(論文)大鼠肝星狀細(xì)胞系的建立及其生物學(xué)特性的研究

第 3 4卷第 3 期 2 0 0 3年 6月 解 剖 學(xué) 報(bào) ACTA ANATOMI CA S I NI CA Vo 1 3 4 No 3 J u n 2 0 0 3 大鼠肝星狀細(xì)胞 系的建立及其生物學(xué)特性的研究 冷希圣 翁山耕 李濤 魏玉華 彭吉潤(rùn) 杜如昱 ( 北京大學(xué)人民醫(yī)院肝膽外科 中心 ， 北京 1 0 0 0 4 4 ) 摘 要 目的 建立并鑒定肝星狀細(xì)胞( H S C ) 細(xì)胞 系。 方法 采用肝臟離體膠原酶灌注消化 及密度梯度離 心的方法分離培養(yǎng)大鼠的H S C ； 通過體外長(zhǎng)期傳代培養(yǎng)后建立 1 株細(xì)胞系， 應(yīng)用細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察、 細(xì)胞倍增時(shí)間測(cè) 定 、 細(xì)胞生長(zhǎng) 曲線繪制、 染色體分析 、 雙層軟瓊脂培養(yǎng) 、 免疫細(xì)胞化 學(xué)檢測(cè) 、 R T - P C R檢 測(cè)、 聚硅酮膜 培養(yǎng)法觀 測(cè) H S C 的收縮等方法對(duì)其生物學(xué)特性進(jìn) 行研究。 結(jié)果H S C細(xì)胞系 已傳 了 7 8代 ， 保持 著肌成纖維樣細(xì)胞 的形態(tài)學(xué) 特 點(diǎn) 。細(xì)胞倍增 時(shí)間為 3 6 5 h ； 細(xì)胞的染色體眾數(shù) 4 2 條 ， 為正常大鼠體細(xì)胞的染色體表型 ； 雙層軟瓊脂 培養(yǎng) 未見細(xì) 咆 克隆形成 ； 免疫 細(xì)胞化 學(xué)檢測(cè) 表 明， 細(xì)胞 系表達(dá) D e s m i n 、 G F A P 、 I型 膠原 、 ll l 型膠 原、 a S M A 、 i N O S 、 I C A M 一 1 、 T G F - a ； R T P C R 檢測(cè)表明 ， 該細(xì)胞系表達(dá) T G F B 、 I C A M 一 1 ； 聚硅酮膜培養(yǎng)法顯示 ， H S C細(xì)胞系能在 E T 一 1作用下產(chǎn) 生收縮 反應(yīng)。 結(jié)論H S C細(xì)胞系符合建系標(biāo)準(zhǔn) ， 是 1株新建立 的大 鼠肝 星狀細(xì)胞 系， 命名為 r H S C 一 9 9 ， 可作 為肝硬化 、 門靜脈高壓 癥實(shí)驗(yàn)研究的模 型。 關(guān)鍵詞 】 大 鼠肝星狀細(xì)胞系； 細(xì)胞系； 細(xì) 胞培養(yǎng) ； 大鼠 中圖分 類號(hào) Q 2 2 8 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0 5 2 9 1 3 5 6 ( 2 0 0 3 ) 0 3 2 6 9 ES TABLI S HM ENT OF A NEW RAT HEPATI C S TELLATE CELL LI NE r HSC 9 9 W I TH CHARACTERI S TI CS OF M YOFI BROBLAS T CELL L E N G X i s h e n g I ，WE N G S h a n g e n g ，L 1 T a o ，WE 1 Yu h u a ，P E NG j i - I M fl ，D U R u - y u ( D e p a r t m e n t o fH e p a t o b i l ia r y S u e u，P e k i n g U n i v e r s i t yP e l e H o i t a l ， B e ij i n g 1 0 0 0 4 4， C h i n a ) A b s t r a c t O b j e c t i v e T o e s t a b l i s h a n d i d e n t i f y a n e w r a t h e p a t i c s t e l l a t e c e l l l i n e( r H S C 一 9 9 ) Me t h o d s L i v e r i n v i v o p e r f u s i o n o f c o l l a g e n a s e a n d d e n s i ty g r a d i e n t c e n t r i f u g a t ion we r e us e d t o i s o l a t e h e p a t i c s t e l l a t e c e l l f r o m a n o r ma l r a t Ce l l s we r e ma i n t a i n e d i n c u l t u r e f o r mu hi p l e p a s s a g e s Ce l l p r o l i f e r a t i o n a n d mo r p h o l o g i c a l c h a r a c t