hNaDC1基因5’側(cè)翼區(qū)轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列系列載體構(gòu)建與鑒定.doc

hNaDC1基因5側(cè)翼區(qū)轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列系列載體構(gòu)建與鑒定作者：張劍凱，楊聚榮，李雪鵬，何婭妮【摘要】目的構(gòu)建hNaDC1基因5側(cè)翼區(qū)轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列系列螢火蟲(chóng)熒光素酶報(bào)告基因表達(dá)載體。方法PCR擴(kuò)增獲得hNaDC1基因5側(cè)翼轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)不同長(zhǎng)度片段：hNaDC1A（-2232/+136，2368bp）、hNaDC1B（-1640/+136，1776bp）、hNaDC1C（-1084/+136，1221bp）、hNaDC1D（-253/+136，389bp）、hNaDC1E（-2232/-12，2244bp），以pGL3Basic為載體構(gòu)建hNaDC1基因5側(cè)翼序列系列缺失質(zhì)粒。重組體通過(guò)特異限制性?xún)?nèi)切酶酶切鑒定，并送樣測(cè)序鑒定。結(jié)果成功構(gòu)建hNaDC1基因5側(cè)翼區(qū)轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件螢火蟲(chóng)熒光素酶報(bào)告基因表達(dá)載體5個(gè)：pGL3hNaDC1AE。結(jié)論為進(jìn)一步研究NaDC1基因5側(cè)翼區(qū)轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件的分布特點(diǎn)及轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件與轉(zhuǎn)錄因子間的相互作用提供了基本實(shí)驗(yàn)條件?！娟P(guān)鍵詞】hNaDC1基因基因表達(dá)調(diào)控載體構(gòu)建Abstract:ObjectiveToconstructthefireflyluciferasereportgenevectorsfor5flankingregulatedelementsofhNaDC1gene.MethodsTheDNAfragmentshNaDC1AE(-2232/+136)in5flankingregionofhNaDC1genewereamplifiedfromthenephridialtissuebyusingPCR.ThePCRproductsweredirectionallysubclonedintopGL3Basicvector.TherecombinedcloneswereidentifiedbyagarosegelelectrophoresisafterrestrictionendonucleasedigestingandDNAsequencing.Results5expressionvectors(pGL3NaDC1AE)for5flankingregulatedelementsofhNaDC1genehadbeenconstructed.ConclusionTheseexpressionvectorsofferthebasicexperimentalconditionsforstudyingthedistributioncharactersofhNaDC1gene5flankingregulationselementsandthepropertiesofinteractionsbetweentheelementsandregulationproteinswiththehelpofdualluciferasereportgeneassaysystem.Keywords:hNaDC1gene；regulationofgeneexpression；constructionvector人鈉離子依賴(lài)性二羧酸協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1（humanNa+/dicarboxylatecotransporter1，hNaDC1）是負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)運(yùn)三羧酸循環(huán)中間代謝產(chǎn)物琥珀酸、枸櫞酸和酮酸等有機(jī)陰離子的低親和力跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，主要分布于腎臟近端小管和小腸的刷狀緣1。目前認(rèn)為，鈉離子依賴(lài)性二羧酸協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白參與機(jī)體能量代謝、酸堿平衡調(diào)節(jié)以及哺乳類(lèi)動(dòng)物壽限的調(diào)控等重要生命活動(dòng)，可能與腎結(jié)石、代謝性酸中毒和衰老等病理生理過(guò)程密切相關(guān)25。然而迄今為止，hNaDC1基因的表達(dá)調(diào)控機(jī)制尚不清楚。