科學(xué)精神的培養(yǎng)二科研的基本訓(xùn)練.ppt

科學(xué)精神的培養(yǎng) （二）科研的基本訓(xùn)練,研究生的實(shí)驗(yàn)室素養(yǎng),本講內(nèi)容 聲明：部分來自唐朝樞教授二十年之傳授,研究方向的確定 如何學(xué)習(xí)及整理文獻(xiàn) 如何撰寫綜述及研究論文 如何進(jìn)行科研課題設(shè)計(jì) 選題和制定研究計(jì)劃 研究對象、方法的選擇 快速適應(yīng)實(shí)驗(yàn)室并開展科研訓(xùn)練 總結(jié)和撰寫論文、基金申請 ,為什么要考研?,或者說，你從事科學(xué)研究的主要動機(jī)和最大動力是什么？ 至少，上研究生能得到哪些收獲？,沒有標(biāo)準(zhǔn)答案！,高端人才必由之路：碩士、博士、博士后、副高、正高、博導(dǎo)、院士想在專業(yè)上成就 等于升一級職稱，干嘛不 專業(yè)不喜歡，改變自己職業(yè)方向 當(dāng)醫(yī)生到處挨打，怕了，找地方躲躲看 畢業(yè)沒想好干什么。又沒拿什么證，只好考研（隨大溜） 研究生擴(kuò)招，趕末班車 本科壓根就找不到工作 找到工作，工資太低 躲開就業(yè)高峰 知識改變命運(yùn) 想出國 就是對科研感興趣 哼！虛偽,總之，要上學(xué)！ 那么，學(xué)什么好呢？,科學(xué)方法遠(yuǎn)比科學(xué)發(fā)現(xiàn)重要卡爾薩根 科學(xué)與偽科學(xué)之間最顯著的區(qū)別或許在于，科學(xué)比偽科學(xué)更強(qiáng)烈地認(rèn)識到人的不完善性和不可靠性 倘使我們只講授科學(xué)的發(fā)現(xiàn)和成果，就算這些發(fā)現(xiàn)和成果十分有用甚至激動人心，而不傳授批判性的科學(xué)方法，怎么能指望普通人將科學(xué)與偽科學(xué)加以區(qū)分？ “培養(yǎng)判斷力”似乎是正確答案,我們上研究生究竟要學(xué)什么？,研究生的實(shí)驗(yàn)室修養(yǎng),基本科研訓(xùn)練 選題和科研設(shè)計(jì) 建立實(shí)驗(yàn)程序和做實(shí)驗(yàn)記錄 分析結(jié)果得出結(jié)論 合作、表達(dá)交流 撰寫綜述和論著、申請基金,基本科研訓(xùn)練,“六能力”： 文獻(xiàn)處理能力 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)能力 實(shí)驗(yàn)操作能力 寫作能力 合作交流能力 申請基金能力,1.重塑知識結(jié)構(gòu)： “三三之比” “敲門磚”和“金鑰匙” 臨床醫(yī)師與科學(xué)素養(yǎng) 擇業(yè)有幫助 應(yīng)該持續(xù)終生,2.實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)能力-核心是選題,“三定” 定方向10年 定領(lǐng)域：510年 定課題2年,“四要點(diǎn)” 目的明確 依據(jù)充分 設(shè)計(jì)合理 方法恰當(dāng),如何選題和進(jìn)行科研設(shè)計(jì)？,“五性” 先進(jìn)性(advance) 獨(dú)創(chuàng)性(originality) 實(shí)用性(practicality) 可行性(feasibility) 影響力(citation),五要素“5 Re”： Real (reliable) Repeatable Record (complete) Relationship (to others) Respect (your patients and animals),設(shè)計(jì)的重要性,科研設(shè)計(jì)是科研的靈魂 沒有“設(shè)計(jì)”就沒有科研 嚴(yán)密的設(shè)計(jì)是取得有價(jià)值結(jié)果的先決條件,內(nèi)容包羅萬象,是研究無主題的反映 本研究要解決的問題？ 逮著什么算什么！ 