2-丙基戊酸和5-氮雜胞苷對(duì)ips細(xì)胞誘導(dǎo)率影響的設(shè)計(jì)書(shū)

1 2胞誘導(dǎo)率影響的設(shè)計(jì)書(shū) 第一部分 文獻(xiàn)綜述 1 胞發(fā)展簡(jiǎn)介 1.1 胞的誘導(dǎo) 胞的誕生 成熟的體細(xì)胞由分化的狀態(tài)逆轉(zhuǎn)到未分化狀態(tài)的過(guò)程稱之為細(xì)胞重編程，細(xì)胞重編程現(xiàn)象最早在核移植實(shí)驗(yàn)中被發(fā)現(xiàn)。細(xì)胞重編程的方法包括體細(xì)胞核移植、 擾細(xì)胞質(zhì)重編程技術(shù)、多能干細(xì)胞和體細(xì)胞融合、多能細(xì)胞的提取物與體細(xì)胞共孵育等。其重編程過(guò)程包括染色體結(jié)構(gòu)重建、 基化、組蛋白乙?；⒂∮浕虮磉_(dá)、端粒長(zhǎng)度恢復(fù)以及 x 染色體失活等。重編程后，體細(xì)胞核 會(huì)忘卻原先體細(xì)胞留下的記憶重新進(jìn)人發(fā)育程序。 都通過(guò)自己的實(shí)驗(yàn)誘導(dǎo)體細(xì)胞重編程成功。但是這些方法最大的缺點(diǎn)就是供卵缺乏、倫理道德及政府法規(guī)的限制等。因此科學(xué)家們努力尋求從法律、道德和倫理等方面更易被人們接受的體細(xì)胞核重編程的方法。 細(xì)胞核移植和干細(xì)胞這兩個(gè)各自迷人的領(lǐng)域，在 2006 年發(fā)生了非常引人注目的碰撞。一些重大的發(fā)現(xiàn)為這次事件鋪平了道路。正如兩棲動(dòng)物中一樣，細(xì)胞核移植進(jìn)入小鼠卵母細(xì)胞后表明體細(xì)胞核重編程成為多能肽。 2006 年 8 月，通過(guò)對(duì)卵母細(xì)胞和胚胎干細(xì)胞中涉及細(xì)胞重編 程的細(xì)胞因子的深入分析和研究，日本科學(xué)家 究小組將 24 種轉(zhuǎn)錄因子排列組合導(dǎo)入小鼠成纖維細(xì)胞，最終確定有 4 種轉(zhuǎn)錄因子組合 可將成纖維細(xì)胞重編程為誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞(胞。它的誕生仿佛給沉寂一時(shí)的國(guó)際干細(xì) 2 胞研究打入了一劑強(qiáng)心劑 1。 入 胞的外源轉(zhuǎn)錄因子 通過(guò)外源轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的誘導(dǎo)，使成體細(xì)胞重編程為胚胎干細(xì)胞 (胞 ) 樣 的多能細(xì)胞，這種細(xì)胞稱為誘導(dǎo)多能干細(xì)胞 (胞 )，這一方法被稱為 術(shù)。 胞除了不能生成胚胎以外，可以產(chǎn)生所有的細(xì)胞，如果用于醫(yī)療，那么理論上可以治愈所有疾病 凡是不好的組織都去除，替換為重新生長(zhǎng)的正常組織。它的功能幾乎可以和 胞 相媲美。 自從 胞涉及道德倫理的問(wèn)題以來(lái) ，科學(xué)家用其來(lái)產(chǎn)生新生組織的想法就一直不能實(shí)施。而 其突破倫理障礙的面貌改變大家對(duì)干細(xì)胞的看法，無(wú)疑， 偉大的發(fā)現(xiàn)，它讓科學(xué)家們可以更深入地了解我們的細(xì)胞。也讓干細(xì)胞從理論研究到臨床應(yīng)用的步伐加快了許 多，直接將病人的成體細(xì)胞改造成干細(xì)胞， 比再培育一個(gè)小孩取干細(xì)胞更符合倫理道德要求，也突破了移植排斥的障礙。 胞和 胞具有相同的基因。不同的是 胞中與細(xì)胞多能性有關(guān)的基因能夠表達(dá)，而這些因子就是 分化的細(xì)胞中這些基因不能表達(dá)。通過(guò)導(dǎo)入與多能性有關(guān)的外源基因來(lái)激活活體細(xì)胞中的多能性基因。從而使體細(xì)胞從分化狀態(tài)重編程為多能干細(xì)胞。 試驗(yàn)中所用 4 種轉(zhuǎn)錄因子在誘導(dǎo)過(guò)程中分別起不同作用： 族的轉(zhuǎn)錄因子 ,維持細(xì)胞的多能性 ,是體細(xì)胞誘導(dǎo)為 胞所必須的基因。在小鼠和人的 胞中 , 達(dá)的抑制將會(huì)導(dǎo)致自發(fā)性分化為滋養(yǎng)層細(xì)胞。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明 ,夠維持 胞未分化狀態(tài)并促進(jìn)其增殖 ,并認(rèn)為 活化是重編程為多能干細(xì)胞的標(biāo)志。 胚胎干細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子 ,其與 樣均為體細(xì)胞重編程所必須的基因 ,除了可與 同調(diào)節(jié)維持細(xì)胞的多能性之外 ,還能促進(jìn)干細(xì)胞向神經(jīng)外胚層分化。 