e r i z a t i o n we r e s t u di e d o n 6 0 p a s s a g e o f HS C I mmu n o c y t 0 c h e mi s r y a n d R T P C R w e r e u s e d t o d e t e c t t h e e x p r e s s i o n o f d e mi n， GF AP ， a S MA， c o l l a g e n t y p e 1 a n d ， i NOS， I CAM一 1，T GF - a，I L- I O a n d TGF - a i n 6 0 p a s s a g e o f HSC Si x t y p a s s a g e c e l l s we r e c u l t u r e d o n s i l i c o n e me mb r a n e t o i n v e s t i g a t e t h e c e l l c o n t r a c t i o n Gi ms a s t a i n me t h o d wa s u s e d t o a n a l y z e k a r y o t y p eRe s u l t s r HS C一 9 9 c e l l h a s u nd e r g o n e： 7 8 p a s s a g e s I t s mo r p h o l o g i c a l c h a r a c t e ris t i c s r e s e mb l e my o fi b r o b l a s t c e l 1 Th e c e l l d o u bi n g t i me i s 3 6 5 h o u r s I mmu n o c y t 0 c h e mi s t r y s h o w e d t h a t D e tai n ， GF A P， a S MA， c o l l a g e n t y p e I a n d I l l ， i NO S ， I C A M一 1 ， T G F - a w e r e e x p r e s s e d i n r HS C 一 9 9 c e l l s R T - P C R a n aly s i s s h o we d t ha t TGF一 8 a n d I CAM一 1 we r e e x p r e s s e d i n r HS C一 9 9 c e l l s Ce l l c o n t r a c t i o n wa s i n d uc e d b y ET一 1 Ce l l c l o n e wa s n o t f o rm e d a f t e r 1 4 d a y s c u l t u r e i n s o ft a g a r r HS C一 9 9 c e l l s di s p l a y e d n o rm a l r a t k a r y o t y p e wi t h 4 2 c h r o mo s o me s i n mo d a l n u mb e r Co n c l u s i o n r HS C一 9 9 e e l l l i n e e x h i b i t s c ha r a c t e r i s t i c s o f a c t i v a t e d h e p a t i c s t e l l a t e c e l 1 I t wi l l be a us e f u l t o o l t o s t u d y 【 1 1 e p a t h o g e n e s i s o f l i v e r c i r r h o s i s a n d p o r t a l h y p e r t e n s i o n K e y w o r ds r H S C 一 9 9 ； C e l l l i n e ； C e l l c u l t u r e ；R a t 肝 星狀 細(xì)胞 ( h e p a t i c s t e l l a t e c e l l ， H S C ) 具 有 生成 細(xì)胞外基質(zhì) ， 分泌細(xì)胞因子以及收縮等多種功能， 在 收稿 13 期 2 0 0 2 ， 0 9 ， 1 3 修 回13期 2 0 0 2 ， 1 2 2 0 基金項(xiàng)目 國(guó)家 自然科學(xué)基金資助項(xiàng) 目( 3 9 9 7 0 7 2 2 ) 作者簡(jiǎn)介 冷希圣 ( 1 9 4 5 一 ) ， 男( 漢族) ， 遼寧 復(fù)縣人 ， 醫(yī)學(xué)博 士 ， 外科學(xué)教授 ， 博士生導(dǎo)師 ， 中華外科學(xué)會(huì) 副主 任委員， 北京大學(xué) 人民醫(yī)院肝膽外科中心主任。 *通訊作者( T o w h o m c o r r e s p o n d e n c e s h o u l d b e a d d r e s s e d ) 肝硬化、 門靜脈高壓癥 的發(fā)生發(fā)展 中起了關(guān)鍵性的 作用， 已成為肝硬 化實(shí)驗(yàn)研究 的熱點(diǎn) 。 