細(xì)胞工程-第十二章、試管動(dòng)物與克隆動(dòng)物.ppt

第十二章、試管動(dòng)物與克隆動(dòng)物,第一節(jié) 試管動(dòng)物,1978年7月25日深夜時(shí)分，英國(guó)曼徹斯特郊外的奧德姆總醫(yī)院里，一個(gè)女嬰的啼哭聲劃破夜空，震撼了世界她就是世界上第一例試管嬰兒路易斯.布朗。,一、試管動(dòng)物概念 將供體的精子和卵子在體外受精、體外培養(yǎng)胚胎，然后將發(fā)育到一定程度的胚胎移植入受體，可以得到各種動(dòng)物。由于體外受精一般都在試管內(nèi)進(jìn)行，所以稱為“試管動(dòng)物”。也有稱為“體外受精動(dòng)物”。,二、試管動(dòng)物的培育流程 精子的采集與體外獲能處理 卵子的回收與成熟培養(yǎng) 卵子與精子的體外受精 受精卵的體外發(fā)育 試管胚胎的移植,、精子的采集與獲能處理,精液的采取方法通常有：人工陰道法、電刺激法、陰道內(nèi)回收法等。 對(duì)于個(gè)體較大的動(dòng)物多采用人工陰道法，而對(duì)于小動(dòng)物而言多采用電刺激法采精。,人工陰道法,人工陰道法是由橡膠制造的雙層圓筒，兩層之間充以溫水（3840），后端有精液收集管以軟橡膠膜袋與人工陰道相連。對(duì)于公牛而言，一般多應(yīng)用臺(tái)畜使爬上，將假陰道自側(cè)面套在公牛陰莖上，使其射精。在公豬可以用豬用假陰道收集精液或用手握法采精，但仍需要臺(tái)畜，使其爬上以遍進(jìn)行操作。 另外，也可以用特制的電極，插到公畜的直腸內(nèi)，根據(jù)不同畜種給予不同的電流刺激，經(jīng)過(guò)不同的時(shí)間，即可射精而得到精液。,精液的保存,精液的保存可以分為常溫（1525）、低溫（05）和超低溫冷凍（79-196）三種，其目的是要降低精子的代謝活動(dòng)，延長(zhǎng)其存活時(shí)間，盡量保存其受精能力。 保存前，要加稀釋液，其成分按其作用可分為稀釋劑、營(yíng)養(yǎng)劑和保護(hù)劑等。 稀釋劑包括等滲氯化鈉溶液和某些鹽溶液， 營(yíng)養(yǎng)劑包括糖類、奶類和卵黃等， 保護(hù)劑包括有抗凍作用的營(yíng)養(yǎng)劑和其它一些如甘油、DMSO、糖類等。,三種保存方法,常溫保存主要通過(guò)降低pH值達(dá)到抑制精子的代謝活動(dòng)，一般可以保存2天以上。 低溫保存主要是抑制其正常的代謝活動(dòng)，除豬外，其它家畜的保存效果均較好。 如果應(yīng)用超低溫可以在液氮中長(zhǎng)期保存精液，用時(shí)可以即時(shí)解凍。 對(duì)于不同的動(dòng)物，各種保存液的配制方法都有所差異的。,人為使得精子獲能,可以利用自然交配法，即在交配后，由雌性生殖道回收精子。 而雌性生殖道獲能沒有種屬特異性，因而可以由屠宰場(chǎng)取任何的動(dòng)物的子宮或在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)取小動(dòng)物的子宮給所需動(dòng)物的精子獲能。 另外，可以利用人工配制的培養(yǎng)液使得精子獲能。,、卵子的回收與成熟培養(yǎng),人工采卵是得到卵母細(xì)胞的方法通常利用激素進(jìn)行誘導(dǎo)采卵或超數(shù)采卵?？梢岳么傩韵偌に鼗螯S體激素釋放激素（LHRH），對(duì)小鼠、大鼠和兔子等動(dòng)物進(jìn)行一次性投與誘發(fā)其排卵，排卵數(shù)目不變。 以小鼠為例，通常可用35IU PMSG或23IU hCG或100g FSH 或100gLH或0.020.05g LHRH皮下或腹腔內(nèi)注射，1214小時(shí)可以有70100正常排卵。