GB4789.34-2012食品微生物學(xué)檢驗(yàn)雙歧桿菌的鑒定.pdf

中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) GB 4789.342012 食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 雙歧桿菌的鑒定 中 華 人 民 共 和 國(guó) 衛(wèi) 生 部中 華 人 民 共 和 國(guó) 衛(wèi) 生 部 發(fā)布 2012-05-17 發(fā)布 2012-07-17 實(shí)施 GB 4789.342012 I 前 言 本標(biāo)準(zhǔn)代替 GB/T 4789.34-2008 食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn) 雙歧桿菌檢驗(yàn) 。 本標(biāo)準(zhǔn)與 GB/T 4789.34-2008 相比，主要變化如下： 修改了標(biāo)準(zhǔn)的中文名稱(chēng)； 修改了培養(yǎng)基和試劑； 刪除了果糖-6-磷酸鹽磷酸酮酶（F6PPK）測(cè)定和雙歧桿菌的計(jì)數(shù)方法。 GB 4789.342012 1 食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 雙歧桿菌的鑒定 1 范圍 本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了食品中雙歧桿菌（Bifidobacterium ）的鑒定方法。 本標(biāo)準(zhǔn)適用于食品中雙歧桿菌的鑒定。 2 設(shè)備和材料 除微生物實(shí)驗(yàn)室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設(shè)備外，其他設(shè)備和材料如下： a） 恒溫培養(yǎng)箱：36 1 ； b） 氣相色譜儀配 FID 檢測(cè)器； c） 冰箱：2 5 ； d） 天平： 感量 0.1 g； e） 無(wú)菌試管：18 mm 180 mm、15 mm 100 mm； f） 無(wú)菌吸管：1 mL（具 0.01 mL 刻度）、10 mL（具 0.1 mL 刻度）或微量移液器（200 L1000 L） 及配套吸頭； g） 無(wú)菌錐形瓶：500 mL、250 mL。 3 培養(yǎng)基和試劑 3.1 雙歧桿菌培養(yǎng)基：見(jiàn)附錄 A 中的 A.1。 3.2 PYG 液體培養(yǎng)基：見(jiàn)附錄 A 中的 A.2。 3.3 甲醇：分析純。 3.4 三氯甲烷：分析純。 3.5 硫酸：分析純（體積比）。 3.6 冰乙酸：分析純（體積比）。 3.7 乳酸：分析純。 3.8 乙酸標(biāo)準(zhǔn)溶液：吸取分析純冰乙酸5.7 mL，移入100 mL容量瓶中，加水至刻度，標(biāo)定，標(biāo)定方法見(jiàn)附錄B，此溶液濃度約為1 mol/L。 3.9 乙酸標(biāo)準(zhǔn)使用液：將經(jīng)標(biāo)定的乙酸標(biāo)準(zhǔn)溶液用水稀釋至0.01 mol/L。 3.10 乳酸標(biāo)準(zhǔn)溶液：吸取分析純?nèi)樗?.4 mL，移入100 mL容量瓶中，加水至刻度，標(biāo)定，標(biāo)定方法見(jiàn)附錄B，此溶液濃度約為1 mol/L。 3.11 乳酸標(biāo)準(zhǔn)使用液：將經(jīng)標(biāo)定的乳酸標(biāo)準(zhǔn)溶液用水稀釋至0.01 mol/L。 GB 4789.342012 2 4 鑒定程序 雙歧桿菌鑒定程序見(jiàn)圖 1。 圖1 雙歧桿菌鑒定程序 5 操作步驟 5.1 樣品制備 5.1.1 樣品的全部制備過(guò)程均應(yīng)遵循無(wú)菌操作程序。 