DB地方標(biāo)準(zhǔn)--DB33T 455—2003 動物毛發(fā)中鹽酸克倫特羅殘留的檢測方法.doc

db/t 2003浙江省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局 發(fā)布2003-11-08實施2003-10-23發(fā)布動物毛發(fā)中鹽酸克倫特羅殘留的檢測方法the analysis of clenbuterol hydrochloride in animal hairdb33/t 4552003db33浙江省地方標(biāo)準(zhǔn)ics 71.040g 04備案號：14770-20041db33/t 4552003前 言本標(biāo)準(zhǔn)由嘉興市衛(wèi)生監(jiān)督所提出并歸口。本標(biāo)準(zhǔn)由嘉興市衛(wèi)生監(jiān)督所、浙江省疾病預(yù)防控制中心、浙江省畜產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測中心、嘉興市疾病預(yù)防控制中心負(fù)責(zé)起草。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：吳小龍、吳平谷、宣士榮、葛志堅、鄒忠明、 汪剛、王明龍、吳新民。i動物毛發(fā)中鹽酸克倫特羅殘留的檢測方法1 范圍 本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了以酶聯(lián)免疫吸附（elisa）法和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（gc/ms）法測定動物毛發(fā)中鹽酸克倫特羅的方法，規(guī)定氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法為仲裁法。 本方法適用于動物毛發(fā)中鹽酸克倫特羅殘留量的測定與仲裁。2 規(guī)范性引用文件下列文件中的條款通過本標(biāo)準(zhǔn)的引用而成為本標(biāo)準(zhǔn)的條款。凡是注日期的引用文件，其隨后所有的修改單（不包括勘誤的內(nèi)容）或修訂版均不適用于本標(biāo)準(zhǔn)，然而，鼓勵根據(jù)本標(biāo)準(zhǔn)達(dá)成協(xié)議的各方研究是否可使用這些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本適用于本標(biāo)準(zhǔn)。db33/t 307-2001 可食性動物組織中鹽酸克倫特羅殘留量的檢測方法db33/t 308-2001 飼料中鹽酸克倫特羅含量的檢測方法db33/t 309-2001 動物尿液中鹽酸克倫特羅殘留量的檢測方法3 酶聯(lián)免疫吸附法3.1 原理利用固相酶聯(lián)免疫吸附原理，將鹽酸克倫特羅特異性抗體(羊抗兔igg )包被于聚苯乙烯微量反應(yīng)板中，加入毛發(fā)提取液、鹽酸克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)品、酶標(biāo)記物、鹽酸克倫特羅抗體于微孔中，使毛發(fā)提取液（未知抗原）和酶標(biāo)記物中的鹽酸克倫特羅抗原（已知抗原）與抗體進(jìn)行免疫競爭反應(yīng)，未反應(yīng)的酶記標(biāo)物在洗滌中被清除，結(jié)合了的酶可以由顯色物顯示出來。用目測法或酶標(biāo)法來判斷。顯色的強弱與樣品中的鹽酸克倫特羅濃度成反比。3.2 試劑和材料以下所用的試劑和水，除特別注明者外均為分析純試劑，水為重蒸水。3.2.1 鹽酸克倫特羅固相酶聯(lián)免疫試劑盒（德國 r-biopharm公司或類似產(chǎn)品）。3.2.1.1 預(yù)包被微孔條。 3.2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)品（6瓶300l/瓶，濃度分別為0ppt、100ppt、300ppt、900ppt、2700ppt、8100ppt ）。