。但 H S C 分離培養(yǎng)難度大 ， 不僅 步驟繁復(fù) ， 不 易成功， 而且產(chǎn) 量較低 ， 無(wú)疑給研究工作帶來很大的困難 。因此 ， 建立能連續(xù)傳代的肝星狀細(xì)胞系， 對(duì)于肝纖維化的 實(shí)驗(yàn)研究 十分必要。 目前 ， 國(guó)際上有 5位學(xué)： 報(bào)道建立了 H S C細(xì)胞系， 國(guó)內(nèi)尚未見 H S C細(xì)胞系建 立的報(bào)道。我們從正常 Wi s t a r 大鼠肝中分離出來 的 1 個(gè) H S C細(xì)胞系已連續(xù)傳 了7 8代 ， 保持著激活后 的 維普資訊 解 剖 學(xué) 報(bào) 3 4卷 ， 3 期 H S C的生物學(xué)特性?，F(xiàn)報(bào)道如下。 材料和方法 1 材 料 1 1 細(xì)胞來源 ： Wi s t a r 大 鼠， 雄性， 體重 4 6 7 g ， 由 北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部提供。 1 2 主要試 劑： 型膠 原酶 、 N y c o d e n z均購(gòu) 自 S i g m a 公司； 胎牛血清購(gòu) 自H y c l o n e 公司； 鼠抗人結(jié)蛋 白( D e ta i n ) ， 鼠抗人膠質(zhì)纖維酸性蛋 白( g l i a d f i b r i l l a r y a c i d i c p r o t e i n s ， G F A P ) 單 克隆抗體， 鼠抗人 q 平滑肌 肌動(dòng)蛋 白( q s m o o t h m u s c l e a c t i n ， q S M A ) 單克隆抗體 ， 羊抗 鼠 細(xì) 胞 間 粘 附 分 子 1( i n t e r c e l l u l a r a d h e s i o n m o l e c u l e 1 ， I C A M一 1 ) 多克隆抗體均購(gòu) 自D a k o 公司； 兔 抗人 I型膠原( c o l l a g e n t y p e I) 和 型膠原( c o l l a g e n t y p e m) 多克隆抗體均購(gòu) 自武漢博士德公司 ； 兔抗 鼠 誘導(dǎo)型一氧化氮合酶( i n d u c i b l e n i t ri c o x i d e s y n t h a s e ， i N O S ) 多克隆抗體購(gòu) 自 S a n t a C l 3 1 Z 公司； 鼠抗人轉(zhuǎn)化 生長(zhǎng)因子一 q ( t r a n s f o r m i n g g r o w t h f a c t o r - a ，T G F q ) 單克 隆抗體購(gòu) 自C a l b i o c h e m公司；內(nèi)皮素 1 ( e n d o t h e l i n 1 ， E T 一 1 ) 購(gòu) 自 S i g m a 公司 。 2 方法 2 1 H S C的原代分離培養(yǎng)及鑒定 ： H S C細(xì)胞系于 1 9 9 9 年 1 2月 2 3日分離 ， 分離方法見參考文獻(xiàn) 9 ， 1 0 。采用肝臟離體 C o l l a g e n a s e 循環(huán)灌注消化及密 度梯度離心的方法分離 H S C， 方法簡(jiǎn)述如下 ： 大鼠門 靜脈插管， 首先灌注含 0 2 g L E D T A， 2 4 g L H e p e s 的 D H a n d k液， 同時(shí)將肝完整地分離下來 ， 緊接著反 復(fù)循環(huán)灌注濃度為0 3 g L的C o l l a g e n a s e I V 灌注液， 直 到肝組織完全軟化。然后以含 0 4 L C o l l a g e n a s e IV， 0 0 2 g L D N A s e I的振蕩消化液消化 3 0 m i n ( 3 7 ) 。 所得細(xì)胞懸液經(jīng) 1 5 0目、 2 0 0目鋼網(wǎng)過濾 ， 2次低速 離心去除肝細(xì)胞后 ， 以濃度為 1 1 0 g L的N y c o d e n z 液 重懸 細(xì) 胞 ， 在 細(xì) 胞 懸 液 上 再 小 心 地 滴 加 1層 R P M1 6 4 0液。 1 5 0 0g 離 心 2 0 m i n( 2 0 ) ， 將 R P M1 6 4 0液與 1 1 的 N y c o d e n z 交界面的 H S C吸出。 細(xì)胞懸浮于含 2 0 ( 體積分?jǐn)?shù) ) 胎牛血清的 M1 9 9培 養(yǎng)液中。分離所得 H S C用 臺(tái)盼藍(lán)染色鑒定細(xì)胞存 活率； 熒光顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)剛分離出來的細(xì)胞 中能 自發(fā)藍(lán)綠色熒光的細(xì)胞數(shù)； 原代培養(yǎng) 2 d后 ， 應(yīng) 用 D e s m i n 、 G F A P免疫細(xì)胞化學(xué) s P法染色鑒定細(xì)胞 純 度 。 