科學(xué)精神的培養(yǎng)二科研的基本訓(xùn)練.ppt

科學(xué)精神的培養(yǎng) （二）科研的基本訓(xùn)練,研究生的實驗室素養(yǎng),本講內(nèi)容 聲明：部分來自唐朝樞教授二十年之傳授,研究方向的確定 如何學(xué)習(xí)及整理文獻 如何撰寫綜述及研究論文 如何進行科研課題設(shè)計 選題和制定研究計劃 研究對象、方法的選擇 快速適應(yīng)實驗室并開展科研訓(xùn)練 總結(jié)和撰寫論文、基金申請 ,為什么要考研?,或者說，你從事科學(xué)研究的主要動機和最大動力是什么？ 至少，上研究生能得到哪些收獲？,沒有標(biāo)準答案！,高端人才必由之路：碩士、博士、博士后、副高、正高、博導(dǎo)、院士想在專業(yè)上成就 等于升一級職稱，干嘛不 專業(yè)不喜歡，改變自己職業(yè)方向 當(dāng)醫(yī)生到處挨打，怕了，找地方躲躲看 畢業(yè)沒想好干什么。又沒拿什么證，只好考研（隨大溜） 研究生擴招，趕末班車 本科壓根就找不到工作 找到工作，工資太低 躲開就業(yè)高峰 知識改變命運 想出國 就是對科研感興趣 哼！虛偽,總之，要上學(xué)！ 那么，學(xué)什么好呢？,科學(xué)方法遠比科學(xué)發(fā)現(xiàn)重要卡爾薩根 科學(xué)與偽科學(xué)之間最顯著的區(qū)別或許在于，科學(xué)比偽科學(xué)更強烈地認識到人的不完善性和不可靠性 倘使我們只講授科學(xué)的發(fā)現(xiàn)和成果，就算這些發(fā)現(xiàn)和成果十分有用甚至激動人心，而不傳授批判性的科學(xué)方法，怎么能指望普通人將科學(xué)與偽科學(xué)加以區(qū)分？ “培養(yǎng)判斷力”似乎是正確答案,我們上研究生究竟要學(xué)什么？,研究生的實驗室修養(yǎng),基本科研訓(xùn)練 選題和科研設(shè)計 建立實驗程序和做實驗記錄 分析結(jié)果得出結(jié)論 合作、表達交流 撰寫綜述和論著、申請基金,基本科研訓(xùn)練,“六能力”： 文獻處理能力 實驗設(shè)計能力 實驗操作能力 寫作能力 合作交流能力 申請基金能力,1.重塑知識結(jié)構(gòu)： “三三之比” “敲門磚”和“金鑰匙” 臨床醫(yī)師與科學(xué)素養(yǎng) 擇業(yè)有幫助 應(yīng)該持續(xù)終生,2.實驗設(shè)計能力-核心是選題,“三定” 定方向10年 定領(lǐng)域：510年 定課題2年,“四要點” 目的明確 依據(jù)充分 設(shè)計合理 方法恰當(dāng),如何選題和進行科研設(shè)計？,“五性” 先進性(advance) 獨創(chuàng)性(originality) 實用性(practicality) 可行性(feasibility) 影響力(citation),五要素“5 Re”： Real (reliable) Repeatable Record (complete) Relationship (to others) Respect (your patients and animals),設(shè)計的重要性,科研設(shè)計是科研的靈魂 沒有“設(shè)計”就沒有科研 嚴密的設(shè)計是取得有價值結(jié)果的先決條件,內(nèi)容包羅萬象,是研究無主題的反映 本研究要解決的問題？ 逮著什么算什么！ 缺乏嚴格的設(shè)計或無設(shè)計，這類研究即使有重要的發(fā)現(xiàn)也屬偶然,設(shè)計的要素、原則和分類,三要素： 對象 指標(biāo) 結(jié)果,設(shè)計類型： 配對 成組 析因設(shè)計 正交設(shè)計 單因素 多因素 。,四原則： 隨機 對照 重復(fù) 均衡,病例臨床治療總結(jié) 個案報道 量表評定 隨機對照試驗 系統(tǒng)綜述 單因素設(shè)計與多因素設(shè)計 回顧性分析 前瞻性設(shè)計 ,無論哪種： 是否有嚴格界定的的研究對象？ 