缺乏嚴(yán)格的設(shè)計(jì)或無設(shè)計(jì)，這類研究即使有重要的發(fā)現(xiàn)也屬偶然,設(shè)計(jì)的要素、原則和分類,三要素： 對象 指標(biāo) 結(jié)果,設(shè)計(jì)類型： 配對 成組 析因設(shè)計(jì) 正交設(shè)計(jì) 單因素 多因素 。,四原則： 隨機(jī) 對照 重復(fù) 均衡,病例臨床治療總結(jié) 個(gè)案報(bào)道 量表評定 隨機(jī)對照試驗(yàn) 系統(tǒng)綜述 單因素設(shè)計(jì)與多因素設(shè)計(jì) 回顧性分析 前瞻性設(shè)計(jì) ,無論哪種： 是否有嚴(yán)格界定的的研究對象？ 事先是否有樣本估計(jì)？ 是否有適合的測量指標(biāo)？ 是否使用了正確的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法？ 是否充分隨機(jī)化，入組、分組、測定？ 終點(diǎn)事件是否足夠、合理 是否符合倫理學(xué)要求？,設(shè)計(jì)的分類和要素（續(xù)）,實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的核心是選題,選題的核心是什么？ 創(chuàng)新性！ Originality,抗血管生成理論鼻祖Folkman的故事,1953年畢業(yè)于俄亥俄州立大學(xué)，1957年哈佛大學(xué)醫(yī)學(xué)院，波士頓兒童醫(yī)院小兒外科主任 上世紀(jì)60年代早期在國家海軍醫(yī)學(xué)中心服役期間，他的有關(guān)理論的雛形已經(jīng)形成 OReilly&Folkman, 1994 in Cell angiostatin血管抑素 OReilly&Folkman, 1995 in Nat Med OReilly&Folkman, 1997 in Cell endostatin內(nèi)皮抑素 極富創(chuàng)新意識，且新意不斷，從不同方面思考問題，在許多領(lǐng)域靈感四逸。如唐氏綜合征患者發(fā)生癌癥的幾率遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于正常人群，這可能與21號染色體的第三個(gè)副本有關(guān) 腫瘤新生血管生成理論認(rèn)為，一旦阻斷腫瘤新生血管生成切斷營養(yǎng)供給，腫瘤將停止生長、萎縮直至死亡。該理論為“抗腫瘤血管生成治療”這一全新的癌癥研究方向奠定了基礎(chǔ)，并據(jù)此理論開發(fā)出了諸如阿瓦斯丁（Avastin, Genentech）等十幾種新藥,Judah Folkman教授,最重要的是原始創(chuàng)新 血管抑素和內(nèi)皮抑素的發(fā)現(xiàn),1983年Folkman的兩位博士后從大鼠腫瘤中分離出一種蛋白：堿性纖維母細(xì)胞生長因子（bFGF）,其觀點(diǎn)才得到證實(shí)。繼bFGF之后，VEGF等因子相繼被發(fā)現(xiàn)，逐漸確立了血管形成理論 從實(shí)驗(yàn)中偶然發(fā)生污染，F(xiàn)olkman實(shí)驗(yàn)室從酵母菌中分離出夫馬菌素（fumigillin），動物實(shí)驗(yàn)證實(shí)其可以使腫瘤縮小。從荷Lewis肺癌小鼠的尿液中尋找新生血管抑制劑又導(dǎo)致了血管抑素和內(nèi)皮抑素等原發(fā)癌分泌的新生血管抑制劑的發(fā)現(xiàn),腫瘤,B組：腫瘤+切斷不摘除,A組：腫瘤+傳統(tǒng)切除,C組：腫瘤+假手術(shù),血管抑素和內(nèi)皮抑素,它們解釋腫瘤自限性生長、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移癌的快速生長隨著原發(fā)瘤的去除，新生血管抑制因子的水平也相應(yīng)降低。