5.1.2 以無(wú)菌操作稱(chēng)取 25 g（mL）樣品，置于裝有 225 mL 生理鹽水的滅菌錐形瓶?jī)?nèi)，制成 1:10 的樣品勻液。 5.2 稀釋及涂布培養(yǎng)步驟 厭氧，48 h 36 1 樣品 25 g（mL）+225 mL 滅菌生理鹽水 10 倍系列稀釋 革蘭氏染色，過(guò)氧化氫酶試驗(yàn) 報(bào)告 選擇 2 個(gè)3 個(gè)適當(dāng)稀釋度，各取 0.1 mL 分別加入到雙歧桿菌瓊脂平板進(jìn)行涂布 挑取菌落接種于雙歧桿菌瓊脂平板 接種 PYG 液體培養(yǎng)基 生化反應(yīng) 測(cè)定乙酸、 乳酸 厭氧，48 h 36 1 厭氧，48 h 36 1 GB 4789.342012 3 5.2.1 用 1 mL 無(wú)菌吸管或微量移液器吸取 1:10 樣品勻液 1.0 mL，沿管壁緩慢注于裝有 9 mL 生理鹽水的無(wú)菌試管中（注意吸管尖端不要觸及稀釋液），振搖試管或換用 1 支無(wú)菌吸管反復(fù)吹打使其混合均勻，制成 1:100 的樣品勻液。 5.2.2 另取 1 mL 無(wú)菌吸管或微量移液器吸頭，按 5.2.1 操作順序，做 10 倍遞增樣品勻液，每遞增稀釋一次，即換用 1 次 1 mL 滅菌吸管或吸頭。 5.2.3 根據(jù)待鑒定菌種的活菌數(shù)，選擇三個(gè)連續(xù)的適宜稀釋度，每個(gè)稀釋度吸取 0.1 mL 稀釋液，用 L 棒在雙歧桿菌瓊脂平板進(jìn)行表面涂布, 每個(gè)稀釋度作兩個(gè)平皿。置 36 1 溫箱內(nèi)培養(yǎng) 48 h 2 h，培養(yǎng)后選取單個(gè)菌落進(jìn)行純培養(yǎng)。 5.3 純培養(yǎng) 挑取 3 個(gè)或以上的菌落接種于雙歧桿菌瓊脂平板，厭氧，36 1 培養(yǎng) 48 h。 5.4 鏡檢及生化鑒定 5.4.1 涂片鏡檢 雙歧桿菌菌體為革蘭氏染色陽(yáng)性，不抗酸、無(wú)芽孢，無(wú)動(dòng)力，菌體形態(tài)多樣，呈短桿狀、纖細(xì)桿狀或球形，可形成各種分支或分叉形態(tài)。 5.4.2 生化鑒定 過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)為陰性。選取純培養(yǎng)平板上的三個(gè)單個(gè)菌落，分別進(jìn)行生化反應(yīng)檢測(cè)，不同雙歧桿菌菌種主要生化反應(yīng)見(jiàn)附錄B。 5.5 有機(jī)酸代謝產(chǎn)物測(cè)定 氣相色譜法測(cè)定雙歧桿菌的有機(jī)酸代謝產(chǎn)物, 見(jiàn)附錄 C。 6 報(bào)告 根據(jù)鏡檢及生化鑒定的結(jié)果（5.4）、雙歧桿菌的有機(jī)酸代謝產(chǎn)物乙酸與乳酸微摩爾之比大于 1（5.5），報(bào)告雙歧桿菌屬的種名。GB 4789.342012 4 附錄 A 培養(yǎng)基 A.1 雙歧桿菌瓊脂培養(yǎng)基 A.1.1 成分 蛋白胨 15.0 g 酵母浸膏 2.0 g 葡萄糖 20.0 g 可溶性淀粉 0.5 g 氯化鈉 5.0 g 西紅柿浸出液 400.0 mL 吐溫 80 1.0 mL 肝粉 0.3 g 瓊脂粉 15.0 g20.0 g 加蒸餾水至 1 000.0 mL A.1.2 制法 A.1.2.1 半胱氨酸鹽溶液 稱(chēng)取半胱氨酸 0.5 g，加入 1.0 mL 鹽酸，使半胱氨酸全部溶解，配制成半胱氨酸鹽溶液。 A.1.2.2 西紅柿浸出液 將新鮮的西紅柿洗凈后稱(chēng)重切碎，加等量的蒸餾水在 100 水浴中加熱，攪拌 90 min，然后用紗布過(guò)濾，校正 pH7.0，將浸出液分裝后，121 高壓滅菌 15 min20 min。 A.1.2.3 培養(yǎng)基 將 A.1.1 所有成分加入蒸餾水中，加熱溶解, 然后加入半胱氨酸鹽溶液，校正 pH 6.8 0.2。分裝后121 高壓滅菌 15 min20 min。臨用時(shí)加熱熔化瓊脂，冷至 50 時(shí)使用。 