事先是否有樣本估計？ 是否有適合的測量指標(biāo)？ 是否使用了正確的統(tǒng)計學(xué)方法？ 是否充分隨機化，入組、分組、測定？ 終點事件是否足夠、合理 是否符合倫理學(xué)要求？,設(shè)計的分類和要素（續(xù)）,實驗設(shè)計的核心是選題,選題的核心是什么？ 創(chuàng)新性！ Originality,抗血管生成理論鼻祖Folkman的故事,1953年畢業(yè)于俄亥俄州立大學(xué)，1957年哈佛大學(xué)醫(yī)學(xué)院，波士頓兒童醫(yī)院小兒外科主任 上世紀60年代早期在國家海軍醫(yī)學(xué)中心服役期間，他的有關(guān)理論的雛形已經(jīng)形成 OReilly&Folkman, 1994 in Cell angiostatin血管抑素 OReilly&Folkman, 1995 in Nat Med OReilly&Folkman, 1997 in Cell endostatin內(nèi)皮抑素 極富創(chuàng)新意識，且新意不斷，從不同方面思考問題，在許多領(lǐng)域靈感四逸。如唐氏綜合征患者發(fā)生癌癥的幾率遠遠小于正常人群，這可能與21號染色體的第三個副本有關(guān) 腫瘤新生血管生成理論認為，一旦阻斷腫瘤新生血管生成切斷營養(yǎng)供給，腫瘤將停止生長、萎縮直至死亡。該理論為“抗腫瘤血管生成治療”這一全新的癌癥研究方向奠定了基礎(chǔ)，并據(jù)此理論開發(fā)出了諸如阿瓦斯丁（Avastin, Genentech）等十幾種新藥,Judah Folkman教授,最重要的是原始創(chuàng)新 血管抑素和內(nèi)皮抑素的發(fā)現(xiàn),1983年Folkman的兩位博士后從大鼠腫瘤中分離出一種蛋白：堿性纖維母細胞生長因子（bFGF）,其觀點才得到證實。繼bFGF之后，VEGF等因子相繼被發(fā)現(xiàn)，逐漸確立了血管形成理論 從實驗中偶然發(fā)生污染，F(xiàn)olkman實驗室從酵母菌中分離出夫馬菌素（fumigillin），動物實驗證實其可以使腫瘤縮小。從荷Lewis肺癌小鼠的尿液中尋找新生血管抑制劑又導(dǎo)致了血管抑素和內(nèi)皮抑素等原發(fā)癌分泌的新生血管抑制劑的發(fā)現(xiàn),腫瘤,B組：腫瘤+切斷不摘除,A組：腫瘤+傳統(tǒng)切除,C組：腫瘤+假手術(shù),血管抑素和內(nèi)皮抑素,它們解釋腫瘤自限性生長、遠處轉(zhuǎn)移癌的快速生長隨著原發(fā)瘤的去除，新生血管抑制因子的水平也相應(yīng)降低。循環(huán)中缺少了新生血管抑制因子，轉(zhuǎn)移灶不再受到限制，進而快速生長（原發(fā)瘤抑癌） 正常和荷Lewis肺癌小鼠眼角膜的微小室中持續(xù)釋放bFGF，正常小鼠新毛細血管開始生長而荷Lewis肺癌小鼠的新生血管化被完全抑制：證實原發(fā)瘤可以限制遠端由bFGF誘導(dǎo)的血管形成（手術(shù)的價值以及手術(shù)切除合并抗血管治療的必要性的探討） 摘除原發(fā)灶后，小鼠分別被給予血管抑素和安慰劑，與對照組相比，血管抑素治療組的轉(zhuǎn)移灶無論在數(shù)量上還是體積上均明顯減少。對照組腫瘤新生血管旺盛，而治療組轉(zhuǎn)移灶在鏡下觀察不到新生血管（觀察血管抑素是否能抑制轉(zhuǎn)移灶的生長） 恩度(重組人血管內(nèi)皮抑制素注射液)上市,選題出發(fā)點,從臨床來和回到臨床去 短平快與長深久 找出本人和本單位優(yōu)勢 強強組合 力所能及,研究對象的選取,人優(yōu)于其它 差異和多樣性 群體研究和個體研究 動物模型和細胞模型的目的 動物模型和細胞模型的選擇,設(shè)定指標(biāo)與實驗分組 根據(jù)研究目的設(shè)定指標(biāo)：以少為佳 按照統(tǒng)計學(xué)要求分組 對照組的必要性 對照的選取 根據(jù)對象/對照選擇正確的統(tǒng)計方法,建立實驗程序和做實驗記（1）,實驗程序的建立 目標(biāo)內(nèi)容方法 方法的選擇 A 照搬現(xiàn)成方法 B 重新建立方法 C 改動已有方法 研究生通?。