循環(huán)中缺少了新生血管抑制因子，轉(zhuǎn)移灶不再受到限制，進(jìn)而快速生長（原發(fā)瘤抑癌） 正常和荷Lewis肺癌小鼠眼角膜的微小室中持續(xù)釋放bFGF，正常小鼠新毛細(xì)血管開始生長而荷Lewis肺癌小鼠的新生血管化被完全抑制：證實(shí)原發(fā)瘤可以限制遠(yuǎn)端由bFGF誘導(dǎo)的血管形成（手術(shù)的價(jià)值以及手術(shù)切除合并抗血管治療的必要性的探討） 摘除原發(fā)灶后，小鼠分別被給予血管抑素和安慰劑，與對照組相比，血管抑素治療組的轉(zhuǎn)移灶無論在數(shù)量上還是體積上均明顯減少。對照組腫瘤新生血管旺盛，而治療組轉(zhuǎn)移灶在鏡下觀察不到新生血管（觀察血管抑素是否能抑制轉(zhuǎn)移灶的生長） 恩度(重組人血管內(nèi)皮抑制素注射液)上市,選題出發(fā)點(diǎn),從臨床來和回到臨床去 短平快與長深久 找出本人和本單位優(yōu)勢 強(qiáng)強(qiáng)組合 力所能及,研究對象的選取,人優(yōu)于其它 差異和多樣性 群體研究和個(gè)體研究 動物模型和細(xì)胞模型的目的 動物模型和細(xì)胞模型的選擇,設(shè)定指標(biāo)與實(shí)驗(yàn)分組 根據(jù)研究目的設(shè)定指標(biāo)：以少為佳 按照統(tǒng)計(jì)學(xué)要求分組 對照組的必要性 對照的選取 根據(jù)對象/對照選擇正確的統(tǒng)計(jì)方法,建立實(shí)驗(yàn)程序和做實(shí)驗(yàn)記（1）,實(shí)驗(yàn)程序的建立 目標(biāo)內(nèi)容方法 方法的選擇 A 照搬現(xiàn)成方法 B 重新建立方法 C 改動已有方法 研究生通病：改MOP 預(yù)實(shí)驗(yàn)的必要性,方法選擇原則 針對性強(qiáng) 一對一解決問題 可重復(fù)性和準(zhǔn)確性 簡為上 不求全,建立實(shí)驗(yàn)程序和做實(shí)驗(yàn)記（2）,實(shí)驗(yàn)技巧 條理化 順序性 one by one 并行 對照性記錄 實(shí)驗(yàn)好習(xí)慣,實(shí)驗(yàn)記錄表格化： 1、原始記錄表 2、單項(xiàng)歸納表 3、匯總表 推薦使用Excel表（例數(shù)1000）和SPSS表,1、原始記錄表（流水賬）,2、單項(xiàng)歸納表（階段小結(jié)/13個(gè)月）,3、匯總表（下為論文中的“三線表”）,Age Height Weight BMI BP TGFmRNA TGF蛋白 X均值S X2 P df,分析結(jié)果得出結(jié)論（1）,如何面對結(jié)果？ 與預(yù)計(jì)相符的結(jié)果 禁止舍棄部分?jǐn)?shù)據(jù)使之與設(shè)想相符 直觀結(jié)果與統(tǒng)計(jì)結(jié)果 一旦結(jié)果與預(yù)計(jì)不符，我們?nèi)绾螌ふ以?？是操作失誤還是？,統(tǒng)計(jì)學(xué)與結(jié)果 從設(shè)計(jì)一開始就選擇正確的統(tǒng)計(jì)方法：如變量的選擇重點(diǎn)和首先要看的變量是否為正態(tài)分布 透過表面看統(tǒng)計(jì)：是否真有“差異”，即差異是否有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的顯著性 人：多因素分析 動物和細(xì)胞模型：單因素分析,分析結(jié)果得出結(jié)論（2）,數(shù)據(jù)核實(shí)與誤差分析 資料核實(shí)：是否匹配、分層，分組是否合理 數(shù)據(jù)核實(shí)與誤差分析：區(qū)分偶然誤差和系統(tǒng)誤差 方法評估 善于找出新發(fā)現(xiàn)或與文獻(xiàn)矛盾之處 不懷疑并充分重視新發(fā)現(xiàn),補(bǔ)漏： 增加對照組數(shù)目和例數(shù) 例數(shù)不夠統(tǒng)計(jì)學(xué)要求 重復(fù)出現(xiàn)系統(tǒng)誤差的實(shí)驗(yàn) 補(bǔ)充對照 反復(fù)核實(shí)反對前人論點(diǎn)的主要證據(jù) 設(shè)計(jì)新的反證 擴(kuò)充和深化課題,陰性結(jié)果表明了什么?,真陰性(true negative)，即實(shí)驗(yàn)藥物沒有療效； 假陰性(type II error 或 beta)，即實(shí)驗(yàn)藥物有療效，但檢測不出來，或者說Power不夠大。