實驗五薄層色譜實驗.ppt

實驗五 薄層色譜實驗,一、實驗?zāi)康?1、掌握薄層色譜的操作技術(shù)。 2、了解薄層色譜的基本原理和應(yīng)用。,二、實驗原理： 1、原理 薄層色譜(Thin Layer Chromatography)常用 TLC表示，又稱薄層層析，屬于固液吸附色譜。樣品在薄層板上的吸附劑（固定相）和溶劑（移動相）之間進行分離。由于各種化合物的吸附能力各不相同，在展開劑上移時，它們進行不同程度的解吸，從而達到分離的目的。,2、薄層色譜的用途： 1）化合物的定性檢驗。（通過與已知標(biāo)準(zhǔn)物對比 的方法進行未知物的鑒定）在條件完全一致的情況，純碎的化合物在薄層色譜中呈現(xiàn)一定的移動距離，稱比移值（Rf值），所以利用薄層色譜法可以鑒定化合物的純度或確定兩種性質(zhì)相似的化合物是否為同一物質(zhì)。,影響比移值的因素很多，如薄層的厚度，吸附劑顆粒的大小，酸堿性，活性等級，外界溫度和展開劑純度、組成、揮發(fā)性等。所以，要獲得重現(xiàn)的比移值就比較困難。為此，在測定某一試樣時，最好用已知樣、品進行對照。,2、快速分離少量物質(zhì)（幾到幾十微 克，甚至0.01g） 3、跟蹤反應(yīng)進程 在進行化學(xué)反應(yīng) 時，常利用薄層色譜觀察原料斑點 的逐步消失，來判斷反應(yīng)是否完成。 4、化合物純度的檢驗（只出現(xiàn)一個斑 點，且無拖尾現(xiàn)象，為純物質(zhì)）,三、實驗裝置,1.薄層板的制法； 2.薄層色譜活化； 3.薄層色譜點樣； 4.薄層色譜展開； 5.薄層色譜顯色與分析；,四、實驗步驟：,1、吸附劑的選擇 薄層色譜的吸附劑最常用的是氧化鋁和硅膠。 1）硅膠： “硅膠H”不含粘合劑； “硅膠G”含煅石膏粘合劑； 其顆粒大小一般為260目以上。顆粒太大，展開劑 移動速度快，分離效果不好；反之，顆粒太小溶 劑移動太慢，斑點不集中，效果也不理想。,四、實驗步驟：,對化合物的吸附能力與它們的極性成正比，具有較大極性的化合物吸附較強，因而Rf值較小。 酸和堿 醇、胺、硫醇 酯、醛、酮 芳香族化合物 鹵代物、醚 烯 飽和烴 本實驗選擇的吸附劑為薄層色譜用硅膠G。,2、薄層板的制備：,薄層板制備的好壞直接影響色譜的結(jié)果。薄層 應(yīng)盡量均勻且厚度要固定。否則，在展開時前 沿不齊，色譜結(jié)果也不易重復(fù)。在燒杯中放入 2g硅膠G，加入56ml0.5%的羧甲基纖維素鈉水 溶液，調(diào)成糊狀。,將配制好的漿料傾注到清潔干燥的載玻片上， 拿在手中輕輕的左右搖晃，使其表面均勻平滑， 在室溫下晾干后進行活化。 本實驗用此法制備薄層板4片。,3、薄層板的活化 將涂布好的薄層板置于室溫涼干后，放在烘箱內(nèi)加熱活化，活化條件根據(jù)需要而定。硅膠板一般在烘箱中漸漸升溫，維持105110活化30min。氧化鋁板在200烘4h可得到活性為級的薄板，在150160烘4h可得活性為級的薄板。 活化后的薄層板放在干燥器內(nèi)保存待用。,4、點樣 先用鉛筆在距薄層板一端 1cm處輕輕劃一橫線作為 起始線，然后用毛細管吸 取樣品，在起始線上小心點樣，斑點直徑一般不超過2mm。,若因樣品溶液太稀，可重復(fù)點樣，但應(yīng)待前次點樣的溶劑揮發(fā)后方可重新點樣，以防樣點過大，造成拖尾、擴散等現(xiàn)象，而影響分離效果。若在同一板上點幾個樣，樣點間距離應(yīng)為1。 點樣要輕，不可刺破薄層。,5、展開 薄層色譜的展開，需要在密閉容器中進行。在層析缸中加入配好的展開溶劑，使其高度不超過1cm。將點好的薄層板小心放入層析缸中，點樣一端朝下，浸入展開劑中。蓋好瓶蓋，觀察展開劑前沿上升到一定高度時取出，盡快在板上標(biāo)上展開劑前沿位置。,晾干，觀察斑點位置，計算Rf值。,在特定的色譜系統(tǒng)中，化合物 的Rf值是一定的，比較未知物 和標(biāo)準(zhǔn)物的Rf值能夠作為鑒定 未知物的依據(jù)。,薄層色譜流動相及展開機制,TLC展開就是流動相沿薄層（固定相）運動，以實現(xiàn)樣品混合組分分離的過程。 選擇原則為“相似相容” 強極性試樣用強極性展開劑，弱極性試樣用弱極性展開劑，常用溶劑極性順序為： 乙烷二硫化碳苯四氯化碳二氯甲烷乙醚乙酸乙酯丙酮丙醇甲醇水,6、顯色 被分離物質(zhì)如果是有色組分，展開后薄層色譜板上即呈現(xiàn)出有色斑點。 如果化合物本身無色，則可用碘蒸氣熏的方法顯色。還可使用腐蝕性的顯色劑如濃硫酸、濃鹽酸和濃磷酸等。 對于含有熒光劑的薄層板在紫外光下觀察，展開后的有機化合物在亮的熒光背景上呈暗色斑點。,比較常用的顯色劑由兩種，碘和5%-10%硫酸甲醇溶液，一般的物質(zhì)在這兩種顯色劑中都能顯色。碘顯色的好處是顯完色后放置一段時間碘揮發(fā)后不影響你的點，缺點是它顯所有的點都是黃色的；硫酸顯色的顏色很豐富，可以根據(jù)顏色初步判斷物質(zhì)的種類，也可以判斷Rf值相同的點是否是同一物質(zhì)。,山楂的薄層鑒別： 供試液制備： 取本品粉末0.5g，加醋酸乙酯2ml浸漬24小時，取上清液作為供試品溶液。 對照液制備： 取熊果酸對照品加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作為對照品溶液。,點樣：供試品溶液點樣4ul，對照品溶液點樣2ul 展開劑：甲苯-醋酸己酯一甲酸(20：4：0.5) 顯色：噴以硫酸乙醇溶液(3 -10)，80加熱數(shù)分鐘，至斑點顯色清日析，置日光和紫外光燈( 365nm)下檢視。,色譜識別：日光下觀察，供試品色譜中部可見與熊果酸對照品相同的紫紅色斑點為主斑。紫外光燈下的熒光色譜除熊果酸顯橙黃色熒光斑點外，尚有其他熒光斑點，可供輔助鑒別。,五、實驗討論： 載玻片應(yīng)干凈且不被手污染，吸附劑在玻片上應(yīng)均勻平整。 點樣不能戳破薄層板面，各樣點間距1- 1.5cm，樣點直徑應(yīng)不超過2mm。 展開時，不要讓展開劑前沿上升至底線。否則，無法確定展