焊腗OP 預(yù)實驗的必要性,方法選擇原則 針對性強 一對一解決問題 可重復(fù)性和準確性 簡為上 不求全,建立實驗程序和做實驗記（2）,實驗技巧 條理化 順序性 one by one 并行 對照性記錄 實驗好習(xí)慣,實驗記錄表格化： 1、原始記錄表 2、單項歸納表 3、匯總表 推薦使用Excel表（例數(shù)1000）和SPSS表,1、原始記錄表（流水賬）,2、單項歸納表（階段小結(jié)/13個月）,3、匯總表（下為論文中的“三線表”）,Age Height Weight BMI BP TGFmRNA TGF蛋白 X均值S X2 P df,分析結(jié)果得出結(jié)論（1）,如何面對結(jié)果？ 與預(yù)計相符的結(jié)果 禁止舍棄部分數(shù)據(jù)使之與設(shè)想相符 直觀結(jié)果與統(tǒng)計結(jié)果 一旦結(jié)果與預(yù)計不符，我們?nèi)绾螌ふ以?？是操作失誤還是？,統(tǒng)計學(xué)與結(jié)果 從設(shè)計一開始就選擇正確的統(tǒng)計方法：如變量的選擇重點和首先要看的變量是否為正態(tài)分布 透過表面看統(tǒng)計：是否真有“差異”，即差異是否有統(tǒng)計學(xué)意義上的顯著性 人：多因素分析 動物和細胞模型：單因素分析,分析結(jié)果得出結(jié)論（2）,數(shù)據(jù)核實與誤差分析 資料核實：是否匹配、分層，分組是否合理 數(shù)據(jù)核實與誤差分析：區(qū)分偶然誤差和系統(tǒng)誤差 方法評估 善于找出新發(fā)現(xiàn)或與文獻矛盾之處 不懷疑并充分重視新發(fā)現(xiàn),補漏： 增加對照組數(shù)目和例數(shù) 例數(shù)不夠統(tǒng)計學(xué)要求 重復(fù)出現(xiàn)系統(tǒng)誤差的實驗 補充對照 反復(fù)核實反對前人論點的主要證據(jù) 設(shè)計新的反證 擴充和深化課題,陰性結(jié)果表明了什么?,真陰性(true negative)，即實驗藥物沒有療效； 假陰性(type II error 或 beta)，即實驗藥物有療效，但檢測不出來，或者說Power不夠大。Power與樣本數(shù)大小有關(guān), 樣本數(shù)增加,則Power增加； 如何知道樣本數(shù)是否足夠? 可計算Power。 只有假陰性的情況，通過增加樣本數(shù)，才會造成療效結(jié)果的差異呈現(xiàn)統(tǒng)計學(xué)顯著性，即呈現(xiàn)本來就存在的陽性結(jié)果。 對于真陰性, 無論樣本多大，差異都不會轉(zhuǎn)變。 設(shè)計良好的臨床實驗，實驗開始前，就應(yīng)計算好具體的樣本數(shù)，以滿足于足夠的Power(至少達到80%)。,陽性結(jié)果又表明了什么?,真陽性，即實驗藥物確實有療效； 假陽性 (type I error或 alpha)。雖然允許假陽性的發(fā)生機率一般預(yù)先設(shè)定為小于0.05，但是，當(dāng)用于表達療效的指標(biāo)為多項(multiple outcomes)或試驗組為多組(multiple comparison groups)時，假如仍按原來設(shè)定作為判斷每一個統(tǒng)計比較是否則有意義時，會出現(xiàn)總假陽性機率增加并超過0.05，或更高。 解決方法之一為縮小域值(如Bonferroni correction) 臨床試驗報告中把增加的假陽性結(jié)果與其它作為陽性結(jié)果一起報道的例子不少見，即使刊登在著名醫(yī)學(xué)學(xué)術(shù)期刊上的不少論文，作者似乎未曾考慮過或文中沒有任何關(guān)于控制假陽性的描述。,結(jié)果無法重現(xiàn)怎么辦？