2 2 細(xì)胞形態(tài)學(xué) 觀察 ： 用 O l y m p u s I X 7 0倒 置相 差 顯微鏡以及透射和掃描電鏡進(jìn)行觀察。 2 3 細(xì)胞生長(zhǎng)曲線繪制， 細(xì)胞倍增時(shí)間測(cè)定 ： 按 文獻(xiàn) 1 1 方法 ， 選生長(zhǎng)狀態(tài) 良好、 處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的 第 7 0代細(xì)胞 ， 將細(xì)胞以 11 0 4 個(gè) 孔的濃度接種于 2 4孔板 中培養(yǎng)。從第 2 d開始 ， 每天用傳代消化液 消化 3孔細(xì)胞 ， 計(jì)數(shù)每孔平均細(xì)胞數(shù)。以培養(yǎng)時(shí)間 為橫軸 ， 每孔平均細(xì)胞數(shù)為縱軸 ， 繪制出細(xì)胞生長(zhǎng)曲 線并計(jì)算出細(xì)胞倍增時(shí)間。 2 4 染色體分析： 按文獻(xiàn) 1 2 ， 常規(guī)制備染色體 ， G i e m s a 染色法行染色體顯示并進(jìn)行染 色體 G顯帶 分析。 2 5 雙層軟瓊脂培養(yǎng) ： 按文獻(xiàn) I I ， 常規(guī)制備雙 層軟瓊脂 ， 選 生長(zhǎng)狀 態(tài) 良好 ， 處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期 的第 7 0代細(xì)胞 。3 7 ， C O ， 培養(yǎng)箱培養(yǎng) 1 4 d ， 觀察細(xì)胞克 隆形成情況。H e l a細(xì)胞作為對(duì)照。 2 6 免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè) ： 免疫細(xì)胞化學(xué) s P法染 色檢測(cè)培養(yǎng) 7 0代的 H S C細(xì)胞系中， I型膠原 、 型 膠 原 、 q S M A、 D e s m i n 、 G F A P 、 i N O S 、 I C A M 1和 T G F q 的表達(dá)情況。 2 7 R T P C R檢測(cè) ： R T P C R檢測(cè) 7 0代 的 H S C細(xì) 胞系中 T G F J3 、 I C A M 1 、 I L 一 1 0的表達(dá)情況 ， 引物序列 及擴(kuò)增片段長(zhǎng)度見附表 ， R T P C R均采用 2 5 l 反應(yīng) 體 系， 反應(yīng) 條件為 預(yù)變性 9 4 o C， 2 r a i n ， 變 性 9 4 ， 3 0 S ， 退火 5 5 ， 3 0 S ， 延伸 7 2 C， 5 0 S ， 共 2 8個(gè)循環(huán) ， 后延伸 7 2 ， 5 m i n 。 附表P C R引物 T a 【b l e P r i me r s T GF 8 5 TGA 5 1 lGGGAC T GA T CC CA 1 1 1GArr _ 3 I CAM 1 5 G A G C G AC C TG GAGAG CA 3 5 C AGGG ACT I C C AT CC AC C T 3 I L 1 0 5 C T GGC T C AGC AC T GC TA T 3 5 A rr CA TG GC CTr G TA CAC AC 3 6 - a c t in 5 T G G G A C G A T A T G G A G A A G A T 3 5 A Tr GC CGA T AGT GA T GAC CT 3 4 0 9 b p 4 7 3 B P 5 2 3 b p 2 8 聚硅酮膜( s i l i c o n e ) 培養(yǎng)法觀測(cè) H S C的收縮 ： 按 文獻(xiàn) 1 3 的方法制備聚硅酮膜蓋玻片。取 7 0代的 H S C細(xì)胞 ， 以 11 0 個(gè) m l 濃度接種 于含 聚硅酮膜 蓋玻片的培養(yǎng)皿 中。3 d 后 ， 將培養(yǎng)皿分為對(duì)照組和 內(nèi)皮素 1 ( E T - 1 ) 作用組 。對(duì)照組加 P B S ， E T 1組加 E T 1至終濃度為 21 0 m o l L 。每組于加藥前及 加藥后 2 0 m i n在倒置顯微鏡下攝 片。比較前后 照 片， 分析加藥前后 同一視野細(xì)胞周 圍的聚硅酮膜皺 紋變化。根據(jù)皺紋的增減來判定細(xì)胞 的舒縮 ， 增多 表明收縮 ， 減少表明舒張。 維普資訊 V o l 3 4 N n 3 冷希圣等 大鼠肝 星狀細(xì)胞系的建立及其生物學(xué)特性的研究 2 7 結(jié) 果 1 基本情況 r H S C 一 9 9細(xì)胞 系于 I 9 9 9年 l 2月 2 3 日分 離出 來。