A.2 PYG 液體培養(yǎng)基 A.2.1 成分 蛋白胨 10.0 g 葡萄糖 2.5 g 酵母粉 5.0 g 半胱氨酸-HCl 0.25 g 鹽溶液 20.0 mL 維生素 K1溶液 0.5 mL 氯化血紅素溶液 5mg/mL 2.5 mL 加蒸餾水至 500.0 mL A.2.2 制法 A.2.2.1 鹽溶液 稱(chēng)取無(wú)水氯化鈣 0.2 g，硫酸鎂 0.2 g，磷酸氫二鉀 1.0 g，磷酸二氫鉀 1.0 g，碳酸氫鈉 10.0 g，氯化鈉 2.0 g，加蒸餾水至 1000 mL。 A.2.2.2 氯化血紅素溶液（5mg/mL） 稱(chēng)取氯化血紅素 0.5 g 溶于 1 mol/L 氫氧化鈉 1.0 mL 中，加蒸餾水至 1000 mL，121 高壓滅菌 15 min20 min。 GB 4789.342012 5 A.2.2.3 維生素 K1溶液 稱(chēng)取維生素 K11.0 g，加無(wú)水乙醇 99 mL，過(guò)濾除菌，冷藏保存。 A.2.2.4 培養(yǎng)基 除氯化血紅素溶液和維生素 K1溶液外，A.2.1 其余成分加入蒸餾水中，加熱溶解，校正 pH6.0，加入中性紅溶液。分裝后 121 高壓滅菌 15 min20 min。臨用時(shí)加熱熔化瓊脂，加入氯化血紅素溶液和維生素 K1溶液，冷至 50 使用。 GB 4789.342012 6 附錄 B 雙歧桿菌菌種主要生化反應(yīng) 雙歧桿菌菌種主要生化反應(yīng)見(jiàn)表 B.1。 表 B.1 雙歧桿菌菌種主要生化反應(yīng) 編號(hào) 項(xiàng)目 兩歧雙歧桿菌 (B.bifidum) 嬰兒雙歧桿菌 (B.infantis) 長(zhǎng)雙歧桿菌(B.longum) 青春雙歧桿菌(B.adolescentis) 動(dòng)物雙歧桿菌(B.animalis) 短雙歧桿菌 (B.breve) 1 甘油 2 赤癬醇 3 D-阿拉伯糖 4 L-阿拉伯糖 + + + 5 D-核糖 + + + + 6 D-木糖 + + d + + 7 L-木糖 8 阿東醇 9 -甲基-D-木糖甙 10 D-半乳糖 d + + + d + 11 D-葡萄糖 + + + + + + 12 D-果糖 d + + d d + 13 D-甘露糖 + + 14 L-山梨糖 15 L-鼠李糖 16 衛(wèi)矛醇 17 肌醇 + 18 甘露醇 19 山梨醇 20 -甲基-D-甘露糖甙 21 -甲基-D-葡萄糖甙 + 22 N-乙酰-葡萄糖胺 + 23 苦杏仁甙（扁桃甙） + + 24 熊果甙 25 七葉靈 + + + 26 水楊甙（柳醇） + + + 27 D-纖維二糖 + d 28 D-麥芽糖 + + + + + 29 D-乳糖 + + + + + + 30 D-蜜二糖 + + + + + 31 D-蔗糖 + + + + + 32 D-海藻糖（覃糖） 33 菊糖（菊根粉） 34 D-松三糖 + + 35 D-棉籽糖 + + + + + GB 4789.342012 7 表 B.1（續(xù)） 雙歧桿菌菌種主要生化反應(yīng) 編號(hào) 項(xiàng)目 兩歧雙歧桿菌 (B.bifidum) 嬰兒雙歧桿菌 (B.infantis) 長(zhǎng)雙歧桿菌(B.longum) 青春雙歧桿菌(B.adolescentis) 動(dòng)物雙歧桿菌(B.animalis) 短雙歧桿菌 (B.breve) 36 淀粉 + 37 肝糖（糖原） 38 木糖醇 39 龍膽二糖 + + + + 40 D-松二糖 41 D-來(lái)蘇糖 42 D-塔格糖 43 D-巖 糖 44 L-巖 糖 45 D-阿糖醇 46 L-阿糖醇 47 葡萄糖酸鈉 + 48 2-酮基-葡萄糖酸鈉 49 5-酮基-葡萄糖酸鈉 注：+表示 90以上菌株陽(yáng)性；-表示 90以上菌株陰性；d 表示 1189以上菌株陽(yáng)性。 