,采卵,（）輸卵管內(nèi)采卵：以鼠為例，一般為了防止干燥可將屠殺后取出的輸卵管放在平皿內(nèi)，用石蠟油覆蓋，在實(shí)體顯微鏡下找到輸卵管膨大部，用磨尖的鐘表鑷子，切開輸卵管膨大部，使內(nèi)容物溢出而找到卵。 （）對(duì)于稍大一些的動(dòng)物可以用活體輸卵管采卵，例如將兔子的腹部正中線切開，找出子宮角和輸卵管。然后利用逆向沖卵法，自子宮輸卵管連接處插入注射針，傘部以平皿接著沖洗；或在子宮輸卵管連接處下1cm處，剪成V形小口，插入塑料細(xì)管，自傘部輸卵管腹腔口插入，將液體推入，得到?jīng)_出的卵。,（3）對(duì)于屠宰場(chǎng)中的大中型動(dòng)物，可以用注射器插入卵泡中抽取，或在手術(shù)后暴露卵巢，以注射器自卵泡中取卵。 （）對(duì)人而言通常在超數(shù)排卵步驟處理后，用B超檢測(cè)卵巢表面卵泡發(fā)育情況，然后，在腹腔后部體壁進(jìn)行局部麻醉，將腹腔鏡望遠(yuǎn)鏡插管插入，以觀察卵巢表面卵泡成熟情況，然后用套有聚四氟乙烯套管的吸卵針將卵吸出，放平皿中檢查。,卵母細(xì)胞一般檢測(cè),得到卵母細(xì)胞后，可根據(jù)卵泡發(fā)育的不同時(shí)期，在顯微鏡下檢查核和胞質(zhì)發(fā)育的狀況，如核的形態(tài)、位置和所處的時(shí)期。 排出的卵母細(xì)胞，有多層卵丘細(xì)胞包圍，除去卵丘細(xì)胞后，可以見到卵周隙增大，內(nèi)有第一極體，核處于第二次成熟分裂中期。 多數(shù)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的卵母細(xì)胞胞質(zhì)呈透明狀，但由于胞質(zhì)中富含大量脂滴和空泡，所以在鏡下呈暗色。 各種不同的動(dòng)物，按照不同的分類標(biāo)準(zhǔn)，卵的分類可以分為優(yōu)秀、普通、不良和異常卵。 進(jìn)行體外受精的卵母細(xì)胞，一般以卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體外面完整地包有34層卵丘細(xì)胞，卵母細(xì)胞胞質(zhì)無(wú)斑塊者為佳。,鏡檢卵母細(xì)胞,如果新鮮或固定后要作整體觀察，可以取凡士林石蠟（1：1）融化后滴于載片中部四角，在鏡下用微吸管自平皿中吸取卵母細(xì)胞，滴到4滴凡士林石蠟滴的中央，蓋上蓋片并輕壓之，即可置于相差顯微鏡下觀察。 如果要觀察細(xì)節(jié)，需要染色、切片后觀察。一般在卵固定后水洗染色，用瓊脂與石蠟進(jìn)行雙重包埋，最后進(jìn)行切片、脫臘和封固，進(jìn)行觀察。,、體外受精,1951年Chang和Austin發(fā)現(xiàn)了精子的獲能現(xiàn)象，為體外受精的實(shí)現(xiàn)打開了通路。 1954年，Thibault等獲得第一只體外受精的兔子。隨著研究深入，試管老鼠、試管豬、試管牛等相繼產(chǎn)生。 1978年，Steptoe和Edwards制成了世界上的一例“試管嬰兒”，至此，體外受精技術(shù)逐漸成熟。,過(guò)程,獲得獲能的精子和成熟的卵母細(xì)胞后，應(yīng)在塑料平皿底部，用已經(jīng)處理獲能的精子浮游液5l精子浮游液，注入小滴中，將成熟培養(yǎng)后的卵母細(xì)胞，或自體內(nèi)手術(shù)沖出的卵母細(xì)胞，以BO液沖洗，用微吸管吸10個(gè)卵母細(xì)胞與少量BO液注入精子浮游液小滴中。在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7小時(shí)后再經(jīng)微量吸管自小滴中用BO液多次沖洗以洗去多余的精子。