Power與樣本數(shù)大小有關(guān), 樣本數(shù)增加,則Power增加； 如何知道樣本數(shù)是否足夠? 可計(jì)算Power。 只有假陰性的情況，通過增加樣本數(shù)，才會造成療效結(jié)果的差異呈現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，即呈現(xiàn)本來就存在的陽性結(jié)果。 對于真陰性, 無論樣本多大，差異都不會轉(zhuǎn)變。 設(shè)計(jì)良好的臨床實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)開始前，就應(yīng)計(jì)算好具體的樣本數(shù)，以滿足于足夠的Power(至少達(dá)到80%)。,陽性結(jié)果又表明了什么?,真陽性，即實(shí)驗(yàn)藥物確實(shí)有療效； 假陽性 (type I error或 alpha)。雖然允許假陽性的發(fā)生機(jī)率一般預(yù)先設(shè)定為小于0.05，但是，當(dāng)用于表達(dá)療效的指標(biāo)為多項(xiàng)(multiple outcomes)或試驗(yàn)組為多組(multiple comparison groups)時(shí)，假如仍按原來設(shè)定作為判斷每一個(gè)統(tǒng)計(jì)比較是否則有意義時(shí)，會出現(xiàn)總假陽性機(jī)率增加并超過0.05，或更高。 解決方法之一為縮小域值(如Bonferroni correction) 臨床試驗(yàn)報(bào)告中把增加的假陽性結(jié)果與其它作為陽性結(jié)果一起報(bào)道的例子不少見，即使刊登在著名醫(yī)學(xué)學(xué)術(shù)期刊上的不少論文，作者似乎未曾考慮過或文中沒有任何關(guān)于控制假陽性的描述。,結(jié)果無法重現(xiàn)怎么辦？,發(fā)表論文時(shí)，詳寫操作，試劑，目的是為保證別人重現(xiàn)結(jié)果。因此，自己的實(shí)驗(yàn)在同一條件下進(jìn)行。 我們在實(shí)驗(yàn)過程中，確實(shí)也發(fā)現(xiàn)某些實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)較難重復(fù)。原因： 試劑純度不符合要求或使用了不同批次、廠商的試劑； 實(shí)驗(yàn)對象有變：動物品系不純、細(xì)胞來源不明 反應(yīng)的操作存在誤差：突出表現(xiàn)在稱量、加樣等環(huán)節(jié)； 為了保證實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的可重復(fù)性，我們必須遵循或者建立一套標(biāo)準(zhǔn)的反應(yīng)流程(Mannuals of Operation Protocols Standard, MOPS)或SOP(Standard Operation Protocol),研究生通病：改MOP,為什么技術(shù)員老師次次都能做出來的實(shí)驗(yàn)我不能？ 按照一套標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行操作，對于新手更為重要 事實(shí)上，很多文獻(xiàn)的處理方法是不完善的，也在不斷變化的。所以才會有專門的叢書來總結(jié)。 有些文獻(xiàn)的結(jié)果是很難重復(fù)的 有些操作是完全沒有必要的 有些是錯(cuò)誤的 也有可能作者故意有所保留。 