽名： 日期： 2005 級植物病理學碩士學位論文 - 目 錄 第一章 綜述 . 1 1 茄子青枯病的研究進展 . 1 枯病的發(fā)生與危害 . 1 枯菌的致病機理 . 1 枯病的生物防治 . 1 2 內(nèi)生細菌與植物病害 . 2 生細菌概述 . 2 生細菌與宿主植物間的關(guān)系 . 3 生細菌與植物病原菌的關(guān)系 . 3 生細菌的應用前景 . 4 3 研究新意 . 4 第二章 茄子植株內(nèi)生細菌群落結(jié)構(gòu)多態(tài)性 . 5 前言 . 5 1 材料與方法 . 5 驗材料 . 5 生細菌及青枯雷爾氏的分離 . 6 生細菌的鑒定 . 6 2 結(jié)果與分析 . 8 子內(nèi)生細菌鑒定 . 8 同部位茄子植物內(nèi)生細菌群落結(jié)構(gòu) . 10 同地區(qū)茄子植物內(nèi)生細菌群落結(jié)構(gòu) . 11 同植株狀態(tài)茄子內(nèi)生細菌群落結(jié)構(gòu) . 11 3 小結(jié)與討論 . 12 結(jié) . 12 論 . 12 第三章 優(yōu)勢內(nèi)生細菌與青枯雷爾氏菌的相互關(guān)系 . 14 前言 . 14 1 材料與方法 . 14 試材料 . 14 合培養(yǎng)基的優(yōu)化選擇 . 15 培養(yǎng)條件下優(yōu)勢內(nèi)生細菌與青枯雷爾氏菌強致病力菌株生長動態(tài)分析 . 15 2 結(jié)果與分析 . 15 2005 級植物病理學碩士學位論文 - 合培養(yǎng)培養(yǎng)基的優(yōu)化選擇 . 15 培養(yǎng)條件下優(yōu)勢內(nèi)生菌與青枯雷爾氏菌強致病力菌株生長動態(tài)分析 . 17 勢內(nèi)生細菌與青枯雷爾氏菌生長相互關(guān)系 . 18 3 小結(jié)與討論 . 18 結(jié) . 18 論 . 19 第四章 優(yōu)勢內(nèi) 生細菌對青枯雷爾氏菌生物學特性的影響 . 20 前言 . 20 1 材料與方法 . 20 試材料 . 20 株的挑選 . 21 列鑒定 . 21 外吸收測定 . 22 肪酸含量測定 . 22 態(tài)性 . 23 致病特性的影響 . 23 2 結(jié)果與分析 . 24 株的挑選 . 24 列鑒定分析 . 24 外吸收變 化 . 26 肪酸特性變化 . 27 理后青枯雷爾氏菌 態(tài)性變化 . 27 病特性 . 29 3 小結(jié)與討論 . 30 結(jié) . 30 論 . 31 第五章 總結(jié)與展望 . 32 1 總結(jié) . 32 2 展望 . 32 參考文獻 . 34 附錄 . 38 個人簡歷 . 45 致謝 . 46 2005 級植物病理學碩士學位論文 - V - 中文摘要 摘要 ： 對 福州福清、莆田東洋鎮(zhèn)、泉州晉江采集的田間健康及發(fā)生青枯病的茄子植株進行內(nèi)生細菌的分離，從中分離到以 為主要類群的 19 類內(nèi)生細菌。 茄子內(nèi)生細菌的種群及數(shù)量隨植株不同部位、不同地區(qū)及不同發(fā)病程度有所變化。采集于福州福清的健康茄子植株 根部的內(nèi)生細菌種類多 ，可達 9 種 ，葉部最少 ，僅有 4種 ； 在內(nèi)生細菌 數(shù)量 方面，莖部最多，可達 05g，葉部只有 04g。 健康植株的內(nèi)生細菌種類明顯多于發(fā)生青枯病的植株。不同地區(qū)的內(nèi)生細菌種類也明顯不同。 通過因素輪換法和正 交試驗設(shè)計，確定內(nèi)生細菌與青枯雷爾氏菌共培養(yǎng)的培養(yǎng)基配方為：葡萄糖 5g，酵母膏 5g，蛋白胨 10g。 