是 胞形成所必須的基因 ,其作用是提高克隆形成的效率 ,當(dāng)同時(shí)將二者去除時(shí) 胞將不 能生成 胞 ,因此 胞產(chǎn)生的過(guò)程中同樣重要。 在人類癌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的卟啉 盡管 以提高 胞克隆形成率 ,但其構(gòu)建的嵌合體小鼠約 20%發(fā) 3 生了腫瘤。所以如果將 胞用于臨床治療 , 因的轉(zhuǎn)入必須慎重。是抑癌基因又是原癌基因 ,一方面可以促進(jìn) 胞的自我更新 ,另一方面在體細(xì)胞中強(qiáng)制表達(dá)可抑制 阻滯細(xì)胞周期于 期 ,因此它在細(xì)胞增殖和分化之間起開(kāi)關(guān)作用 2。 體細(xì)胞的選擇 術(shù)雖然在不同物種的多種細(xì)胞上 都取得了成功，但是不同的受體細(xì)胞、不同的細(xì)胞狀態(tài)及其傳代代數(shù)，對(duì)于誘導(dǎo)的效率，甚至誘導(dǎo)是否能取得成功都有一定的影響。因此，在實(shí)驗(yàn)之初需準(zhǔn)備符合要求的受體細(xì)胞。最初，研究者以胎鼠和成年小鼠的成纖維細(xì)胞為受體細(xì)胞進(jìn)行 導(dǎo)，雖然最終都得到了 胞，但是采用胎兒細(xì)胞進(jìn)行的誘導(dǎo)效率明顯要高一些。這可能是由于胎兒細(xì)胞增殖活力強(qiáng)，并且甲基化程度較低，易于重編程。隨后，以小鼠肝臟細(xì)胞、胃表皮細(xì)胞、胰腺細(xì)胞，甚至成熟的 B 淋巴細(xì)胞作為受體細(xì)胞進(jìn)行 導(dǎo)也都取得了成功，這充分說(shuō)明了 術(shù)的普遍適用性，也 證明了各類體細(xì)胞都具有被重編程為多能性細(xì)胞的潛能。研究發(fā)現(xiàn)不同類型細(xì)胞來(lái)源的 胞具有不同的特點(diǎn)，如肝臟細(xì)胞和胃上皮細(xì)胞來(lái)源的 胞其基因組不易被病毒整合，具有較低的致瘤性，更適合于醫(yī)學(xué)研究的需要。 也發(fā)現(xiàn)以角質(zhì)細(xì)胞作為受體細(xì)胞可顯著提高 誘導(dǎo)效率，并能降低病毒在受體細(xì)胞基因組上的整合。另外，神經(jīng)干細(xì)胞本身表達(dá)較高的內(nèi)源性 因子，當(dāng)采用 個(gè)因子時(shí)，也能產(chǎn)生較高效率的 胞。因此，神經(jīng)干細(xì)胞可以作為理想的受體細(xì)胞。不同受體細(xì)胞對(duì)于誘導(dǎo)效率的差異至今仍沒(méi) 有確切的解釋，但是從 導(dǎo)的過(guò)程可以認(rèn)為，這可能是由于不同受體細(xì)胞間的表觀遺傳修飾的差異引起的。不同細(xì)胞基因組的甲基化和乙?；潭雀鞑幌嗤?，誘導(dǎo)重編程過(guò)程中開(kāi)啟外源基因表達(dá)的要求也不一樣，如誘導(dǎo)過(guò)程中添加甲基化酶抑制劑可以明顯提高誘導(dǎo)的效率。同時(shí)，有的受體細(xì)胞自身也表達(dá)部分的誘導(dǎo)因子，這不僅可以減少外源基因的使用數(shù)量，同時(shí)也減輕了重編程的負(fù)擔(dān)，進(jìn)而可以得到較高的 導(dǎo)效率，且減少誘導(dǎo)的時(shí)間，例如神經(jīng)干細(xì)胞誘導(dǎo)為 胞。由于取材和培養(yǎng)簡(jiǎn)便，原代成纖維細(xì)胞仍然是導(dǎo)中最常用的受體細(xì)胞。 同時(shí)，為了確保受體細(xì)胞的增殖活力，盡可能使用低代數(shù) (35 代 ) 的原代細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo) 3。 4 1.2 胞的表觀遺傳學(xué) 誘導(dǎo)得到的 胞以相應(yīng)物種的 胞為參照標(biāo)準(zhǔn)，從分子、細(xì)胞和動(dòng)物個(gè)體水平對(duì)其進(jìn)行系統(tǒng)的檢測(cè)。包括其多能性細(xì)胞特異的標(biāo)志基因的表達(dá)情況，向 3 個(gè)胚層分化的潛能和自我更新能力，此外還涉及外源基因的沉默，及 確的遺傳背景。 子水平上 胞中導(dǎo)入的外源基因表達(dá)水平要隨著重編程的完成逐漸降低或沉默，內(nèi)源的多能性基因表達(dá)激活，基因的選擇以 胞表達(dá)的特 異性標(biāo)志為參照。如通過(guò) 測(cè) 基因的表達(dá)情況且此類基因在不同物種間的表達(dá)不完全相同，如小鼠的 般 陽(yáng)性， 陰性。而人的 胞則正好與之相反， 陰性， 陽(yáng)性。此外，為了明確 胞的永生化能力，還需檢測(cè)其端粒酶活性。 胞水平 多向分化潛能和體外自我更新的能力。所得到的 胞首先形態(tài)上要與 胞相類似，具體表現(xiàn)為細(xì)胞呈集落樣生長(zhǎng)、集落致密且邊緣整齊、細(xì)胞形態(tài)較小、核質(zhì)比高、增殖迅速、倍增時(shí)間短、能夠長(zhǎng)期傳代。 