提高我們的實(shí)驗(yàn)室素養(yǎng)，其中之一就在于判斷文獻(xiàn)的正確與否，而不是盲從。,研究生是怎樣煉成的,首先，天天泡在實(shí)驗(yàn)室，先當(dāng)下手，套近乎， 想一想，為什么要這樣操作，不懂就問 其次，不要在沒有弄清楚原因的情況下，盲目再進(jìn)行相同的實(shí)驗(yàn)操作。 做一次試驗(yàn)，就要排除一個(gè)可能的因素。 最重要的：留出時(shí)間思考！ 不要怕導(dǎo)師說你實(shí)驗(yàn)少，就開一大堆試驗(yàn)陷于大量的體力勞動。 例1：兒科腎病組-范青峰，導(dǎo)師 丁潔 例2：神經(jīng)內(nèi)科-洪道俊， 導(dǎo)師 袁云,研究生是怎樣煉成的（續(xù)）,不要馬上按照文獻(xiàn)方法去試。應(yīng)反復(fù)調(diào)研文獻(xiàn)： 要得到目標(biāo)，有哪些方法 每種方法的優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)是什么，比較后再開始。 文獻(xiàn)的每一個(gè)細(xì)節(jié)，要問問什么這么做？ 如果不這樣做，后果是什么？用其他方法代替？ 參考其他同類文獻(xiàn)，別人的實(shí)驗(yàn)步驟又是如何？ 他們做了什么改動？為什么要這樣改動？ 培養(yǎng)判斷力，積累經(jīng)驗(yàn)和知識。 有人一直到博士畢業(yè)了，這些問題都沒有解決,實(shí)驗(yàn)室三寶：筆、本、簽,記號筆。要隨身帶。試管，試劑瓶等用一個(gè)編號一個(gè)，不要怕麻煩，一目了然，常常絞盡腦汁回想 小本或紙，最好用原始記錄本，作一步寫一步，有了靈感馬上記下來。下班前往記錄本上寫 標(biāo)簽label。有時(shí)記號筆寫不了，或是需要保存，最好貼上簽，并在本上記錄好。,大口袋工作服劍橋大學(xué)，UK,細(xì)節(jié)決定成敗，性格決定命運(yùn),Memo everyday: 該放回冰箱的東西是否放回了？ 冰箱門是否關(guān)嚴(yán)了？ 公用的東西是否還原了？ 要清洗的儀器、瓶子是否泡上了？ 試驗(yàn)臺面是否清理了？ 儀器的電源是否關(guān)掉了？門窗是否關(guān)好了？ 試驗(yàn)記錄是否及時(shí)寫了？ 明天要做什么心里是否有個(gè)譜！ 每一次錯(cuò)誤后都要認(rèn)真找原因 再沒有找到原因前不要急著進(jìn)行下一次試驗(yàn)。,合 作,Always think of others! Its a small world! Be popular! “以人為本” 有團(tuán)隊(duì)就有紀(jì)律,物歸原處 幫助別人等于幫助自己 保護(hù)他人就是愛護(hù)自己，杜絕不良操作 環(huán)保：公共空間+環(huán)境 多發(fā)現(xiàn)別人的長處，不互相埋怨、推諉,不良操作和現(xiàn)象,實(shí)驗(yàn)前：私拿老師準(zhǔn)備好的器皿，事后不吱聲；翻別人抽屜和桌面；不按流程操作，或照搬未吃透的方法；不聽勸解 實(shí)驗(yàn)后：不清洗、不歸位、不清理、不交接； 不愛護(hù)設(shè)備：未經(jīng)培訓(xùn)考核通過擅自使用，超轉(zhuǎn)速不配平離心，出故障不報(bào)告（無論誰弄壞） 沒有安全意識：高溫烤箱里放有機(jī)試劑；“明火倒油”；煮沸水浴過夜；普通高壓鍋離人，不鎖門 不做輪值：從來不打蒸餾水，不倒垃圾，臺面不整理,原因一：學(xué)生自身,以個(gè)人為中心，不考慮或少考慮他人 缺乏團(tuán)隊(duì)精神：沒有用完的kit、試劑，經(jīng)驗(yàn)教訓(xùn)，不交接，甚至是同一個(gè)導(dǎo)師！ 