將分離到的內(nèi)生優(yōu)勢細菌 943、 946、 964與青枯雷爾氏菌 1305 進行共培養(yǎng) 時 ，發(fā)現(xiàn) 943 與 1305 共培養(yǎng)時，青枯雷爾氏菌 1305幾乎不生長， 943 對 1305 有一定的拮抗作用；而 946、 964 與 1305 共培養(yǎng)時，兩者生長菌量均較單獨培養(yǎng)時減少，因此 946、 964 可以與 1305 共生，但由于 生長 條件的限制，表現(xiàn)為競爭關(guān)系。 通過對菌株 列的測定，表明所挑選的菌株均為青枯雷爾氏菌，與青枯雷爾氏菌標準菌株 列的同源性達 99%以上。 經(jīng)優(yōu)勢內(nèi)生細菌處理后的青枯雷爾氏菌生理及致病性測定后，當 =，紫外吸收、當 =脂肪酸類型 都可分成三大類 ， 當 = 態(tài)性經(jīng)聚類分析 菌株可分成四類 。 但從本質(zhì)上，可以分成兩大類，一類為強致病力菌株，另一類為弱致病力菌株。 經(jīng)組培苗和盆栽苗的致病性測定，組培苗不論致病力強弱均發(fā)病，盆栽苗僅強致病力的菌株發(fā)病死亡。 關(guān)鍵詞 ：青枯雷爾氏菌，內(nèi)生細菌，致病特性 2005 級植物病理學碩士學位論文 - 英文摘要 We 9 of s of of s In of 05g, 04g. of of s By of g, g, 0g. on 43、 946、 964 . 305, 43 305, 46、 964 305 of of . . TS of 9%. of . of = UV of be = of be in be is is in of of in or of of 005 級植物病理學碩士學位論文 - 1 - 第一章 綜述 茄子（ .）原產(chǎn)于東南亞、印度，在世界各地均有栽培，在我國也是主要的蔬菜之一，但茄子的產(chǎn)量和質(zhì)量受多種病蟲害的影響，其中茄子細菌性青枯病已成為影響茄子生產(chǎn)的主要障礙之一。 1 茄子青枯病的研究進展 枯病的發(fā)生與危害 植物青枯?。?由青枯雷爾氏菌（ 起的一種土傳性的毀滅性病害，是許多植物的重大病害之一，廣泛分布于熱帶、亞熱帶及溫帶地區(qū)。植物青枯病菌寄主廣泛，可侵染 50 多個科的數(shù)百種植物（ et ,2006），其中以茄科作物受害最為嚴重。 枯菌的致病機理 青枯菌的致病機制非常復雜，存在著如胞外多糖（ 胞外蛋白（聚甲基半乳糖醛酸脂酶（ 纖維素酶（ 果膠酶等（何禮遠等， 1995）、細菌的運動性（ et ,2006）等多個與致病性相關(guān)的因素。 目前比較 一致結(jié)論是，胞外多糖在青枯菌致病過程中是重要因素，但不是唯一的，主要在引起萎蔫癥狀上起關(guān)鍵作用?？狄l(wèi)等（ 1995）通過轉(zhuǎn)座子誘變技術(shù)，采用定點標記突變等手段，獲得了許多類型的青枯雷爾氏菌突變體，同時，也克隆了有關(guān)胞外大分子蛋白的基因，從分子水平上開展了胞外大分子在青枯雷爾氏菌致病中的作用研究，研究結(jié)果表明：植物青枯病的胞外酶可降解植物細胞壁，對青枯雷爾氏菌的侵入和擴展起著主要作用，當青枯雷爾氏菌的胞外多糖結(jié)構(gòu)基因發(fā)生突變后，所產(chǎn)生的胞外多糖缺失突變體失去了對寄主植物的致萎力，引起植物致萎的主要原因 是影響了其水分的輸導；然而，青枯雷爾氏菌產(chǎn)生的胞外多糖在結(jié)構(gòu)上非常特殊，它在致病中的作用是否為簡單作用，還有待于進一步研究。 枯病 的生物防治 青枯病是一種土傳性病害，防治極其困難?；瘜W藥劑防治容易造成環(huán)境污染，農(nóng)藥殘留以及病原菌抗藥性的增強等種種問題，而傳統(tǒng)的抗病育種的方法也因育種年限長，抗性品種抗性喪失等問題的限制，不能長效地利用。目前，最有效的方法就是生物防治。青枯病的生物防治主要有利用無致病力青枯雷爾氏菌、芽孢桿菌以及青枯菌的拮抗菌和內(nèi)生拮抗菌。 致病力青枯雷爾氏菌的利用 任 欣正等（ 1993）用 株 治番茄青枯病，均取得溫室2005 級植物病理學碩士學位論文 - 2 - 或小區(qū)試驗的良好的防效，但后期防效降低，大田試驗未取得成功，這可能主要由于株在大田土壤中不能大量繁殖，缺乏與其它微生物的競爭力所致。