然后移入發(fā)育培養(yǎng)液（TCM19910FCS）繼續(xù)培養(yǎng)。,顯微操作協(xié)助受精,在顯微操作儀下進(jìn)行顯微受精，即對(duì)哺乳動(dòng)物的精子和卵母細(xì)胞，進(jìn)行顯微操作，促使其相互結(jié)合技術(shù)，這可以解除透明帶和質(zhì)膜對(duì)精子的阻擋作用。 1976年，Uehara和Yanagimachi將倉(cāng)鼠或人的精子在顯微操作儀下，通過(guò)顯微工具，注射到倉(cāng)鼠卵母細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，使精子核在卵胞質(zhì)中染色體解螺旋形成了原核。隨后，又深入研究了操作技術(shù)，分成了卵胞質(zhì)內(nèi)精子注射、透明帶下注射、透明帶鉆孔和透明帶部分切口等幾種。,卵母細(xì)胞質(zhì)內(nèi)注射,卵母細(xì)胞質(zhì)內(nèi)注射，是將整個(gè)精子或精子頭部直接注射到卵母細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。要求注射針的尖端必須鋒利，注射吸管內(nèi)徑通常為510m，并盡量避免液體進(jìn)入卵胞質(zhì)。此方法可以使任何類型的精子如精子頭形不正常、死精子或嚴(yán)重缺陷的精子等，可省去獲能和頂體反應(yīng)。 還可以將1個(gè)或多個(gè)精子注入透明帶下，可以一步直接將精子注射到卵周隙，也可以先將透明帶鉆孔或部分切口后，再進(jìn)行精子注射。使用的精子應(yīng)該是獲能和發(fā)生頂體反應(yīng)的。當(dāng)然，當(dāng)注射多個(gè)精子時(shí)可能發(fā)生多精受精現(xiàn)象。,單精子卵胞漿內(nèi)顯微注射,其它一些方法,如果在透明帶上人為鉆孔后，可以為精子入卵提供機(jī)會(huì)，或者是易于精子入卵。可以先用固定吸管固定住卵，然后將吸滿酸性臺(tái)氏液（pH2.5）的微吸管沿卵外周切線方向往透明帶上射出穩(wěn)定的液流。當(dāng)透明帶上溶出小孔后，即可撤走注射針。將卵洗滌后，再用適當(dāng)密度的精子進(jìn)行受精。 先用胰麋蛋白酶軟化透明帶，然后用纖細(xì)的針在透明帶上扎針孔，本法適用于精子運(yùn)動(dòng)乏力或少精癥不育患者的治療。通過(guò)該技術(shù)已經(jīng)使得小鼠獲得了超過(guò)30的妊娠或出生率，而且并沒有增加孤雌活化率和多精受精率。 另外，可以用微細(xì)玻璃針或金屬微刀片，在透明帶上切開或挑開或撕開一個(gè)口，再經(jīng)適當(dāng)濃度精子受精。,、受精卵的體外發(fā)育,受精卵需在培養(yǎng)液（或輸卵管）中發(fā)育到桑葚胚或囊胚后移植到受體，才能獲得較高的妊娠率。 目前體外培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物早期胚胎（受精卵）主要障礙是發(fā)育阻滯。,為了克服阻滯現(xiàn)象，有助于產(chǎn)生高質(zhì)量的桑差或囊胚胚胎，主要采取以下方法：利用臨時(shí)中間受體，即把牛體外受精卵放人結(jié)扎的中間受體兔或綿羊的輸卵管中，培養(yǎng)至桑葚胚或囊胚，再移植到受體或冷凍保存。此方法優(yōu)點(diǎn)是胚胎質(zhì)量高，能耐受冷凍保存。但操作過(guò)程復(fù)雜，胚胎丟失嚴(yán)重，不適合胚胎的大批量生產(chǎn)。Yadav等研究發(fā)現(xiàn)，同源或異源輸卵管細(xì)胞共同培養(yǎng)都能顯著提高水牛早期胚胎的卵裂和發(fā)育。