本研究以螢火蟲(chóng)熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒為載體構(gòu)建了hNaDC1基因5側(cè)翼轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列系列缺失質(zhì)粒，為進(jìn)一步研究hNaDC1基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)。1材料與方法1.1細(xì)菌菌株、質(zhì)粒及主要試劑E.coliJM109為第三軍醫(yī)大學(xué)野戰(zhàn)外科研究所創(chuàng)傷燒傷復(fù)合傷國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室留存。螢火蟲(chóng)熒光素酶報(bào)告基因載體pGL3Basic、限制性?xún)?nèi)切酶KpnI和HindIII購(gòu)自Promega公司；Pfu高保真DNA聚合酶及相關(guān)PCR試劑購(gòu)自Stratagene公司；T4DNA連接酶購(gòu)自TaKaRa公司；DNA純化試劑盒、質(zhì)粒抽提試劑盒購(gòu)自O(shè)mega公司。瓊脂糖、瓊脂粉、酵母提取物及胰蛋白胨為Sigma公司產(chǎn)品。1.2PCR引物設(shè)計(jì)與合成根據(jù)轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測(cè)軟件MatInspector5.0和TRANSFAC4.0數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)結(jié)果（結(jié)果已另文發(fā)表），設(shè)計(jì)hNaDC1基因5側(cè)翼調(diào)控區(qū)序列相應(yīng)的上、下游PCR引物，共5對(duì)。引物由上海生工公司合成。所有5端引物均加KpnI酶切位點(diǎn)，所有3端引物均加HindIII酶切位點(diǎn)。引物序列及擴(kuò)增片段大小見(jiàn)表1。表1hNaDC1基因5側(cè)翼不同長(zhǎng)度片段引物序列信息1.3PCR擴(kuò)增按常規(guī)酚抽提方法提取人腎組織基因組DNA，以此作為模板，添加相應(yīng)引物，采用Pfu高保真DNA聚合酶擴(kuò)增相應(yīng)DNA片段，PCR條件為：94變性45s，58退火1min，72延伸5min，30循環(huán)；最后72延伸8min。PCR產(chǎn)物通過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色并照相予以鑒定。1.4pGL3hNaDC1AE表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定pGL3Basic空白載體和PCR產(chǎn)物均用KpnI、HindIII雙酶切，回收pGL3Basic大片段和PCR產(chǎn)物，采用T4DNA連接酶將pGL3Basic片段分別與hNaDC1AE各片段連接，轉(zhuǎn)化DH5感受態(tài)細(xì)菌。堿裂解法提取質(zhì)粒，KpnI、HindIII雙酶切，1%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色并照相予以鑒定重組子。重組子依次命名為pGL3hNaDC1AE。送樣寶生物公司(大連)測(cè)序。2結(jié)果2.1hNaDC1基因5側(cè)翼區(qū)序列的PCR擴(kuò)增采用PCR法從人腎組織中擴(kuò)增不同長(zhǎng)度的hNaDC1基因5側(cè)翼轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)序列hNaDC1AE，瓊脂糖凝膠電泳顯示獲得的PCR產(chǎn)物的大小與設(shè)計(jì)長(zhǎng)度一致（圖1）。2.2重組表達(dá)質(zhì)粒載體的克隆與鑒定應(yīng)用DNA重組技術(shù)，將PCR產(chǎn)物均用KpnI、HindIII雙酶切，將純化的hNaDC1AE片段定向克隆到pGL3Basic表達(dá)載體中，構(gòu)建重組表達(dá)載體pGL3hNaDC1AE。重組質(zhì)粒經(jīng)KpnI、HindIII雙酶切后的瓊脂糖凝膠電泳鑒定圖譜見(jiàn)圖2，可見(jiàn)重組表達(dá)質(zhì)粒載體中外源DNA片段的大小同相應(yīng)PCR產(chǎn)物的大小一致。測(cè)序結(jié)果顯示各插入片段與GenBank公布的序列完全一致。表明已成功構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒載體pGL3hNaDC1AE。3討論低親和力鈉離子依賴(lài)性二羧酸協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（NaDC1）在腎組織近端腎小管刷狀緣的分布已經(jīng)得到證實(shí)6，包括兔、大鼠及人等不同種屬的NaDC1基因相繼被克隆79，其具有參與機(jī)體能量代謝、酸堿平衡調(diào)節(jié)以及哺乳類(lèi)動(dòng)物壽限的調(diào)控等生理功能，與腎M1:DNAmarker15000bpladder；M2:DNAmarker2000bpladder圖1hNaDC1基因5側(cè)翼轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)序列PCR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳鑒定M1:DNAmarker15000bpladder；M2:DNAmarker2000bpladder；A:pGL3NaDC1A；B:pGL3NaDC1B；C:pGL3NaDC1C；D:pGL3NaDC1D；E:pGL3NaDC1E；1:重組子；2:雙酶切產(chǎn)物圖2重組子pGL3hNaDC1AE及其KpnI、HindIII雙酶切鑒定結(jié)石、代謝性酸中毒和衰老等疾病的關(guān)系日漸受到關(guān)注。