3.2.1.3 鹽酸克倫特羅酶標(biāo)記物。3.2.1.4 鹽酸克倫特羅抗體。3.2.1.5 基質(zhì)液。3.2.1.6 終止液。 3.2.1.7 緩沖液。3.2.2 1%吐溫-80、體積分?jǐn)?shù)為3%乙醇/乙酸乙酯、體積分?jǐn)?shù)為5%乙醇/乙酸乙酯、乙酸乙酯、50%鹽酸、1mol/l氫氧化鈉、飽和氯化鈉、體積分?jǐn)?shù)為50%乙醇/乙酸乙酯。3.2.3 鹽酸克倫特羅slh凈化柱（1000mg/5ml，slh小柱為商品名，給出這一信息是為了給本行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的使用者提供方便，而不是標(biāo)準(zhǔn)主管部門對這一產(chǎn)品的認(rèn)可）或同等效果的凈化柱。3.3 設(shè)備與器材3.3.1 酶標(biāo)儀。3.3.2 洗板機。3.3.3 離心機（3000 r/min -4000r/min）。3.3.4 超聲清洗儀。3.3.5 振蕩器。3.3.6 水浴鍋。3.3.7 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀。3.4 樣品處理3.4.1 清洗：取毛發(fā)加1%吐溫-80溶液在超聲清洗儀中洗滌20min，然后用蒸餾水沖洗干凈，用濾紙吸干；將毛發(fā)在50干燥2h，放在干燥器中待測。3.4.2 水解：將毛發(fā)剪碎混合均勻，準(zhǔn)確稱取0.1，加入mol/l氫氧化鈉溶液ml，在80水浴中保溫h后冷卻。3.4.3 萃?。涸谒庖褐屑觤l飽和氯化鈉溶液，用50鹽酸調(diào)節(jié)至10左右，加ml乙酸乙酯振蕩，離心分出乙酸乙酯相，乙酸乙酯相用氮氣吹干。3.4.4 凈化：加2l體積分?jǐn)?shù)為3%乙醇/乙酸乙酯溶液溶解剩余物，移到預(yù)先用體積分?jǐn)?shù)為3乙醇/乙酸乙酯溶液淋洗的鹽酸克倫特羅slh凈化柱上，然后用ml體積分?jǐn)?shù)為5%乙醇/乙酸乙酯溶液洗脫除雜，最后用10ml體積分?jǐn)?shù)為50%乙醇/乙酸乙酯溶液洗脫，收集該洗脫液，用氮氣吹干。用水4ml溶解剩余物，待測。3.5 測定（或參考類似產(chǎn)品說明書）將試劑盒各組分取出，平衡至室溫(20-25)。3.5.1 以1：11的比例吸取鹽酸克倫特羅抗體加入到緩沖液中，待用。3.5.2 以1：11的比例吸取鹽酸克倫特羅酶標(biāo)記物加入到緩沖液中，待用。3.5.3 每孔加入已稀釋鹽酸克倫特羅抗體100l，15min后洗板。3.5.4 分別加入標(biāo)準(zhǔn)品、待測樣品(標(biāo)準(zhǔn)品和樣品做兩孔平行試驗)各20l。3.5.5 每孔加入已稀釋鹽酸克倫特羅酶標(biāo)記物 100l，30min后洗板。3.5.6 加入100l基質(zhì)液避光顯色15min，加入終止液100l。3.5.7 酶標(biāo)儀450nm測定。3.6 結(jié)果計算3.6.1 計算每個標(biāo)準(zhǔn)品和樣品平均吸光度值。3.6.2 每個標(biāo)準(zhǔn)品和樣品平均吸光度值除以0ppt的吸光度值再乘以100。以標(biāo)準(zhǔn)品的百分比形式的吸光度值為縱座標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為橫座標(biāo)，繪成一個半對數(shù)座標(biāo)系統(tǒng)曲線圖，相對應(yīng)每一個樣品的相對濃度（g/kg）可以以樣品平均吸光度值從曲線上查出，乘以樣品稀釋倍數(shù)，即為其實際濃度。3.7 檢測限本方法的檢測限: 8.0g/kg 。4 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（仲裁法） 4.1 原理毛發(fā)樣品經(jīng)過堿水解，然后用乙酸乙酯提取；提取液濃縮后經(jīng)slh柱凈化，凈化洗脫液經(jīng)過雙三甲基甲硅烷三氟乙酰胺（bstfa）+1%（）三甲基氯硅烷（tmcs）衍生，然后用gc/ms法測定。