,發(fā)表論文時，詳寫操作，試劑，目的是為保證別人重現(xiàn)結(jié)果。因此，自己的實驗在同一條件下進行。 我們在實驗過程中，確實也發(fā)現(xiàn)某些實驗數(shù)據(jù)較難重復(fù)。原因： 試劑純度不符合要求或使用了不同批次、廠商的試劑； 實驗對象有變：動物品系不純、細胞來源不明 反應(yīng)的操作存在誤差：突出表現(xiàn)在稱量、加樣等環(huán)節(jié)； 為了保證實驗數(shù)據(jù)的可重復(fù)性，我們必須遵循或者建立一套標(biāo)準的反應(yīng)流程(Mannuals of Operation Protocols Standard, MOPS)或SOP(Standard Operation Protocol),研究生通?。焊腗OP,為什么技術(shù)員老師次次都能做出來的實驗我不能？ 按照一套標(biāo)準的實驗方法進行操作，對于新手更為重要 事實上，很多文獻的處理方法是不完善的，也在不斷變化的。所以才會有專門的叢書來總結(jié)。 有些文獻的結(jié)果是很難重復(fù)的 有些操作是完全沒有必要的 有些是錯誤的 也有可能作者故意有所保留。 提高我們的實驗室素養(yǎng)，其中之一就在于判斷文獻的正確與否，而不是盲從。,研究生是怎樣煉成的,首先，天天泡在實驗室，先當(dāng)下手，套近乎， 想一想，為什么要這樣操作，不懂就問 其次，不要在沒有弄清楚原因的情況下，盲目再進行相同的實驗操作。 做一次試驗，就要排除一個可能的因素。 最重要的：留出時間思考！ 不要怕導(dǎo)師說你實驗少，就開一大堆試驗陷于大量的體力勞動。 例1：兒科腎病組-范青峰，導(dǎo)師 丁潔 例2：神經(jīng)內(nèi)科-洪道俊， 導(dǎo)師 袁云,研究生是怎樣煉成的（續(xù)）,不要馬上按照文獻方法去試。應(yīng)反復(fù)調(diào)研文獻： 要得到目標(biāo)，有哪些方法 每種方法的優(yōu)點和缺點是什么，比較后再開始。 文獻的每一個細節(jié)，要問問什么這么做？ 如果不這樣做，后果是什么？用其他方法代替？ 參考其他同類文獻，別人的實驗步驟又是如何？ 他們做了什么改動？為什么要這樣改動？ 培養(yǎng)判斷力，積累經(jīng)驗和知識。 有人一直到博士畢業(yè)了，這些問題都沒有解決,實驗室三寶：筆、本、簽,記號筆。要隨身帶。試管，試劑瓶等用一個編號一個，不要怕麻煩，一目了然，常常絞盡腦汁回想 小本或紙，最好用原始記錄本，作一步寫一步，有了靈感馬上記下來。下班前往記錄本上寫 標(biāo)簽label。有時記號筆寫不了，或是需要保存，最好貼上簽，并在本上記錄好。,大口袋工作服劍橋大學(xué)，UK,細節(jié)決定成敗，性格決定命運,Memo everyday: 該放回冰箱的東西是否放回了？ 冰箱門是否關(guān)嚴了？ 公用的東西是否還原了？ 要清洗的儀器、瓶子是否泡上了？ 試驗臺面是否清理了？ 儀器的電源是否關(guān)掉了？門窗是否關(guān)好了？ 試驗記錄是否及時寫了？ 明天要做什么心里是否有個譜！ 每一次錯誤后都要認真找原因 再沒有找到原因前不要急著進行下一次試驗。,合 作,Always think of others! Its a small world! Be popular! “以人為本” 有團隊就有紀律,物歸原處 幫助別人等于幫助自己 保護他人就是愛護自己，杜絕不良操作 環(huán)保：公共空間+環(huán)境 多發(fā)現(xiàn)別人的長處，不互相埋怨、推諉,不良操作和現(xiàn)象,實驗前：私拿老師準備好的器皿，事后不吱聲；翻別人抽屜和桌面；不按流程操作，或照搬未吃透的方法；不聽勸解 實驗后：不清洗、不歸位、不清理、不交接； 不愛護設(shè)備：未經(jīng)培訓(xùn)考核通過擅自使用，超轉(zhuǎn)速不配平離心，出故障不報告（無論誰弄壞） 沒有安全意識：高溫烤箱里放有機試劑；“明火倒油”；煮沸水浴過夜；普通高壓鍋離人，不鎖門 不做輪值：從來不打蒸餾水，不倒垃圾，臺面不整理,原因一：學(xué)生自身,以個人為中心，不考慮或少考慮他人 缺乏團隊精神：沒有用完的kit、試劑，經(jīng)驗教訓(xùn)，不交接，甚至是同一個導(dǎo)師！ 