胞經(jīng) 色鑒定，要求呈陽(yáng)性，還需進(jìn)行多種轉(zhuǎn)錄因子及細(xì)胞表面標(biāo)志的免疫熒光染色及流式細(xì)胞技術(shù)的分選，如： 。完全重編程的 胞應(yīng)具有體外分化潛能，能夠分化為各個(gè)胚層的不同類型的細(xì)胞，如外胚層的神經(jīng)細(xì)胞、上皮細(xì)胞、軟骨細(xì)胞等；中胚層的肌肉細(xì)胞、脂肪細(xì)胞等；內(nèi)胚層的肝細(xì)胞、胰島細(xì)胞等。此外，還需檢測(cè) 胞 的核型情況，由于外源基因整合的隨機(jī)性，使誘導(dǎo)得到的 胞會(huì)有較高比例的核型異常，那些核型異常的 胞，應(yīng)予以剔除。 物水平 對(duì) 胞在免疫缺陷鼠 (如 鼠 ) 體內(nèi)進(jìn)行成瘤實(shí)驗(yàn)。將1 1065 106 胞注射到裸鼠的皮下，經(jīng)過(guò)一段時(shí)間的生長(zhǎng)，來(lái)觀察皮下畸胎瘤形成的變化。根據(jù)動(dòng)物來(lái)源的不同， 胞成瘤時(shí)間也不盡相同，如小鼠的 胞約在 1 個(gè)月左右能成瘤，但是豬的 胞需要 13 個(gè)月 5 時(shí)間才能成瘤。取出的瘤組織，經(jīng)切片檢測(cè)其是否發(fā)育 出 3 個(gè)胚層的各種組織。同時(shí)，在條件及倫理道德允許的情況下，還應(yīng)將 胞在相應(yīng)物種上進(jìn)行嵌合體實(shí)驗(yàn)，要求后代能夠真正生殖系嵌合。但與 胞類似，由于倫理道德等問(wèn)題的限制，這一指標(biāo)至今仍只在小鼠上獲得成功。最近有研究報(bào)道，小鼠 胞通過(guò)與四倍體囊胚嵌合，成功生下具有正常生殖能力的完全由胞發(fā)育而來(lái)的小鼠，這充分說(shuō)明了 胞具有發(fā)育為完整個(gè)體的能力。 1.3 胞的發(fā)展及應(yīng)用 成功建立 胞后，應(yīng)用 胞來(lái)治療疾病是人們的最終目標(biāo)。 ，還可以提供體外的疾病模型，以便于研究疾病形成的機(jī)制、篩選新藥以及開(kāi)發(fā)新的治療方法。 胞的分化和移植在治療血液疾病中的作用 胞誘導(dǎo)分化為內(nèi)皮前體細(xì)胞，然后移植到患有血友病小鼠的肝臟中，使病鼠出血不止的癥狀得到了有效地改善。 患病小鼠尾尖成纖維細(xì)胞重編程為 胞，然后通過(guò)同源重組的方法用人野生型蛋白基因替代了 蛋白基因，接著把遺傳修飾后的 胞定向分化為造血祖細(xì)胞 (并將純化后的 植入 性小鼠中，效地抑制了鐮刀形紅細(xì)胞貧血癥癥狀。 獲得了基因修飾后的貧血癥患者特異性 胞，這些 胞能夠分化形成表型正常的髓系和紅系的造血祖細(xì)胞。中內(nèi)啟光等研究人員在培養(yǎng) 胞時(shí)，添加人類骨髓細(xì)胞以及促進(jìn)細(xì)胞增殖的蛋白質(zhì)等物質(zhì)，結(jié)果 胞分化成了血小板的前身巨核細(xì)胞，巨核細(xì)胞進(jìn)一步分化成血小板。從技術(shù)上來(lái)說(shuō)，用 胞培育人類紅細(xì)胞和白細(xì)胞都是可能的。紅細(xì)胞體外培育的成功為人類研究通用紅細(xì)胞提供了新的契機(jī)。研究組正在努力用一種 0 型 性個(gè)體體細(xì)胞重編程為 胞，進(jìn)而對(duì)該 胞進(jìn) 行體外定向誘導(dǎo)分化，培育出通用紅細(xì)胞。 建立了一個(gè)從人 胞高效地分化成紅細(xì)胞的系統(tǒng)。如果將該系統(tǒng)應(yīng)用于患者特異性 胞上，就可獲得無(wú)限量的患者自身的紅細(xì)胞，這對(duì)于治療一些血液疾病以及為罕見(jiàn)血型患者提供血細(xì)胞有著重要意義。 胞還可治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病 6 將 胞分化為神經(jīng)前體細(xì)胞，然后把這些細(xì)胞移植入胎鼠腦中，它們可整合到受體鼠的腦中， 13 5 d 后形成神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元細(xì)胞，包括谷氨酰胺能神經(jīng)元、 神經(jīng)元、兒茶酚胺能神經(jīng)元細(xì)胞。將由小鼠 胞在 體外誘導(dǎo)分化來(lái)的多巴胺能神經(jīng)元移植進(jìn)帕金森病大鼠模型腦內(nèi)，一段時(shí)間后可有效緩解大鼠疾病癥狀和改善其行為。最近，利用帕金森癥患者的皮膚細(xì)胞培育出 胞后，又成功將其分化為多巴胺神經(jīng)元細(xì)胞，這是帕金森癥患者大腦中所缺少的一種重要細(xì)胞口。因此，其有望成為治療帕金森癥的一種方法。 胞也有望應(yīng)用于治療不孕癥 將人 胞體外分化并分離得到原始生殖細(xì)胞 ( 基因表達(dá)上與體內(nèi)分離的 為相似。如果能夠進(jìn)一步將這些 化為精子和卵子，就可幫助患者解決不孕問(wèn)題。 供體外的疾病模型 提供體外的疾病模型，以便于研究疾病形成的機(jī)制、篩選新藥以及開(kāi)發(fā)新的治療方法。 