GB 4789.342012 8 附錄 C 氣相色譜法測(cè)定雙歧桿菌的有機(jī)酸代謝產(chǎn)物 C.1 雙歧桿菌培養(yǎng)液制備 挑取雙歧桿菌瓊脂平板上純培養(yǎng)的雙歧桿菌接種于PYG液體培養(yǎng)基，同時(shí)用未接種菌的PYG液體培養(yǎng)基做空白對(duì)照，厭氧，36 1 培養(yǎng)48 h。 C.2 標(biāo)準(zhǔn)液的配制 C.2.1 乙酸標(biāo)準(zhǔn)溶液 準(zhǔn)確吸取乙酸 5.70 mL 加水稀釋至 100.0 mL，搖勻，進(jìn)行標(biāo)定，配成約 1.0 mol/L 的乙酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。標(biāo)定方法為：準(zhǔn)確稱(chēng)取乙酸 3 g，加水 15 mL，酚酞指示液 2 滴，用 1 mol/mL 氫氧化鈉溶液滴定，并將滴定結(jié)果用空白試驗(yàn)校正。1 mL 1 mol/mL 氫氧化鈉溶液相當(dāng)于 60.05 mg 的乙酸。 C.2.2 乙酸使用液 將經(jīng)標(biāo)定的乙酸標(biāo)準(zhǔn)溶液用水稀釋至 20.0 mmol/L。 C.2.3 乳酸標(biāo)準(zhǔn)溶液 準(zhǔn)確吸取含量為85%90%的乳酸0.84 mL，加水稀釋至100.0 mL，搖勻，配成1.0 mol/L的乳酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。標(biāo)定方法為：準(zhǔn)確稱(chēng)取乳酸1 g，加水50 mL，加入1 mol/mL氫氧化鈉滴定液25 mL，煮沸5 min，加入酚酞指示液2滴， 同時(shí)用0.5 mol/mL用1 mol/mL硫酸滴定液滴定， 并將滴定結(jié)果用空白試驗(yàn)校正。 1 mL 1 mol/mL氫氧化鈉溶液相當(dāng)于90.08 mg的乳酸。 C.2.4 乳酸使用液 將乳酸標(biāo)準(zhǔn)溶液用水稀釋至 20.0 mmol/L。 C.3 方法 C.3.1 乙酸的處理 取雙歧桿菌培養(yǎng)液 2.0 mL3.0 mL 放入 10 mL 離心管中，加入 0.2 mL 50（體積比）硫酸溶液，混勻，加入 2.0 mL 丙酮，混勻后加過(guò)量氯化鈉，劇烈振搖 1 min，再加入 2.0 mL 乙醚，振搖 1 min 后，于 3000 r/min 離心 5 min，將上清液轉(zhuǎn)入另一試管中，下層溶液用 2.0 mL 丙酮和 2.0 mL 乙醚重復(fù)提取 2次，合并有機(jī)相，于 40 水浴中用氮?dú)獯抵辽倭咳芤捍嬖?，用丙酮定容?1.0 mL，混勻后備用。同樣操作步驟處理乙酸標(biāo)準(zhǔn)和空白培養(yǎng)液。 C.3.2 乳酸的處理 取雙歧桿菌培養(yǎng)液 2.0 mL3.0 mL 放入 10 mL 比色管中，100 水浴 10 min，加入 0.2 mL 50%（體積比）硫酸溶液，混勻，加入 1.0 mL 甲醇，于 58 水浴 30 min 后加水 1.0 mL，加三氯甲烷 1.0 mL，振搖 3 min，3000 r/min 離心 5 min，取三氯甲烷層分析。同樣操作步驟處理乳酸標(biāo)準(zhǔn)和空白培養(yǎng)液。 C.3.3 氣相色譜條件 色譜柱：長(zhǎng) 2 m，內(nèi)徑 4 mm 的玻璃柱，填裝涂有 20DNP +7吐溫 60（Tween60）的 chromosorbw HP（80100 目） ；柱溫：110 ；汽化室：150 ；檢測(cè)器：150 ；載氣： （N2）50 ml/min；進(jìn)樣量1.0 l；外標(biāo)法峰面積定量。乳酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的氣相色譜見(jiàn)圖 C.1，乙酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的氣相色譜見(jiàn)圖 C.2。 GB 4789.342012 9 圖C.1 乳酸標(biāo)