4.2 試劑和材料以下所用的試劑和水，除特別注明者外均為分析純試劑，水為重蒸水。4.2.1 鹽酸克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)品。4.2.2 1%吐溫-80、體積分?jǐn)?shù)為3%乙醇/乙酸乙酯、體積分?jǐn)?shù)為5%乙醇/乙酸乙酯、50%鹽酸、1mol/l氫氧化鈉、飽和氯化鈉、體積分?jǐn)?shù)為50%乙醇/乙酸乙酯、乙醇、甲醇、甲苯、乙酸乙酯、鹽酸、氫氧化鈉、濃氨水、無水硫酸鈉。4.2.3 bstfa+1%（）tmcs。4.2.4 slh凈化柱（1000mg/5ml）或同等效果的凈化柱。4.2.5 美托洛爾（metoprolol）內(nèi)標(biāo)：使用時用甲醇配成10g/ml溶液。4.2.6 4% （）氨化甲醇：取4ml濃氨水，用甲醇定容至100ml。4.2.7 克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液（100mg/l）：稱取11.3mg 鹽酸克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)品于100ml容量瓶中，用4%氨化甲醇溶解并定容至刻度，存放于4冰箱中備用。4.3 設(shè)備與器材4.3.1 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀。4.3.2 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀。4.3.3 超聲清洗儀。4.4 實驗條件 4.4.1 色譜條件色譜柱：hp5ms5%苯基甲基聚硅氧烷彈性石英毛細(xì)管柱(30m0.25 mm0.25m)；進(jìn)樣口溫度300，柱溫程序：初溫120，保持3min，然后以10min升至230，保持10min，再以20min升至270保持10min。載氣為高純氦氣（99.999%），流速0.9ml/min，不分流進(jìn)樣。4.4.2 質(zhì)譜條件ei源，源溫230；電子能量70ev；接口溫度280；電子倍增器電壓1388v；質(zhì)量掃描范圍35 u350u；選擇離子監(jiān)測方式（sim）；鹽酸克倫特羅監(jiān)測離子（m/z ）：86、243、262、333美托洛爾監(jiān)測離子（m/z ）：72。溶劑延遲：5min。 4.5 樣品處理 4.5.1 取毛發(fā)加1%吐溫-80溶液在超聲清洗儀中洗滌20min，然后用蒸餾水沖洗干凈，用濾紙吸干；將毛發(fā)在50干燥2小時，放在干燥器中待測。將毛發(fā)剪碎混合均勻，準(zhǔn)確稱取0.2 g -1.0g，加入 1mol/l氫氧化鈉溶液2ml，在80水浴中保溫1h后冷卻。在水解液中加1ml飽和氯化鈉溶液，用50%鹽酸調(diào)節(jié)ph至10左右，然后加5ml乙酸乙酯振蕩，離心分出乙酸乙酯相，乙酸乙酯相過無水硫酸鈉，用氮氣吹干。加2ml體積分?jǐn)?shù)為3%乙醇/乙酸乙酯溶液溶解剩余物，移到預(yù)先用體積分?jǐn)?shù)為3%乙醇/乙酸乙酯溶液淋洗的slh凈化柱上，然后用 5ml體積分?jǐn)?shù)為5% 乙醇/乙酸乙酯溶液洗脫除雜，最后用10ml體積分?jǐn)?shù)為50%乙醇/乙酸乙酯溶液洗脫，收集該洗脫液，加美托洛爾內(nèi)標(biāo)20l，用氮氣吹干。 4.5.2 蒸發(fā)剩余物加 0.1 ml bstfa+1%（）tmcs，加蓋于旋渦混合器上震蕩，在80烘箱中加熱1h，然后用氮氣吹干，加0.1ml 甲苯溶解。同時取20l0.5g/ml克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)工作液，加美托洛爾內(nèi)標(biāo)20l，吹干后同時進(jìn)行衍生化。取1.0l甲苯溶液進(jìn)行g(shù)c/ms分析。4.6 測定定性采用保留時間、標(biāo)準(zhǔn)鹽酸克倫特羅棒圖對照進(jìn)行nist98圖庫檢索