和 分別建立了肌萎縮側(cè)索硬化癥 (脊髓性肌萎縮 (者特異性 胞。通過(guò)定向誘導(dǎo)分化，將患者特異性的 胞成功分化成了運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元。這些由患者來(lái)源的 胞分化等的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元為人們提供了一個(gè)體外研究 病的系統(tǒng)。在研究清楚了 者運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的致病機(jī)制后，還可在患者特異的 胞中通過(guò)遺傳修飾來(lái)糾正基因缺陷，再分化得到功能正常 的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元，以進(jìn)行移植治療。此外， 和 建立了多種遺傳病患者特異性的 胞系，包括帕金森病、亨廷頓病、唐氏綜合征三染色體 21 等。 成功地以人血液細(xì)胞為體細(xì)胞供體，誘導(dǎo)出了 胞，使得構(gòu)建一些病癥突變只局限于血液細(xì)胞的患者特異性 胞成為可能。利用從罕見(jiàn)神經(jīng)系統(tǒng)疾病患者身上產(chǎn)生的干細(xì)胞，科學(xué)家們正在解析該種疾病的發(fā)病機(jī)制，并以此來(lái)測(cè)試若干候選藥物的療效。從家族性植物神經(jīng)功能不全癥 (有一個(gè)基因突變，該基因?qū)Φ鞍走M(jìn)行編碼，基因突變導(dǎo)致基因被轉(zhuǎn)譯成蛋 白時(shí)部分基因序列被跳過(guò) )患者身上獲取皮膚細(xì)胞，創(chuàng)建出 胞系，誘導(dǎo)為特定的細(xì)胞類型，如神經(jīng)嵴細(xì)胞 (它能產(chǎn)生受 響的神經(jīng)元 )。 7 這些細(xì)胞在分化成神經(jīng)元的能力上是具有缺陷的，其并不像培養(yǎng)皿中的正常細(xì)胞一樣容易遷移。研究人員利用此種差異來(lái)衡量 3 種藥物的療效，這幾種藥已被提議作為治療 候選藥物，其中一種藥物就是激動(dòng)素。這些患者特異性 胞令體外研究病變的人體組織的形成成為可能，從而有助于探索疾病形成機(jī)制以及研發(fā)特異性新藥。這些研究成果還表明將來(lái)有可能為患者量身定做各種細(xì)胞，進(jìn)行個(gè)性化治療。但是由 于對(duì)于細(xì)胞 (包括 胞、 胞和成體干細(xì)胞 )自我更新與分化等行為的調(diào)控機(jī)制知之甚少，目前人們還不能按照自己的意圖將干細(xì)胞在體外定向誘導(dǎo)分化為所需要的任何的功能細(xì)胞。隨著人類對(duì)干細(xì)胞分化調(diào)控機(jī)制認(rèn)識(shí)的不斷加深，從人 胞將會(huì)衍生出更多種類的人類細(xì)胞，將為細(xì)胞替代治療新藥篩選與評(píng)價(jià)及其他用途提供大量的細(xì)胞。 術(shù)方面的障礙 經(jīng)過(guò)了近 4 年既漫長(zhǎng)又短暫的發(fā)展 , 胞技術(shù)已經(jīng)取得了舉世矚目的進(jìn)展。一個(gè)個(gè)突破性的成果既給我們帶來(lái)了喜悅 , 也帶來(lái)了新的挑戰(zhàn) , 細(xì)胞重編程有望迎來(lái)一個(gè)新的研究 浪潮。盡管在 胞方面取得了如此大的成就，但是 胞的成功誘導(dǎo)比較復(fù)雜，誘導(dǎo)率比較低，科學(xué)家不依靠所謂的“基因搭載”也可以產(chǎn)生 胞， 4 種關(guān)鍵因子現(xiàn)在已作為蛋白質(zhì)注射被應(yīng)用。然而這種方法的效果還是很低，平均 1 萬(wàn)個(gè)普通細(xì)胞只有 1 個(gè)能變成 胞，少數(shù)獲得的 胞還必須從細(xì)胞混合物中進(jìn)行分離，整個(gè)過(guò)程至少需要 3 周至 4 周。因此誘導(dǎo)效率一直是科學(xué)界的難題，要想將 胞進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)就必須首先解決其誘導(dǎo)率問(wèn)題。 來(lái)自不同國(guó)家的 5 個(gè)科研小組同時(shí)報(bào)告了相關(guān)進(jìn)展，其中包括最先培育出胞的日本科學(xué)家山中伸彌的科研小組?？茖W(xué)家發(fā)現(xiàn)，通過(guò)阻斷一個(gè)名為“ 的基因的路徑，可以將皮膚細(xì)胞轉(zhuǎn)化為 胞的成功率提高至 10左右，是原有轉(zhuǎn)化率的大約百倍 。從而看出只要用合適的方法阻斷 因（ 位于 17 號(hào)染色體短臂上 (長(zhǎng) 16 20 11 個(gè)外顯子組成，編碼著393 個(gè)氨基酸組成的核磷酸蛋白，因其分子量為 53得名 。）的表達(dá)，就可大大提高 胞的轉(zhuǎn)化 . 這樣有針對(duì)性地使一定的 段開(kāi)啟或關(guān)閉是一個(gè)重要機(jī)制，可以控制體細(xì)胞不同的功能，并使每個(gè)細(xì)胞適用 序的 8 變化。