巢式競爭DNA模板的制備方法.doc

巢式競爭DNA模板的制備方法作者：郭晏海，閆小君，崔大祥，侯瑜，趙錦榮，韓鋒產(chǎn)，段杰【關(guān)鍵詞】DNA關(guān)鍵詞:DNA；模板；方法；聚合酶鏈反應(yīng)0引言我們建立了巢式競爭PCR定量方法進行血清HBVDNA定量擴增1.在該實驗中我們采用了簡便的長引物引導(dǎo)擴增方法制備了特殊的巢式競爭DNA模板.1材料和方法1.1材料我們對HBVDNAC區(qū)1865-2458區(qū)段進行巢式擴增定量，而巢式擴增片段長度為559bp.按文獻HBVDNA序列2，用oligo引物設(shè)計軟件和DNA同源性數(shù)據(jù)庫分析設(shè)計巢式引物.兩外側(cè)引物分別為:b1:（上游1865-1883）5caagcctccaagctgtgcc3，b2（下游2458-2440）5atactaacattgagattcc3；兩內(nèi)側(cè)引物分別為:b3:（上游1877-1893）5ctgtgccttgggtggcttt3，b4:（下游2435-2417）5gagatcttctgcgacgcgg3.我們欲制備的競爭模板為459bp.為了使巢式競爭模板和待測模板一樣含有上述4個引物結(jié)合序列，我們設(shè)計了一個長為57個堿基的競爭模板DNA的制備引物，該引物從5至3分別含有巢式擴增的下游引物b2、b4和與HBVDNAC區(qū)2286-2269區(qū)序列結(jié)合區(qū)序列（斜體部分）3，競爭模板制備引物b5:5ggatactaa-cattgagattcccgagatcttctgcgacgcggagtgcgaatccacact3.1.2方法用該引物與b1引物組成一對PCR擴增引物對HBVDNA進行擴增.PCR反應(yīng)體系內(nèi)b1為10mol，b5為1pmol，擴增條件:首先9460s，然后9430s，5850s，7260s共進行5次循環(huán)，然后改為9430s，6450s，7260s進行30次循環(huán)，最后7230min.于17g・；L-1的瓊脂凝膠電泳，從凝膠中回收擴增產(chǎn)物帶（461bp）并純化回收擴增產(chǎn)物.擴增產(chǎn)物克隆入dTVectorpUC19中.純化重組pUC19質(zhì)粒，然后，測定濃度，稀釋后作競爭模板.2結(jié)果經(jīng)上述PCR擴增后，經(jīng)17g・；L-1瓊脂糖電泳后紫外光下觀察可見461bp的擴增帶；將該擴增產(chǎn)物克隆進pUC19dT載體中，然后轉(zhuǎn)入大腸桿菌，經(jīng)培養(yǎng)后提取并純化重組質(zhì)粒，將其定量作為競爭模板與HBVDNA同時同管擴增，經(jīng)17g・；L-1瓊脂糖電泳后，可將競爭摸板和HBVDNA的擴增產(chǎn)物分開，便于分別進行熒光強度的測定.3討論該方法的優(yōu)點在于可以方便制備任意長度的巢式競爭DNA模板.而且其序列是待測