剛分離出來的細(xì)胞約 8 0 能在 3 2 8 l t m波長(zhǎng)的 激發(fā)光下發(fā)出極易淬滅的藍(lán)綠色熒光( 圖 1 A， B ) ； 原 代培養(yǎng) 2 d后 ， 行免疫組織化學(xué) s P染色鑒定 ， D e s m l n 陽(yáng)性細(xì)胞 占9 1 ， G F A P陽(yáng)性細(xì)胞 占7 7 ， 而 D e s m l n 加 G F A P雙染 色陽(yáng)性細(xì)胞 占 9 7 原代培養(yǎng) 2 0 d 后， 按 1 ： 2傳第 1 代。以后每隔 71 0 d ， 按 1 ： 2傳 代。2 0代后 ， 漸改為每 56 d ， 按 1 ： 3傳代。3 O代 后， 改為每 4 d ， 按 1 ： 3傳代。此外 ， 每隔 3 5代 ， 將 部分 細(xì)胞 凍 存。凍存的 細(xì)胞復(fù)蘇后 ， 存 活率 大于 9 0 ， 形態(tài)和增殖能力保持不變。到 2 0 0 2年 3月 1 日為止， 細(xì)胞已傳 了7 8代 ， 命名為 r H S C 一 9 9 。 2 形態(tài) 學(xué)特點(diǎn) 貼壁生長(zhǎng)的 r H S C 一 9 9細(xì)胞表現(xiàn) 為肌成纖維樣細(xì) 胞的形態(tài)學(xué)特點(diǎn) 傳代的細(xì)胞貼壁 57 h后 ， 即開 始伸展 ， 胞體增大呈多邊形， 直徑可達(dá) 7 O 9 0 m， 并 伸出許 多細(xì)長(zhǎng)的偽足而呈星形外觀( 圖 2 A ，B ) ：細(xì) 胞大量增殖， 細(xì)胞 密度變大后 ， 細(xì)胞形態(tài)可變小， 略 呈梭形， 并相互融合呈片狀 ：透射 電鏡和掃描 電鏡 見 r H S C 一 9 9細(xì)胞 的胞體和胞核大， 胞體四周伸 出眾 多偽 足 ( 圖 3 ) 3 細(xì)胞生 長(zhǎng)特性 培養(yǎng)于 2 4孔板的 r H S C 一 9 9細(xì)胞 ， 接種后 1 、 2 、 3 、 4 、 5 、 6和 7 d的每孔細(xì)胞數(shù)分別為 0 6 1 1 0 、 0 9 2 l 0 、 1 9 81 0 、 3 3 l1 0 4 8 8 x 1 o 4 、 5 1 51 0 和 5 21 1 0 。繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線 ， 見圖 4 。測(cè)算細(xì)胞 倍增時(shí) 間為 3 6 5 h 4 染色體顯示結(jié)果 r H S C 一 9 9細(xì)胞染色體顯示結(jié)果 見圖 5 。計(jì)數(shù) 5 O 圖 I 新鮮 分離的 H S C在 3 2 8唧 波長(zhǎng)的激發(fā)光下 ， 發(fā)出藍(lán)綠色熒光 A 熒光顯微鏡下 剛分離出來的 H S C x l 0 0 ；B 培養(yǎng) 2 d后， 倒置相差顯微鏡觀察 4 0 O 圖 2 H S C的形態(tài)學(xué)特點(diǎn) A 原代培養(yǎng)的H S C x 1 0 0 ； B 第 7 0 代的r V ,S C 9 9 細(xì)胞x l 0 0 F i g 1 A u t o fl u o e n c e n f fle s h l y i s o l a t e d H S C AF r h l y i l a t e d HS C x l o o；B，O b s e r v e d u n d e r l ig h t p h a s e - c o n t r a i l mi c r o s c o p e a f t e r c u l t u d 2 d s x 4 0 0 F i g 2 Mo r p h o lo e a l c h m c t 0 n 0 f H S C A，P r i ma ,3 c u l t e o f t h e H S C 1 0 0；BT h e 7 0 t h p a s s a g e r S C一 9 9 x I C O 維普資訊 圖 3 掃描電鏡觀察第 7 0 代 x 8 0 0 F i g 3 啤 e l ：t mn mi c ms c o W ， r 山 7 0 t h r l IS C - 9 9 x 8 0 3 罔 4 第 7 0代 I I S C的生 長(zhǎng)曲線 F i g 4 Gr o wt hc o f t h e 7 0 t h p a s e r lt S C- 9 9 圖 5 第 7 O代 H S C染色體顯示 F i g 5 K a r D J t y p i t a r 1 v * o f t h e 7 0 t h p a s s a g e dI S C 一 9 9 個(gè) r H S C 一 9 9細(xì)胞 系 染色 體分裂相 ， 4 2條染色體 占 7 4 ( 3 7 5 0 ) ， 4 2條 染色體占 1 6 ( 8 5 0 ) 染色體眾數(shù)為 4 2條， 是正常 大鼠體細(xì)胞的染 色體表型。染色體 G顯帶分析無(wú) 畸變 。 5 雙層軟瓊脂培養(yǎng)結(jié)果 第 7 0代 r H S C 一 9 9細(xì) 胞 在雙 層軟 瓊 脂 中培 養(yǎng) 3 4卷， 3期 1 4 d ， 未 見細(xì)胞克隆肜成。作為對(duì)照的 H e l m細(xì)胞在 烈層軟瓊脂中培養(yǎng) 1 0 d 即可見細(xì)胞克隆形成。 