但是 有抑制細(xì)胞癌變、阻止腫瘤生長(zhǎng)的作用，因此在通過(guò)阻斷“ 路徑提高 胞轉(zhuǎn)化率時(shí)， 腫瘤發(fā)生幾率就會(huì)大大增加，因而，采用這種方法存在著很大的風(fēng)險(xiǎn)。而且阻斷 因路徑的方法復(fù)雜。 為了避免病毒和外源基因?qū)Φ玫降?胞產(chǎn)生的影響，研究者直接采用以上 4 個(gè)轉(zhuǎn)錄因子的蛋白質(zhì)對(duì)受體細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)。但是由于蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)不 穩(wěn)定，不能持續(xù)作用，因此需要對(duì)受體細(xì)胞進(jìn)行多次的蛋白處理。 采用隔天多次將受體細(xì)胞與外源蛋白進(jìn)行共培養(yǎng)的方法，通過(guò)特定的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)肽將其運(yùn)送至受體細(xì)胞核內(nèi)發(fā)揮作用，通過(guò) 4 輪蛋白因子的處理，再結(jié)合 輔助，才最終成功誘導(dǎo)得到 隆。而 則采用穩(wěn)定表達(dá)四因子融合蛋白的 胞的裂解產(chǎn)物誘導(dǎo)人成纖維細(xì)胞，可最初連續(xù) 6 d 的誘導(dǎo)處理卻引起受體細(xì)胞的死亡；隨后通過(guò) 16 h 的蛋白誘導(dǎo)處理與新鮮培養(yǎng)液培養(yǎng) 6 d 相結(jié)合，進(jìn)行反復(fù) 6 輪誘導(dǎo)之后才最終得到了 隆。蛋白質(zhì)分子誘導(dǎo) 胞的效率極低，且所需時(shí)間很長(zhǎng)。因此，這種方法可行性很低 3。 體細(xì)胞胞與 胞相比處于更高的甲基化狀態(tài)。我們可以通過(guò)在轉(zhuǎn)化過(guò)程中抑制體細(xì)胞的甲基化來(lái)提高的 胞的誘導(dǎo)效率。通過(guò)查閱文獻(xiàn)了解到小分子化合物 2 5以抑制基因組的甲基化狀態(tài)，提高其誘導(dǎo)率，且它們來(lái)源廣泛、操作簡(jiǎn)單，為我們研究提高 胞誘導(dǎo)率提供充分的理論依據(jù)。 2、促進(jìn) 胞誘導(dǎo)率的 小分子化合物 中文別名 :2,2正丙基乙酸 ,二丙基乙酸 , 4分子式： 子量 狀： 無(wú)色液體 、 極微溶于水 、 相對(duì)密度 (沸點(diǎn) 221 、128 130 ( 折光率 (低毒，半數(shù)致死量 (大鼠，經(jīng)口 )670mg/有腐蝕性。 其分子式如圖 1 所示。 圖 1 9 白色針狀結(jié)晶，溶于水，在酸和堿中易水解 。其分子式如圖 2 為 圖 2 51210、 鼠淋巴細(xì)胞白血病和 均有明顯抗腫瘤作用，是主要作用于 S 期周期特異性藥。其抗腫 瘤作用與其他嘧啶類拮抗劑不同，與嘧啶核苷酸代謝并無(wú)關(guān)系，而是以偽代謝物身份替代胞嘧啶 摻入 擾 生理功能而產(chǎn)生細(xì)胞毒作用及抗腫瘤作用。近年來(lái)更注意到氮雜胞苷可 摻入 基化過(guò)程。許多基因的轉(zhuǎn)錄功能與嘧啶以甲基化狀態(tài)密切相關(guān)，在整個(gè)細(xì)胞分裂過(guò)程中，通過(guò)甲基轉(zhuǎn)移酶的作用，這種甲基化作用始終保持無(wú)缺，氮雜胞苷由于可 摻入 制 基化，因此影響基因的表達(dá)及分化 4。但是氮雜胞苷并不是影響所有基因的表達(dá)，而是對(duì)某些基因的表達(dá)有影響，對(duì)另外一些基因的表達(dá)則無(wú)影響 。 3 總結(jié) 本設(shè)計(jì)研究的價(jià)值 隨著社會(huì)的發(fā)展，人們生活水平的的不斷提高，人們對(duì)健康的重視程度越來(lái)越深入然而，面對(duì)許多疾病，科學(xué)家們也束手無(wú)策。這時(shí) 胞的出現(xiàn)讓全世界人民臉上都露出了燦爛的笑容。 胞研究成果在干細(xì)胞和發(fā)育生物學(xué)研究領(lǐng)域中無(wú)疑具有里程碑意義，其在短時(shí)間內(nèi)取得了一系列突破，可以預(yù)見(jiàn)，有朝一日， 胞必將應(yīng)用于臨床，解決人類面臨的各種疾患等，獲得安全、高效、實(shí)用、有臨床應(yīng)用價(jià)值的治療型 胞。 胞的研究使我們無(wú)需毀滅胚胎就可以得到類 0 細(xì)胞，這樣就回避了長(zhǎng)期以來(lái)人們對(duì)人類胚胎使用 問(wèn)題的倫理問(wèn)題，為干細(xì)胞的研究、新藥篩選及藥物毒理研究和再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域提供了新方法和新技術(shù)，并是以后獲得患者自身遺傳背景的胚胎干細(xì)胞的重要途徑之一，也是研究人類疾病機(jī)理的重要方法之一，對(duì)將來(lái)的醫(yī)學(xué)研究有著巨大的理論意義和實(shí)用價(jià)值。