愛占便宜，依賴性強(qiáng)：表現(xiàn)為順手牽羊 自以為是，不尊重技術(shù)員：表現(xiàn)為常有理 兩面派，編瞎話：表現(xiàn)為欺軟怕硬，眼朝上，但又有眼力，黨同伐異 沒禮貌，缺乏教養(yǎng)：說話不客氣，行為乖張,原因二：導(dǎo)師,不管品質(zhì)如何，分高即取； 重才輕德：只要出文章；小節(jié)不拘； 個(gè)人感情至上：愛偏聽偏信； 過于相信學(xué)生能包打天下，或懶于監(jiān)督； 不進(jìn)實(shí)驗(yàn)室，缺乏對科研的感性認(rèn)識； 生怕出事，對學(xué)生要求不嚴(yán)； 看文獻(xiàn)少，被學(xué)生忽悠！,好人好事,主動熱情，拿實(shí)驗(yàn)室當(dāng)自己的家，遇到不正確操作能開口糾正，關(guān)心同伴例子：劉曉燕（導(dǎo)師-秦炯） 尊重老師，自覺維護(hù)公共環(huán)境，眼里有活例子：欒興華（導(dǎo)師-袁云） 謹(jǐn)慎小心，不懂就問，主動幫忙，肯出力氣蔣寧（導(dǎo)師-周立群） 嚴(yán)于律己，慎思敏行，表率作用范青峰（導(dǎo)師-丁潔）,中心實(shí)驗(yàn)室評審標(biāo)準(zhǔn),醫(yī)德學(xué)風(fēng)10分（堅(jiān)持真理，尊重科學(xué)） 科研作風(fēng)25分（造假或剽竊者，該項(xiàng)為“0”分） 協(xié)作精神20分（不完成輪值者，該項(xiàng)為“0”分） 勤儉精神15分（超時(shí)使用儀器，浪費(fèi)試驗(yàn)耗材） 勞動紀(jì)律20分（損壞儀器，違反操作規(guī)程，不遵守安全守則，妨礙其他人） 學(xué)術(shù)活動10分（登記了，缺席，一次扣2分）,交流和表達(dá),習(xí)慣表現(xiàn)自己 學(xué)會口頭表達(dá) 表達(dá)欲是思考的開始，迫使自己不斷整理、歸納、總結(jié) No silent English! Try to ask questions in English Improved your written ability by E-mail,表達(dá)三境界 第一境界 “千呼萬喚始出來，猶抱琵琶半遮面”：背對聽眾，按照精心準(zhǔn)備的ppt內(nèi)容，朗讀。 第二境界 “刪繁就簡三秋樹，領(lǐng)異標(biāo)新二月花”：提綱式ppt，講演內(nèi)容完全背下來，面對聽眾侃侃而談，但無眼神交流。 第三境界 “攻書破萬卷，張口如有神” ：完全脫離文稿，用簡明而通俗的語言表達(dá)自己的理解。,如何撰寫論文？,論文類型 綜述 論著 論著摘要和快報(bào) 病例報(bào)告 技術(shù)和方法 專論 講座,雜志種類 權(quán)威雜志 一級期刊 學(xué)報(bào) 專業(yè)雜志 地方性刊物 綜述性刊物 國際期刊,論文評價(jià)SCI,引用情況：SCI (science citation index) 被收錄情況（Medline; PubMed; BA; CA; Embase etc)：影響面擴(kuò)大 論文類型評價(jià)：論著第一；快報(bào)第二；新病種或亞型第三、新方法或改進(jìn)第四 有價(jià)值的病例報(bào)告：新病種、新變異病例、罕見病大家系或新療法首報(bào),如何寫綜述？,文獻(xiàn)準(zhǔn)備 書、綜述、論著、快報(bào)、摘要 5年內(nèi)占2/3；當(dāng)年1-2篇 立論關(guān)鍵要求出自權(quán)威刊物；最新內(nèi)容可出自快報(bào)、文摘和個(gè)人交流；網(wǎng)絡(luò)內(nèi)容須辯真?zhèn)?資料歸類、分組ABC 整理、自己體會,文獻(xiàn)閱讀方法 復(fù)習(xí)綜述 瀏覽摘要 精讀經(jīng)典的和新的論著 吸取部分：結(jié)論明；結(jié)果新；方法略 關(guān)鍵要準(zhǔn)確理解，尋找和立論的有機(jī)聯(lián)系,寫綜述的步驟,前言講義式語言：主題和相關(guān)背景、存在問題、本題在該領(lǐng)域的地位 正文描述性語言：引用文獻(xiàn)確切、排列資料整齊、提示可能機(jī)制、推測將來方向 小結(jié)明確簡練：“已解決有爭議.待解決.關(guān)鍵在于”,撰寫論著步驟,前言：