6 第 7 0 代 r HS C 9 9細(xì)胞 的免疫 細(xì)胞化 學(xué)檢 測(cè)結(jié) 果 l l e s mi n 、 GF A P、I 膠 原 、 型 膠 原 、 一 S MA、 i N O S 、 I C A M 一 1 和 T G F 一 均表達(dá)陽(yáng)性 ， 見圖 6 、 7 第 7 0 代 r HS C 9 9細(xì)胞的 R T P C檢測(cè)結(jié)果 T G F 一 日陽(yáng)性 ， I C A M 1陽(yáng)性 1 1 一 l 0陰性 一 8 細(xì)胞 的收 縮 聚硅 酮膜上 培養(yǎng) 3 d后 ， 超 過 5 0 的 r H S C 一 9 9在 其周圍出現(xiàn)皺紋。盯 I 作用 2 0 ra i n后 H S C周圍的 聚硅酮膜皺紋明顯增多( 7 ) 。 討論 1 9 8 2年 K n o o k 成功分離培養(yǎng) r H S C ， 才使 H S C 的研究取得突破 現(xiàn)已明確 H S C在肝纖維化的發(fā) 牛發(fā)展中起 J 核心 r E 的作 ， H S C成為肝纖維化和 門靜脈高壓癥實(shí)驗(yàn)研究領(lǐng)域 的熱點(diǎn) 。 由于人肝 標(biāo)本罕 見 因此研 究用的 H S C基本上取 材于大 鼠一 盡管近年來 H S C的分離培養(yǎng)技術(shù)已經(jīng)有 J ， 很大 的 發(fā)展， 但操作步驟仍 十分繁復(fù) ， 易掌握 ； 此外 由于 H S C在肝總體細(xì)胞中所占的比例很少， 因此產(chǎn)量 有 限， 即使熟練掌握 ， 縛 只大 鼠的 H S C產(chǎn)量也只能 達(dá) 到 l 0 個(gè)的級(jí)別 ， 遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足實(shí)驗(yàn) 研究的大 量 需要。而多次分離， 叉會(huì)增加實(shí)驗(yàn)誤差。因此 建立 能連續(xù)傳代的 H S C細(xì)胞 系作為實(shí)驗(yàn)工具 對(duì)肝纖維 化和門靜脈高壓癥的研究來 說， 有著十分重要的意 義 目前 國(guó)內(nèi) 尚術(shù)見 H S C細(xì) 胞 系建 立 的報(bào) 道 ， 國(guó) 際 上僅見 5位學(xué)者報(bào)道建立 了 H S C細(xì)胞系。G r e e n w e l 等 從 J E 常大 鼠和 C C I 誘 導(dǎo)的肝硬化 大鼠中分 別 分離培養(yǎng)出 N F S ( 和 C F S C兩個(gè)細(xì)胞 系We i l l 等 的 G R E F - X細(xì)胞 系是將 S V 4 0病毒大 T抗原編碼序 列轉(zhuǎn)染 人 H S C獲得的 K i l a m u r a等 用 S V 4 0的溫 度敏感突變株 t s A 6 4 0轉(zhuǎn)化小鼠 H S C 建立了 A 6 4 0 一 I S 細(xì)胞系而 Mu r a k a m i 等 的 L I 9 0 I t S C細(xì) 胞 系 則 源 于人肝問質(zhì)腫瘤細(xì)胞。最 近， S e h n a b l 等 將端粒酶 的催化亞單 位 h T E R T轉(zhuǎn) 染人 的 H S C獲 得 了 I株 H S C細(xì)胞 系。 我們建立的 r H S C 一 9 9細(xì)胞系是 l 9 9 9年 l 2月 2 3 日從 1 只 正常 Wi s t a r 大 鼠肝 中 分離 培 養(yǎng) 的 ， 經(jīng) 過 連 續(xù)傳代 ， 到 2 0 0 2年 3月 1日為止， 已經(jīng)傳 了 7 8代 r H S C 一 9 9細(xì)胞 系具有 激活后 H S C的幾個(gè) 主 要生 物學(xué) 特性 一 ： 1 形態(tài)學(xué) 喪現(xiàn)為脂滴消失， 胞體增大 ， 胞突伸展 ， 伸 出細(xì)長(zhǎng)的偽足而呈星形外觀；2能表 達(dá) S MA， 此 為激 的H S C 的特征性標(biāo) 志 ； 3 表達(dá) i 一 譬 告 l。 辱 維普資訊 V o l 3 4 N n 3 冷希圣等 火 鼠肝型狀細(xì)胞 系的建立及其生物學(xué)特性 的研究 -2 7 3 _ ； A 6 圍 7 F i g 6 F i g 7 6E 蘸 6 8 免疫細(xì)胞化學(xué)染色x1 0 f ) A D e s m i n陽(yáng)性；l l G F A P陽(yáng)性 ；C I型腔原 陽(yáng)性 ； D田型膠原 陽(yáng)性；E a s MlII j 性 ；F i N O S陽(yáng)性 內(nèi)皮素 1 誘 導(dǎo) r HS C 一 9 9細(xì)胞收縮 4 0 0 A 加藥 前；B加藥 l 5 m -n后 胞體變小 皺紋增 多 h mn u n o c y l t c h a mi s t r y of t h e 7 0 1 h p a e r H S C 一 9 91 O f ) A， P t s i fi v e o f1 ) e