胞可能成為人類各種疾病細(xì)胞移植的一個(gè)資源，為人類疾病治療帶來(lái)了新的希望和契機(jī)，其研究的最終目的是應(yīng)用于臨床進(jìn)行自體細(xì)胞治療，現(xiàn)在很多人都非常期待 胞能盡早應(yīng)用于多種疾病的臨床治療，如 1 型糖尿病、帕金森綜合征、脊髓損傷及慢性肝病等。 目前， 胞的應(yīng)用取得了令人矚目的 進(jìn)展。但是， 胞的誘導(dǎo)率很低，怎樣提高 胞的誘導(dǎo)率是許多研究人員共同面臨的問(wèn)題。只有進(jìn)一步闡明 胞產(chǎn)生的機(jī)制，成功地誘導(dǎo)出疾病特異性 胞，改善 胞的質(zhì)量，提高誘導(dǎo)率，降低致瘤性，才能有助于推動(dòng) 胞的臨床應(yīng)用向前發(fā)展。 本課程設(shè)計(jì)從 胞比 胞甲基化程度高著手，研究提高 胞誘導(dǎo)率的方法。通過(guò)從作用機(jī)制、藥品來(lái)源、操作難易程度以及誘導(dǎo)后有無(wú)副作用幾方面進(jìn)行分析，選取了 2 5前暫無(wú)人使用此法研究 胞 誘導(dǎo)，希望本設(shè)計(jì)能 胞的高效率誘導(dǎo)提供一條可行性途徑。 11 第二部分 課程設(shè)計(jì)部分 2 5胞誘導(dǎo)率的影響 胞的問(wèn)世，將干細(xì)胞研究推進(jìn)到了一個(gè)新的高度，極大豐富了干細(xì)胞的研究?jī)?nèi)容。它由體細(xì)胞導(dǎo)入外源轉(zhuǎn)錄因子重編程誘導(dǎo)而來(lái)，與 胞在功能、形態(tài)上基本一致。它除了生成胚胎以外，可以產(chǎn)生所有的細(xì)胞，如果用于醫(yī)療，理論上可以治愈所有疾病 凡是不好的組織都去除，替換為重新生長(zhǎng)的正常組織。它避免了 胞所遇到的免疫排斥和倫理道德問(wèn)題，因此可作為胚胎干細(xì)胞最好 的替代品用于科學(xué)研究和臨床治療，由于多潛能性干細(xì)胞的多向分化潛能和自我更新的特性 , 使其在細(xì)胞替代治療、基因治療、發(fā)育生物學(xué)研究、藥理及毒理學(xué)等領(lǐng)域的研究中有著其獨(dú)特的作用和優(yōu)越性，使干細(xì)胞研究向前邁進(jìn)了一大步 5。近幾年， 胞像初升的太陽(yáng)一樣正在冉冉升起，在 胞方面研究的成果不斷被公布出來(lái)包括體外疾病模型建立、藥物篩選、細(xì)胞替代治療等。在 胞的應(yīng)用取得了令人矚目的成就時(shí)，橫跨在科學(xué)界的一大障礙卻始終沒(méi)有被排除，它就是 胞的誘導(dǎo)率問(wèn)題。每萬(wàn)個(gè)細(xì)胞中只有一個(gè)可以被成功誘導(dǎo)，這給 胞的大規(guī)模生產(chǎn)帶來(lái)了阻礙。體細(xì)胞比 胞處于更高的甲基化狀態(tài)，在 胞有誘導(dǎo)的過(guò)程中加入小分子化合物 2 5接提高受體細(xì)胞被誘導(dǎo)的效率 3。目前 ,關(guān)于 胞誘導(dǎo)率研究的報(bào)道還很少。本設(shè)計(jì)把這兩種物質(zhì)聯(lián)合來(lái)進(jìn)行 胞誘導(dǎo)，尚屬首例，填補(bǔ)了無(wú)人著重研究使用小分子化合物進(jìn)行 胞誘導(dǎo)的空白。本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)在進(jìn)行 胞誘導(dǎo)的培養(yǎng) 12 基中分別加入不同劑量的小分子化合物 2 5期通過(guò)實(shí)驗(yàn)得到 2 5胞苷以及二者的混合物對(duì) 胞誘導(dǎo)的影響，以尋求提高 胞誘導(dǎo)率的最佳途徑。 1 材料 鼠 攜帶有 基因的小鼠，購(gòu)自南京大學(xué)。不帶轉(zhuǎn)基因的小白鼠由本實(shí)驗(yàn)室提供。 胞株、質(zhì)粒 細(xì)胞株、質(zhì)粒 廠商 美國(guó) 國(guó) 國(guó) 國(guó) c 國(guó) E 細(xì)胞、 上海生命 科學(xué)研究院 試劑 廠商 染試劑 司 培養(yǎng)液 司 胰酶 司 非必需氨基酸 司 青霉素 /鏈霉素 司 司 司 司 胎牛血清 司 白血病抑制因子 司 上海源葉生物科技有限公司 堿性磷酸酶（ 上海如吉生物科技發(fā)展有限公 司 2國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司 5拓新集團(tuán) 要器材 13 儀器 廠商 型號(hào) 高速臺(tái)式低溫離心機(jī) 德國(guó) 濕度 胞培養(yǎng)箱 美國(guó) 熒光顯微鏡 日本 600 6 孔板 北京耀北生物技術(shù)公司 自動(dòng)數(shù)字天平 自動(dòng)高壓消毒鍋 日本 方法 胞培養(yǎng)基的制備 養(yǎng)基的制備 按照 88%培養(yǎng)液， 10%胎牛血清， 1 %青霉素 /鏈霉素， 1%非必需氨基酸的量進(jìn)行 混合，用 m 濾膜過(guò)濾后于 4 保存。 