鄭繼法等（ 1994）研究了煙草細菌性青枯雷爾氏菌的無無毒產(chǎn)細菌素菌株對煙草青枯雷爾菌 4果指出：用浸根法處理 個無毒菌株對致病菌 4慶河等（ 2004）利用紫外誘變法獲得的青枯無致病力菌株 理番茄， 發(fā)現(xiàn)對青枯病產(chǎn)生抗性，且兩種突變體都可在番茄體內(nèi)定殖和繁殖。王羽等（ 2004）從有青枯病的番茄莖中分離出 198 株無致病力青枯菌，室內(nèi)平板拮抗試驗有 39 株菌株可明顯抑制青枯菌的生長，溫室盆栽試驗篩選出 2 株有較好控病效果，防效分別為 43%和 47%。 孢桿菌的利用 利用芽孢桿菌防治青枯病受到了重視，用于防治青枯病試驗的芽孢桿菌有：多粘類芽孢桿菌（ et ,1985）、枯草芽孢桿菌（ et ,1993）、凝固芽孢桿菌（ （ M, et ,1998） 、蠟狀芽孢桿菌（ et ,1995）、巨大芽孢桿菌（ 楊合同等， 2002）等等，試驗防效在 45% 95%。徐進（ 2002）等利用 2 株從土壤中篩選到的芽孢桿菌對青 枯病進行室內(nèi)試驗及田間試驗，在溫室盆栽試驗中對番茄青枯病的防效達 在田間試驗中對馬鈴薯青枯病的防效可達 朱育菁等（ 2004）利用生防菌 劑對連作重病區(qū)的茄子青枯病具有良好的防效 ，可棕 枯菌的拮抗菌及內(nèi)生拮抗菌的利用 郭堅華等（ 2001）用抑菌圈 株對青枯菌有拮抗作用而又極易人工培養(yǎng)的菌株，在田間的防效在 間，平均增產(chǎn)效果在 間。黎起秦等（ 2005）用內(nèi)生細菌 室內(nèi)對番茄青枯病進行防效測定，結(jié)果表明用淋根法先接 后接種病原菌和用注射法先接種 后接種病原菌的處理可取得 而用淋根法 、注射法同時接種 與病原菌的處理防效較低。 2 內(nèi)生細菌與植物病害 生細菌概述 植物內(nèi)生菌（ 指那些其生活史的一定階段或全部階段生活于健康植物的各種組織和器官內(nèi)部的微生物，被感染的宿主植物不表現(xiàn)出（或暫不表現(xiàn)）外在病狀（ , et 1995），可通過組織學方法或從嚴格表面消毒的植物組織中分離或從植物組織內(nèi)直接擴增出微生物 方法在證明其內(nèi)生性（ , et 1997）。 內(nèi)生細菌普遍存 在于各種陸生和水生植物中，研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)生細菌具有豐富的生物多2005 級植物病理學碩士學位論文 - 3 - 樣性。對一種植物而言，分離到的內(nèi)生細菌可達數(shù)種至數(shù)十種，現(xiàn)代分子系統(tǒng)學研究也表明，同一種內(nèi)生細菌往往還具有多樣化的遺傳性（鄒文欣， 2001）。目前在各種農(nóng)作物及果樹等經(jīng)濟作物中發(fā)現(xiàn)的內(nèi)生細菌已超過 129 種（隸屬于 54 個屬），這些內(nèi)生細菌大多為土壤微生物種類，其中假單胞菌屬（ 芽孢桿菌屬（ 腸桿菌屬（ 及土壤桿菌屬（ 最常見的屬（ K, et 2002； , et ,2003）。 內(nèi)生細菌的生物多樣性受多種因素的影響。大量的研究表明，不但不同植物種類之間內(nèi)生細菌的類群存在一定的差異，而且同一植物的不同器官、不同生育期、不同生長地區(qū)和環(huán)境以及不同品種之間也存在明顯差異。氣候條件也影響內(nèi)生細菌的類群；內(nèi)生細菌的類群多樣性甚至也受樹冠的高度和郁閉度的影響，如在高、密度大、封閉均質(zhì)的樹冠上內(nèi)生細菌種類數(shù)量和豐度要比在矮、開放、暴露混合的樹冠上的高（ , et ,1998）。 植物內(nèi)生細菌的種群數(shù)量 與植物的種類、基因型、器官、生長階段、植物自身的營養(yǎng)條件及外在環(huán)境條件等密切相關(guān)。不同的植物種類內(nèi)生細菌的種群組成不同，且種群數(shù)量變化也較大。 