mi n ：B P o s i t i w- of GF A P；C， P o t s h i v eof c o l la g e n E P o s it iv a o l S MA：F P o s i ti v e o fl N OS r I S C 一 9 9 c e l t c n t r a c t io n i n d u c e d b y e n & t h e li n I x 4 0 0 A u n t r e a le d ：B A ft e r 1 5 mi n n f e n d o t h e l i n - I a d mi n i s t r a t io n t h eh P o f w nn Ne w r r P R s e d 矗 維普資訊 2 7 4 解 剖 學(xué) 報(bào) 3 4卷 ， 3 期 D e s m i n和 G F A P ； 4 能分泌 I型膠原和 型膠原等 細(xì)胞外基質(zhì) ； 5 具有收縮功能： 6 有分泌 T G F L a 等 細(xì)胞因子的能力。此外 ， 從染色體分析和軟瓊脂培 養(yǎng)結(jié)果上看 ， r H S C 一 9 9細(xì)胞系屬于未轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。 r H S C 一 9 9細(xì)胞系是經(jīng)長(zhǎng)期培養(yǎng) ， 傳代后 自發(fā)產(chǎn)生 的， 而非人為轉(zhuǎn)化、 轉(zhuǎn)染后獲得 ， 因此更符合 H S C的 自然特性。此外， 與國(guó)外學(xué)者建立的 H S C細(xì)胞系相 比， 本細(xì)胞系還有以下幾個(gè)特點(diǎn) ： 1 具有收縮功能 ， 我們應(yīng)用聚硅酮膜培養(yǎng)法發(fā)現(xiàn)， r H S C 9 9細(xì)胞系能在 E T 1 的刺激下迅速產(chǎn)生收縮反應(yīng) ， 收縮功能是 H S C 的重要功能之一。位于 D i s s e間隙的 H S C緊貼著肝 竇內(nèi)皮細(xì)胞， 伸出大量長(zhǎng)胞突 ， 包統(tǒng)著肝血竇。因 此 ， H S C的舒縮可以直接調(diào)節(jié)肝血竇的微循環(huán) ， 從而 影響肝臟的血流分布和門靜脈壓力 。此外 ， r H S C 一 9 9 細(xì)胞系表達(dá) i N O S ， 說明其具有合成 N O的能力 ， N O是一種信號(hào)傳遞分子， 可誘導(dǎo)多種生物學(xué)效應(yīng) ， 并具有強(qiáng)烈 的促 H S C舒張作用 “ 。因此 ， r H S C 一 9 9 細(xì)胞系可作為實(shí)驗(yàn)工具 ， 用于 H S C的收縮調(diào)控 、 降 低門靜脈壓力的新藥篩選等領(lǐng)域的研究 ； 2 同時(shí)表 達(dá) D e s m i n和 G F A P 。中間絲蛋白 D e s m i n和 G F A P是 目前鑒定 H S C的最可靠指標(biāo) ； 3 表達(dá) I C A M一 1和 T G F a等。不同來源的細(xì)胞系可以具有不同的生物 學(xué)特性 ， r H S C 一 9 9細(xì)胞系具有的這幾項(xiàng)重要特性 ， 其 他 H S C細(xì) 胞 系 未 見報(bào) 道 。 因此 ， r H S C 一 9 9細(xì)胞 系 的 建立有助于對(duì) H S C生物學(xué)特性全面、 深入的研究。 總之 ， 我們建立 的 r H S C 9 9細(xì)胞保持著激活后 的 H S C的生物學(xué)特性 ， 作 為實(shí)驗(yàn)工具， 為研究肝纖 維化、 門靜脈高壓癥的發(fā)病機(jī)理， 篩選有效的抗肝纖 維化、 降低門靜脈壓力的藥物， 提供 了理想的實(shí)驗(yàn)?zāi)?型， 具有很大的應(yīng)用價(jià)值。 參 考 文 獻(xiàn) 1 M a r c L H， A l b e a G T h e h e p a t i c s t e l l a te ( h o ) c e l l ： i t s r o l e i n h u m a n li v e r d i s e a s e J V i r c h o w s A r c h ， 1 9 9 7 ， 4 3 0 ( 3 ) ： 1 9 5 2 0 7 2 R e y n a e r t H， T h o m p s o n M G， T h o m a s T， e t a1 H e p a t ic s t e l l a t e c e l l s ： r o l e i n m i c roc i r c u l a t io n a n d p a t h o p h y s i o l o g y o f p o r t a l h y p e rt e n s i o n l J J G u t ， 2 0 0 2 ， 5 0 ( 4 ) ： 5 7 1 - 5 8 1 3 R a m m G A I s o l a t io n a n d c u l tu r e