利用體細(xì)胞在體外與受精卵共同培養(yǎng)，促進(jìn)胚胎發(fā)育，獲得了較高的囊胚發(fā)育率。Brackett等在復(fù)雜的血清添加培養(yǎng)液(TCM199十血清)中加入體細(xì)胞共培養(yǎng)獲得40 的牛囊胚發(fā)育率,、試管胚胎的移植,參照胚胎工程,三、試管動(dòng)物的研究意義,可以用來(lái)研究受精機(jī)理， 治療人類男性和動(dòng)物的生殖不育， 可以利用體外受精卵的發(fā)育狀況或染色體核型檢測(cè)用來(lái)檢測(cè)形態(tài)不正常精子其染色體是否正常， 可以產(chǎn)生大量的動(dòng)物個(gè)體， 還可以簡(jiǎn)化煩雜的凍精技術(shù)，或許只保存核物質(zhì)，就可以達(dá)到受精的目的，這對(duì)保護(hù)珍貴的動(dòng)物資源，將起到重要的作用。,第二節(jié)、克隆動(dòng)物 通過(guò)無(wú)性繁殖的手段，獲得的遺傳背景一致的動(dòng)物群體。,一、概念,是指遺傳上完全相同的分子、細(xì)胞或來(lái)自同一祖先的生物個(gè)體的無(wú)性繁殖群體。 關(guān)鍵技術(shù)核移植。,二、克隆程序 核供體動(dòng)物的選擇與細(xì)胞核的獲得。 核受體動(dòng)物的選擇與細(xì)胞核的移出。 供體核的移入及原核的取出。 胚泡的體外試管培養(yǎng)。 代母的選擇與胚泡移入子宮。 克隆動(dòng)物的體內(nèi)發(fā)育與出生。,最早培育出的克隆動(dòng)物,1952年，美國(guó)人羅伯特布里格斯和T.J.金對(duì)豹蛙發(fā)育到胚囊期的胚胎細(xì)胞做移核試驗(yàn)，成功地獲得了一個(gè)可以攝食的豹蛙幼體。 1958年到1962年，英國(guó)劍橋大學(xué)利用爪蟾原腸內(nèi)胚層細(xì)胞核移植，培育出可育的非洲爪蟾。,里程碑式的突破,1996-1997年首只體細(xì)胞克隆動(dòng)物“多莉”羊的成功證明了成熟的體細(xì)胞也具有全能性。,多莉培育者之一 伊斯維姆.穆特,三、應(yīng)用與意義 （1）檢驗(yàn)動(dòng)物細(xì)胞全能性 （2）加速動(dòng)物繁殖、優(yōu)良育種、 保護(hù)珍貴動(dòng)物。 （3）克隆動(dòng)物的遺傳背景相同，因此它們是模擬疾病、基因治療、器官移植等研究的良好實(shí)驗(yàn)材料，具有良好的穩(wěn)定性和重復(fù)性。 （4）可以用患者本人細(xì)胞培育出新組織。,四、 克隆人,、克隆人制備過(guò)程,將普通的男性細(xì)胞或者是主體細(xì)胞和一枚女性卵子結(jié)合起來(lái)，儲(chǔ)存于女性卵子中的遺傳信息將事先被消除。通過(guò)細(xì)胞分裂形成的胚胎應(yīng)只帶有這名男性的全部遺傳信息，最后將胚胎移植到女性子宮中，獲得男性克隆后代。 當(dāng)然，如果一對(duì)夫婦愿意的話，也可以克隆女性。,克隆的人類胚胎,ACT公司的研究人員將一枚卵細(xì)胞中的DNA全部剔除，然后用一枚成年人皮膚細(xì)胞中的細(xì)胞核替代上述DNA，由于這個(gè)卵細(xì)胞事先經(jīng)過(guò)受精，所以開始自然分裂，但它并沒有發(fā)育成一個(gè)嬰兒，而是演變成干細(xì)胞，研究人員得到3個(gè)早期胚胎，其中兩個(gè)發(fā)育到4細(xì)胞階段，另一個(gè)至少發(fā)育到6細(xì)胞階段。 由于這證明人體單個(gè)細(xì)胞的遺傳物質(zhì)能被誘導(dǎo)發(fā)育成為幼胚胎，因此這項(xiàng)研究被認(rèn)為是向著克隆人的方向邁出了關(guān)鍵一步。