愛占便宜，依賴性強：表現(xiàn)為順手牽羊 自以為是，不尊重技術(shù)員：表現(xiàn)為常有理 兩面派，編瞎話：表現(xiàn)為欺軟怕硬，眼朝上，但又有眼力，黨同伐異 沒禮貌，缺乏教養(yǎng)：說話不客氣，行為乖張,原因二：導(dǎo)師,不管品質(zhì)如何，分高即??； 重才輕德：只要出文章；小節(jié)不拘； 個人感情至上：愛偏聽偏信； 過于相信學(xué)生能包打天下，或懶于監(jiān)督； 不進實驗室，缺乏對科研的感性認識； 生怕出事，對學(xué)生要求不嚴； 看文獻少，被學(xué)生忽悠！,好人好事,主動熱情，拿實驗室當(dāng)自己的家，遇到不正確操作能開口糾正，關(guān)心同伴例子：劉曉燕（導(dǎo)師-秦炯） 尊重老師，自覺維護公共環(huán)境，眼里有活例子：欒興華（導(dǎo)師-袁云） 謹慎小心，不懂就問，主動幫忙，肯出力氣蔣寧（導(dǎo)師-周立群） 嚴于律己，慎思敏行，表率作用范青峰（導(dǎo)師-丁潔）,中心實驗室評審標(biāo)準,醫(yī)德學(xué)風(fēng)10分（堅持真理，尊重科學(xué)） 科研作風(fēng)25分（造假或剽竊者，該項為“0”分） 協(xié)作精神20分（不完成輪值者，該項為“0”分） 勤儉精神15分（超時使用儀器，浪費試驗耗材） 勞動紀律20分（損壞儀器，違反操作規(guī)程，不遵守安全守則，妨礙其他人） 學(xué)術(shù)活動10分（登記了，缺席，一次扣2分）,交流和表達,習(xí)慣表現(xiàn)自己 學(xué)會口頭表達 表達欲是思考的開始，迫使自己不斷整理、歸納、總結(jié) No silent English! Try to ask questions in English Improved your written ability by E-mail,表達三境界 第一境界 “千呼萬喚始出來，猶抱琵琶半遮面”：背對聽眾，按照精心準備的ppt內(nèi)容，朗讀。 第二境界 “刪繁就簡三秋樹，領(lǐng)異標(biāo)新二月花”：提綱式ppt，講演內(nèi)容完全背下來，面對聽眾侃侃而談，但無眼神交流。 第三境界 “攻書破萬卷，張口如有神” ：完全脫離文稿，用簡明而通俗的語言表達自己的理解。,如何撰寫論文？,論文類型 綜述 論著 論著摘要和快報 病例報告 技術(shù)和方法 專論 講座,雜志種類 權(quán)威雜志 一級期刊 學(xué)報 專業(yè)雜志 地方性刊物 綜述性刊物 國際期刊,論文評價SCI,引用情況：SCI (science citation index) 被收錄情況（Medline; PubMed; BA; CA; Embase etc)：影響面擴大 論文類型評價：論著第一；快報第二；新病種或亞型第三、新方法或改進第四 有價值的病例報告：新病種、新變異病例、罕見病大家系或新療法首報,如何寫綜述？,文獻準備 書、綜述、論著、快報、摘要 5年內(nèi)占2/3；當(dāng)年1-2篇 立論關(guān)鍵要求出自權(quán)威刊物；最新內(nèi)容可出自快報、文摘和個人交流；網(wǎng)絡(luò)內(nèi)容須辯真?zhèn)?資料歸類、分組ABC 整理、自己體會,文獻閱讀方法 復(fù)習(xí)綜述 瀏覽摘要 精讀經(jīng)典的和新的論著 吸取部分：結(jié)論明；結(jié)果新；方法略 關(guān)鍵要準確理解，尋找和立論的有機聯(lián)系,寫綜述的步驟,前言講義式語言：主題和相關(guān)背景、存在問題、本題在該領(lǐng)域的地位 正文描述性語言：引用文獻確切、排列資料整齊、提示可能機制、推測將來方向 小結(jié)明確簡練：“已解決有爭議.待解決.關(guān)鍵在于”,撰寫論著步驟,前言：