o f r a I h e p a ti c s t e l l a t e c e l l s J J G a s t r o e n t e r o l H e p a t o l ， 1 9 9 8 ， 1 3 ( 8 ) ： 8 4 6 8 5 1 4 G r e e n w e l P ， S c h w a r t z M， R o s s a s M， e t al C h ara c t e ri z a t io n o f f a t - s t o r i n g c e l l l i n e s d e ri v e d f o 1 T U n 0 mal a n d C C 1 4 c i r r h o t i c l i v e r s 【 J J L a b I n v e s t ， 1 9 9 1 ， 6 5 ( 6 ) ： 6 4 4 - 6 5 3 5 We i l l F X， B l a z e j e w s k i S ， B l anc J F ， e t a1 C h ar a c t e ri z a t i o n o f a n e w h u man l iv e r my o f i b r o h l a s t c e l l l i n e ： t r an s c ri p t i o n al r e g u l a t i o n o f p l a s mi n o g e n a c t i v a t o r i n h i b i t o r ty p e I b y t r a n s f o r mi n g g r o w t h f a c t o r D 1 J L a b I n v e s t ， 1 9 9 7 ， 7 7 ( 1 ) ： 6 3 - 7 0 6K i t a m u r a Y， T ani g a w a T， K a t s u m o t o T， e t a1C e l l g r o wth and d if f e r e n t i a t i o n o f a n o v e l m o u s e h o( f a t s t o ri n g )c e l l l i n e t r a n s f o r m e d b y a t e m p e r a t u r e s e n s i t i v e m u t ant o f s i m i an v i r u s 4 0 J H e p a t o l o g y ， 1 9 9 7 ， 2 6 ( 2 ) ： 3 2 3 3 2 9 7 Mu r a k a m i K， A b e T ， M i y a z a w a M， e t a1 E s t a b l is h m e n t o f a n e w h u ma n c e l l l i n e ， L I 9 0 ， e x h i b i t i n g c h ar a c t e ri s t i c s o f h e p a t i c I t o ( f a t s to ri n g )c e l l s J L a b I n v e s t ， 1 9 9 5 ， 7 2 ( 6 ) ： 7 3 1 7 3 9 8 S c h n a b l B ， C h o i Y H， O l s e n J C， e t a1 I m mo rt al a c t iv a t e d h u m an h e p a t i c s t e l l a t e c e l l s g e n e r a t e d b y e c t o p ic t e l o m e r a s e e x p r e s s i o n J L a b I n v e s t ， 2 0 0 2 ， 8 2 ( 3 ) ： 3 2 3 3 3 3 9 K n o o k D L， S e f f e l a a r A M， d e L e e u w A M F a t s t o ri n g c e l l s o f t h e r a t l i v e r T h e ir i s o l a t i o n a n d p u ri fi c a t i o n J E x p C e l l R e s ， 1 9 8 2 ， 1 3 9 ( 2 ) ： 4 6 8 4 71 1 0 We n g S G， L e n g X S H， We i Y H， e t a1 A n i m p r o v e d m e t h o d o f i s o l a t i n g and i d e n t i i n g r a t h e p a t i c s t e l l a t e c e l l s J J P e k i n g U n iv e rs i t y ( h e alt h s c i e n c e s ) ， 2 0 0 1 ， 3 3 ( 1 ) ： 8 3 8 6 翁山耕， 冷希圣 ， 魏玉華， 等 改 良法大鼠肝星狀細(xì)胞的分離 培養(yǎng) 及鑒定 J 北京大學(xué)學(xué)報(bào) ( 醫(yī)學(xué)版) ， 2