胞培養(yǎng)基的制備 按照 80%培養(yǎng)液， 15%胎牛血清， 1 % 1%非必需氨基酸， 1 % 1 %青霉素 /鏈霉素， 1% 1 000 血病抑制因子 的量進(jìn)行混合，用 m 濾膜過(guò)濾后于 4 保存。 養(yǎng)層細(xì)胞的制備 制備 處死妊娠 13.5 d 的攜帶有 基因的母鼠，用無(wú)菌手術(shù)器械剖腹取出胚胎，用 洗。去除胚胎的頭部、尾部、內(nèi)臟及四肢。軀干部分用 洗干凈。將組織塊剪碎，移入 50 心管中，加入 胰酶于 37 消化 20 到出現(xiàn)大量單細(xì)胞，加入 養(yǎng)基終止，吹打后制成細(xì)胞懸液。將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)入 100 養(yǎng)皿中，補(bǔ)加適量 養(yǎng)基。來(lái)回晃動(dòng)培養(yǎng)皿后，置于 37 細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。待細(xì)胞長(zhǎng)滿時(shí)將其凍存。 養(yǎng)層細(xì)胞的制備 養(yǎng)層細(xì)胞的制備處理方法大致同 是所用的小白鼠并非為轉(zhuǎn)基因鼠。 射線照射滅活后作為飼養(yǎng)層細(xì) 胞使用。 導(dǎo)產(chǎn)生 胞 14 將質(zhì)粒 ( c 分別通過(guò) 染試劑 轉(zhuǎn)染 E 細(xì)胞，次日換液，并于 48 h 后收取逆轉(zhuǎn)錄病毒液，經(jīng) m 濾膜過(guò)濾后待用，對(duì)應(yīng)的 5 種病毒液分別記為 G， O， S， K， M。 O， S， K， M 以 1 1 1 1 比例感染 感染后第 4 天，將細(xì)胞用胰酶消化，計(jì)數(shù)后將其鋪至培養(yǎng)有養(yǎng)層細(xì)胞的 6 孔板，密度為每孔 5 104 個(gè)細(xì)胞 。 至飼養(yǎng)層細(xì)胞上之后每天更換 養(yǎng)基。分別在感染后第 12 天和第 16 天對(duì) 胞誘導(dǎo)效率檢測(cè)。 2.4 胞誘導(dǎo)率的測(cè)定 染病毒后第 12 天， 6 孔板用于堿性磷酸酶染色( 色 )， 性克隆比率越高， 性細(xì)胞比例越高，則表示胞誘導(dǎo)效率越高。據(jù) 色結(jié)果，將 性克隆的個(gè)數(shù)除以原始接種的 胞數(shù)目，可以得到的 性克隆比率即為 胞系的鑒定 從誘導(dǎo)產(chǎn)生的 隆中選取 性克隆進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，建立起 胞系，并對(duì) 胞系進(jìn)行鑒定。鑒定主要包括如下兩個(gè)方面 : (1)用熒光顯微鏡檢測(cè) 胞系的 達(dá)情況 ; ( 2) 用堿性磷酸酶染色檢測(cè) 胞系是否處于未分化狀態(tài)。 色熒光蛋白表達(dá)檢測(cè) 用熒光顯微鏡對(duì)所建立的 胞系進(jìn)行 達(dá)檢測(cè)。誘導(dǎo)后的 明它可以長(zhǎng)期保持未分化狀態(tài)。此外，這些 胞呈克隆狀生長(zhǎng)，克隆內(nèi)部 細(xì)胞均質(zhì)，單個(gè)細(xì)胞核質(zhì)比高，克隆形態(tài)和胚胎干細(xì)胞相似。 性磷酸酶染色鑒定 堿性磷酸酶染色鑒定小鼠 胞和 胞都表達(dá)堿性磷酸酶 ( 的活性，除牛的 胞不表達(dá) 活性外，其它動(dòng)物和人的 胞都表達(dá) 15 活性，分化的 胞不表達(dá)，所以 活性可作為鑒定 胞是否分化的一個(gè)標(biāo)志。本文采用 色法對(duì) 胞系 1 進(jìn)行鑒定，結(jié)果顯示幾乎整個(gè) 落都呈現(xiàn)很強(qiáng)的堿性磷酸酶活性，具備 胞的多能性特征，證明 1 處 于未分化狀態(tài)。 3 設(shè)計(jì) 胞苷 對(duì) 胞誘導(dǎo)率的影響 將細(xì)胞用胰酶消化，計(jì)數(shù)后將其鋪至培養(yǎng)有 養(yǎng)層細(xì)胞的 6 孔板中，在其中五孔中分別加入 分子化合物5第六個(gè)孔不加如小分子化合物，用來(lái)做對(duì)照。誘導(dǎo)完之后，分別計(jì)算出每個(gè)孔中 胞的轉(zhuǎn)化率。從而得出 5 胞誘導(dǎo)率最高時(shí)的劑量，判斷它的影響程度。 胞誘導(dǎo)率的影響 將細(xì)胞用胰酶消化，計(jì)數(shù)后將其鋪至培養(yǎng)有 養(yǎng)層細(xì)胞的 6 孔板中，在其中五孔中分別加入 分子化合物 2第六個(gè)孔不加如小分子化合物，用來(lái)做對(duì)照。誘導(dǎo)完之后，分別計(jì)算出每個(gè)孔中 胞的轉(zhuǎn)化率。從而得出 2 胞誘導(dǎo)率最高時(shí)的劑量，判斷它的影響大小。 