生細菌與宿主植物間的關(guān)系 內(nèi)生細菌與宿主植物間存在著復雜的互作關(guān)系?；プ麝P(guān)系有：拮抗作用（ 中性關(guān)系（ 偏利共生關(guān)系（ 互惠共生關(guān)系（ 。 內(nèi)生細菌長期生活在宿主體內(nèi)的特殊環(huán)境中，并與宿主協(xié)同進化，在演化過程中形成了共生的關(guān)系。一方面內(nèi)生細菌可以從宿主中吸收營養(yǎng)供自 己生長的需要，另一方面內(nèi)生細菌在宿主的生長發(fā)育和系統(tǒng)演化過程中起重要的作用。感染內(nèi)生細菌的宿主往往具有生長速度快（何紅等， 2002） 、增加產(chǎn)量（徐進等， 2004），抗逆境（ E, et ,1998）、抗病害（傅正擎等， 1999）等優(yōu)勢，比未感染植株更具有生存競爭能力。 生細菌與植物病原菌的關(guān)系 微生物間的關(guān)系主要有互生、共生、拮抗、競爭。互生是兩種可以單獨生活的微生物共存于同一環(huán)境中，通過各自的代謝活動而有利于對方，或偏利于一方的一種生活方式。共生是兩種微生物共居在一起，相互分 工協(xié)作，相依為命，甚至形成在生理上表現(xiàn)出一定的分工，在組織和形態(tài)上產(chǎn)生了新的結(jié)構(gòu)的特殊的共生體。共生一般有二種情況：互惠共生即二者均得利和偏利共生即一方得利，但另一方并不受害。拮抗是二種可以單獨生活的生物，當它們生活在一起時，一方產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物可抑制另一方的生長甚至將后者殺死。競爭是不同的微生物在同一環(huán)境中，對營養(yǎng)等資源進行競爭，互相受到不利影響。在植物體外，內(nèi)生細菌與植物病原菌也具有這種關(guān)系，較為普通的是互生、拮抗與競爭關(guān)系。但在植物體內(nèi)，內(nèi)生細菌與植物病原菌的關(guān)系又如何呢？在病原菌侵入植2005 級植物病理學碩士學位論文 - 4 - 物體內(nèi)時，某些內(nèi) 生細菌菌株在數(shù)量上急劇增加，使植物體內(nèi)的優(yōu)勢菌種群不被病原菌所代替，以保證植物體原有的微生態(tài)平衡（ , et ,1998）。 生細菌的應用前景 由于內(nèi)生細菌存在于植物體內(nèi)，所處環(huán)境穩(wěn)定并可在植物體內(nèi)長期定殖并傳導，對植物的生長發(fā)育、抵御病蟲害及不良環(huán)境的影響等具有廣泛的作用，是不可多得的天然生物資源，具有廣泛的應用前景及開發(fā)潛力。 生生防菌劑 使用化學農(nóng)藥是控制作用病蟲害的有效方法，但化學藥劑污染環(huán)境，易產(chǎn)生抗藥性，破壞生態(tài)平衡，還有殘留問題，因此植物病害 的生物防治越來越重要。植物內(nèi)生細菌可以通過分泌抗生物質(zhì)（ V, et ,1999； , et ,1998）和誘導植物系統(tǒng)抗性（ G, et ,1996）等不同機制，起到減輕和防治植物病害的生物學作用。 目前，利用內(nèi)生細菌來防治病蟲草害在國內(nèi)外也有報道。楊海蓮等（ 2001）利用從水稻中分離的內(nèi)生陰溝腸桿菌（ 菌液噴灑水稻葉片，結(jié)果表明能夠明顯提高對水稻對白葉枯病、稻瘟病、紋枯病的抗性。石晶盈等（ 2007）采用噴霧法接種 在番木瓜葉片、葉柄、果皮和果肉中定殖，進行采后防病試驗，對采后番木瓜疫病和炭疽病的防效分別達 能內(nèi)生細菌資源的構(gòu)建 內(nèi)生細菌是構(gòu)建 工程菌 的理想載體。因內(nèi)生細菌具有在植物體內(nèi)定殖、繁殖、轉(zhuǎn)移的特點，將某些抗病蟲基因?qū)氲絻?nèi)生細菌中，能提高植物的抗病蟲能力，而植物本身的基因并未發(fā)生改變，這樣可以保持植物的天然性狀（石晶盈等， 2006）。