隨著后基因組時(shí)代即蛋白質(zhì)組時(shí)代的來(lái)臨，對(duì)新基因的功能及病理生理意義的解析成為生命科學(xué)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。因此，研究hNaDC1基因表達(dá)的調(diào)控機(jī)制，將對(duì)進(jìn)一步研究hNaDC1基因的功能及其與疾病的關(guān)系創(chuàng)造條件。本研究前期采用MatInspector5.0對(duì)hNaDC1基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列的預(yù)測(cè)顯示，在hNaDC1基因-2232/+136區(qū)域共有152個(gè)74種轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。根據(jù)預(yù)測(cè)結(jié)果，本研究克隆了具有共同3末端的hNaDC1AD序列，并依次相差一定數(shù)目的堿基，還克隆了具有不同5末端的hNaDC1E序列。各相鄰片段跨度之間的差距之所以如此選擇，主要是為了有效控制整個(gè)操作系統(tǒng)的復(fù)雜性，使之始終處在既能使PCR產(chǎn)物和重組子鑒定操作方便有效，同時(shí)還要考慮今后在應(yīng)用熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)時(shí)能夠提供盡量多的有用信息。本研究將腎組織中克隆出的hNaDC1基因5側(cè)翼轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)不同長(zhǎng)度DNA片段hNaDC1AE，分別插入pGL3Basic載體中，成功構(gòu)建了一系列螢火蟲(chóng)熒光素酶報(bào)告基因表達(dá)載體pGL3hNaDC1AE。為借助于雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)研究hNaDC1基因5側(cè)翼區(qū)轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件的分布特點(diǎn)，以及轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件與轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白之間相互作用的性質(zhì)提供基本實(shí)驗(yàn)條件?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】1PajorAM.Molecularpropertiesofsodium/dicarboxylatecotransportersJ.JMembrBiol,2000,175(1):1-8.2PajorAM.CitratetransportbythekidneyandintestineJ.SeminNephrol,1999,19(2):195-200.3ArugaS,WehrliS,KaisslingB,etal.ChronicmetabolicacidosisincreasesNaDC1mRNAandproteinabundanceinratkidneyJ.KidneyInt,2000,58(1):206-215.4YagisawaT,ChandhokePS,FanJ.MetabolicriskfactorsinpatientswithfirsttimeandrecurrentstoneformationsasdeterminedbycomprehensivemetabolicevaluationJ.Urology,1998,52(5):750-755.5RoginaB,ReenanRA；NilsenSP,etal.ExtendedlifespanconferredbycotransportergenemutationsinDrosophilaJ.Science,2000,290(5499):2137-2140.6何婭妮，陳香美，于志恒，等.人鈉/二羧酸協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1基因的融合表達(dá)及其抗體的制備J.中國(guó)生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào),2002,18(3):356-360.7PajorAM.MolecularcloningandfunctionalexpressionofasodiumdicarboxylatecotransporterfromhumankidneyJ.AmJPhysiol,1996,270(4Pt2):F642-F648.8SekineT,ChaSH,HosoyamadaM,etal.Cloning,func