5 胞苷 共同對(duì) 胞誘導(dǎo)率的影響 將細(xì)胞用胰酶消化，計(jì)數(shù)后將其鋪至培養(yǎng)有 養(yǎng)層細(xì)胞的 6 孔板中，在其中五孔中分別以 1:1、 1:2、 2:1、 3:1 小分子化合物 25 胞苷 的混合物，經(jīng)過(guò)培 養(yǎng)誘導(dǎo)，分別計(jì)算出分別計(jì)算出每個(gè)孔中 胞的轉(zhuǎn)化率。從而顯示出 2 5怎樣比例混合對(duì) 胞誘導(dǎo)率的影響最大。 4 分析與總結(jié) 胞誘導(dǎo)率的影響 5摻入 基化過(guò)程。許多基因的 16 轉(zhuǎn)錄功能與嘧啶以甲基化狀態(tài)密切相關(guān)，在整個(gè)細(xì)胞分裂過(guò)程中，通過(guò)甲基轉(zhuǎn)移酶的作用，這種甲基化作用始終保持無(wú)缺，氮雜胞苷由于可摻入 制 基化，因此影響基因的表達(dá)及分化。而體細(xì)胞與 胞的區(qū)別之處正在于，體細(xì)胞具有高的甲基化狀態(tài)，而不能表 現(xiàn) 胞的多能分化的特點(diǎn)，能得出 5胞的誘導(dǎo)率。本設(shè)計(jì)中 5基化的功能，設(shè)計(jì)不同的劑量對(duì) 胞的誘導(dǎo)率的影響， 定出 胞的轉(zhuǎn)化率，并通過(guò)堿性磷酸酶染色鑒定 、綠色熒光蛋白表達(dá)檢測(cè)對(duì) 胞系進(jìn)行純度鑒定。從而判斷出最適的劑量。 胞誘導(dǎo)率的影響 2胞的誘導(dǎo)率，其作用機(jī)理可能也是抑制 還不是很明確。本設(shè)計(jì)通過(guò)與 比能得出 25適劑量時(shí)，哪種物質(zhì)對(duì) 胞的誘導(dǎo)率貢獻(xiàn)更大。 5胞誘導(dǎo)率的影響 25胞的誘導(dǎo)率，把他們摻在一起誘導(dǎo) 胞生成。誘導(dǎo)完成之后， 定出 胞的轉(zhuǎn)化率，并通過(guò)堿性磷酸酶染色鑒定 、綠色熒光蛋白表達(dá)檢測(cè)對(duì) 胞系進(jìn)行純度鑒定，從而判斷出他們能否具有協(xié)同作用。以尋求出誘導(dǎo)小鼠成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化為 本設(shè)計(jì)通過(guò) 種小分子分別在最適劑量時(shí)誘導(dǎo)小鼠成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化為 胞的誘導(dǎo)率，從而判斷在誘導(dǎo) 胞時(shí)，哪種小分子作用更有效。通過(guò) 以的得到它們摻在一起誘導(dǎo)的效率。通過(guò)這三組實(shí)驗(yàn)的對(duì)比，得到 25胞的誘導(dǎo)率高，以及共同作用時(shí)對(duì) 胞的誘導(dǎo)效率高。從而，為提高 胞的誘導(dǎo)率提供可行性方案。 5 課程設(shè)計(jì)心得 本次課程設(shè)計(jì)我的題目定位 2 5胞誘導(dǎo)率的影響。我們進(jìn)行了三周的課設(shè)，這段時(shí)間里我們緊張的為 它忙碌著。但是， 17 收獲了很多，很充實(shí)。 首先，在設(shè)計(jì)之初我腦中的初步模型是研究器官、組織再生。通過(guò)查閱很多的文獻(xiàn)資料，我對(duì) 胞產(chǎn)生了極大地興趣。 胞因其生物學(xué)、醫(yī)學(xué)等方面廣泛的應(yīng)用前景在誘導(dǎo)成功后只有四年的時(shí)間里，各項(xiàng)成果不斷被推起。從而也證明的它的價(jià)值。因此，我決定著手于 胞的研究。通過(guò)大量的閱讀關(guān)于 胞的文獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)了一個(gè)重要的問(wèn)題。盡管 胞已經(jīng)取得了許多令人矚目的成就，而且有很廣闊的應(yīng)用前景。但是，它的誘導(dǎo)率確是科學(xué)界的一大障礙。因而，我選擇了對(duì)其 胞誘導(dǎo)率的研究。在反 復(fù)的查看文獻(xiàn)之后，發(fā)現(xiàn)了 2 5 胞苷 這兩種小分子化合物可以對(duì) 胞的成功誘導(dǎo)起促進(jìn)作用。經(jīng)過(guò)與同學(xué)們的探討把題目定了下來(lái)。 然后，在設(shè)計(jì)過(guò)程中遇到了很多問(wèn)題，由于 胞研究的時(shí)間按短，所以有關(guān)這方面的文獻(xiàn)很少，而關(guān)于其誘導(dǎo)率的文獻(xiàn)更少。但是，通過(guò)深入的思考以及與同學(xué)們的共同研究，確定了整體設(shè)計(jì)思路。在書(shū)寫(xiě)論文的過(guò)程中出現(xiàn)了很多細(xì)微的錯(cuò)誤，比如：格式、字體等等。經(jīng)過(guò)幾遍的再查以及同學(xué)復(fù)查之后，形成了最后的論文。 最后，在課設(shè)的過(guò)程中，我學(xué)到了很多：將