,但他們強(qiáng)調(diào)：不會(huì)制造用于生育目的的胚胎，他們的研究是為了幫助病人。威斯特將這一成果稱為走向醫(yī)學(xué)新時(shí)代的“蹣跚第一步”，是治療性克隆研究中的重大突破，將幫助研究人員找到治療帕金森綜合征、糖尿病和早老性癡呆等疾病的方法。,、克隆人最新進(jìn)展,2003年1月第1個(gè)克隆人？ 11月26日，安蒂諾里在羅馬再次引爆了輿論炸彈。他在記者招待會(huì)上透露：一名懷有克隆胚胎的婦女已懷孕33周。B超顯示，胎兒為男性，目前重約2.7公斤，發(fā)育良好。如果一切順利的話，世界上第一個(gè)“克隆人”將于年1月的第一個(gè)星期誕生。,3、有關(guān)克隆動(dòng)物與人存在的問題,（1） 技術(shù)尚不成熟,得到的克隆動(dòng)物具有極大的偶然性和隨機(jī)性。迄今為止，克隆試驗(yàn)的成功率始終很低。例如，在培育多莉的過(guò)程中，科學(xué)家共克隆出 個(gè)綿羊胚胎，最終成功使母羊受孕并生產(chǎn)的只有多莉一個(gè)。 目前，多莉羊的制備還不能重復(fù)，更不能肯定克隆多莉羊的方法也適用于其它動(dòng)物或其它不同組織器官的細(xì)胞。,（2） 遺傳、疾病問題,克隆動(dòng)物夭折率高，不少克隆動(dòng)物天生患有疾病或體形過(guò)大。 克隆動(dòng)物沒有遺傳物質(zhì)的交流和互補(bǔ)，將會(huì)加劇一些遺傳疾病的發(fā)生。,（3） 社會(huì)、倫理學(xué)問題 一個(gè)例子人+動(dòng)物,中山醫(yī)科大學(xué)陳系古教授等于2001年1月以來(lái)，先后使用“核移植”技術(shù)，將人類皮膚細(xì)胞核移植到家兔卵母細(xì)胞中，經(jīng)過(guò)多次實(shí)驗(yàn)，成功克隆出多個(gè)人類胚胎，其中部分發(fā)育到“桑葚胚”階段。這是國(guó)際上首次用該技術(shù)克隆出人類胚胎。 但有些學(xué)者就對(duì)在家兔卵母細(xì)胞中克隆出人類胚胎的提出質(zhì)疑，認(rèn)為這是違背人類倫理的“科學(xué)”實(shí)驗(yàn)。,聽一聽：關(guān)于克隆人的爭(zhēng)論,贊同的,迄今為止，公開宣稱要進(jìn)行克隆人的只有3家： 一個(gè)是意大利婦科專家安蒂諾利。 一個(gè)就是在美國(guó)開公司的法國(guó)女科學(xué)家布利吉特布瓦瑟利耶。 一個(gè)是美國(guó)專家扎沃斯。,意大利醫(yī)生 安蒂諾里 克隆人的帶頭人,冒死也要克隆人的科學(xué)家布瓦瑟利耶,反對(duì)的,“多利羊”之父反對(duì)克隆人,中國(guó)日?qǐng)?bào)網(wǎng)站消息：被譽(yù)為“多利羊”之父的英國(guó)科學(xué)家威爾穆特1月4日稱，“多利羊”感染了早期關(guān)節(jié)炎，哺育動(dòng)物的克隆安全問題再度受到質(zhì)疑。威爾穆特呼吁，反對(duì)任何克隆人的計(jì)劃。 “我認(rèn)為，已經(jīng)有足夠的證據(jù)表明，克隆人的行動(dòng)是完全不負(fù)責(zé)任的?！彼f(shuō)，克隆技術(shù)目前還存在很多不確定因素，他們?cè)趯?duì)動(dòng)物進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時(shí)經(jīng)常遇到大量畸形或異常情況，因此克隆技術(shù)目前不適合用于人類。,任何克隆動(dòng)物都有基因上的缺陷。 克隆羊和克隆牛都有體形過(guò)度龐大的問題。該缺陷在克隆鼠身上也存在