段燦星等（ 2002）利用 3 株轉(zhuǎn) Bt lA(c)基因的抗蟲工程菌對亞洲玉米螟進行離體生物測定，發(fā)現(xiàn) 注射接種抗蟲工程菌的處理株對玉米螟有明顯的抗性。 3 研究新意 青枯雷爾氏菌具有潛伏侵染的特性 （ , et ,1992; 廖伯壽等， 1998） ，為什么會產(chǎn)生這種現(xiàn)象呢？是不是因為植物體內(nèi)的內(nèi)生細菌對青枯雷爾氏菌的侵染有所影響？如果是，那么內(nèi)生細菌是如何影響影響青枯雷爾氏菌的呢？ 本試驗通過從茄子中分離到優(yōu)勢內(nèi)生細菌在實驗室條件下對青枯雷爾氏菌進行處理，與青枯雷爾氏菌共培養(yǎng)，觀察青枯雷爾氏菌的生長與青枯雷爾氏菌菌株致病力的變化。共培養(yǎng)后進一步對處理后青枯雷爾氏菌進行生理特性和致病力 特性的研究，觀察處理后的青枯雷爾氏菌是否在生理特性和致病特性上發(fā)生變化，從而推斷內(nèi)生細菌對青枯雷爾氏菌致病特性的影響力，進一步推斷植株內(nèi)生細菌群落的結(jié)構(gòu)對青枯雷爾氏菌的致病特性是否有影響。 2005 級植物病理學碩士學位論文 - 5 - 第二章 茄子植株內(nèi)生細菌群落結(jié)構(gòu)多態(tài)性 前言 植物內(nèi)生細菌是植物體內(nèi)的微生物中比較龐大的一個群體，廣泛存在于種子、根、莖、葉、果實等器官中。植物內(nèi)生細菌具有宿主特異性，而且在同一宿主的不同器官、生育期及宿主所處環(huán)境的不同，其類群結(jié)構(gòu)各有不同（ et 2003）。已有研究表明，植物內(nèi)生細菌具 有提高植物抗病性的功能，了解內(nèi)生細菌的群落結(jié)構(gòu)多樣性對有效地利用內(nèi)生細菌防治植物病害具有重要意義。 通過分離茄子從不同地區(qū)采集的健康及發(fā)生青枯病的植株中的內(nèi)生細菌，明確茄子植株內(nèi)生細菌菌群的組成、菌群密度的分布特點及種植地區(qū)、不同部位、植株的健康狀態(tài)對內(nèi)生細菌分布的影響，從而了解植物內(nèi)生細菌與植物病原菌間的消長關(guān)系，為內(nèi)生細菌資源的進一步研究和開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。 1 材料與方法 驗材料 本采集：從福州福清、泉州晉江、莆田東洋鎮(zhèn)等地采集結(jié)果期的茄子健康植株及發(fā)生青枯病植株樣本分析內(nèi)生細 菌的種類及數(shù)量。 養(yǎng)基 與試劑 普通細菌分離用 養(yǎng)基，青枯雷爾氏菌分離用 養(yǎng)基，細菌的保存用 養(yǎng)基：牛肉浸膏 3g，酵母浸膏 1g，蛋白胨 5g，葡萄糖 10g，瓊脂 18g，蒸餾水 1000養(yǎng)基：蛋白胨 10g，酪朊水解物 1g，葡萄糖 5g，瓊脂 18g，蒸餾水 1000mL，度調(diào)節(jié)到約 裝，滅菌（ 121 ） 20過濾滅菌的 1%的 2， 3， 5氯化三苯基四氮唑（ 水溶液到冷卻到 55 左右的滅菌培養(yǎng)基中，使最終濃度達到 養(yǎng)基：胰蛋白胨 10g，酵母提取物 5g， 0g，蒸餾水 1000mL，肪酸提取處理試劑： 試劑 1 45 g 甲醇（ 150 離子蒸餾水 150 005 級植物病理學碩士學位論文 - 6 - 水和甲醇混合后加入 ，同時攪拌至完 全溶解 試劑 2 酸 25醇（ 275 把鹽酸加入到甲醇中，并不斷攪拌 試劑 3 正己烷 ( 200 200 入到正己烷中，并攪拌均勻 試劑 4 離子蒸餾水 900 生細菌及青枯雷爾氏的分離 采用表面消毒研磨法及平板稀釋分離法。將茄子植株樣本分成根、莖基、莖中、莖頂、葉五個部分，置于 75%乙醇中浸泡 1，于 汞中消毒 2 3即用無菌水漂洗 3 次（除去剩余升汞）。將樣品移入無菌研缽中，用滅菌剪刀剪碎后加入 10分研磨。靜 止 20 30，吸取 1行梯度稀釋，取后三個稀釋度涂板，每個濃度 3 個重復。完成后，平