大白菜黑斑病室內(nèi)苗期抗性鑒定方法的研究.doc

大白菜黑斑病室內(nèi)苗期抗性鑒定方法的研究甘彩霞，?；?，崔磊，袁偉玲，高翔，符義彬，梅時(shí)勇摘要：為了選育大白菜（BrassicacampestrisL.ssppekinensis（Lour.）Olsson）抗黑斑?。ˋlternariabrassicae）新品種和種質(zhì)創(chuàng)新，在室內(nèi)利用6個(gè)品種的大白菜研究了接種物濃度、苗齡和溫度對(duì)大白菜黑斑病發(fā)病的影響，結(jié)果表明，在（251）光照培養(yǎng)室內(nèi)，選擇濃度為1.0104個(gè)孢子/mL或1.0105個(gè)孢子/mL的黑斑病病菌孢子懸浮液噴霧接種于苗齡為34片真葉的大白菜幼苗，保濕2448h，10d后進(jìn)行病情調(diào)查，可對(duì)大白菜種質(zhì)資源抗黑斑病的抗性進(jìn)行正確評(píng)價(jià)。關(guān)鍵詞：大白菜（BrassicacampestrisL.ssppekinensis（Lour.）Olsson）；黑斑病（Alternariabrassicae）；苗期；抗性鑒定StudyonResistanceIdentificationMethodforBlackSpotofChineseCabbageatSeedlingStageinLaboratoryGANCai-xia1，ZHUHua2，CUILei1，YUANWei-ling1，GAOXiang1，F(xiàn)UYi-bin1，MEIShi-yong1（1.InstituteofEconomicCrops，HubeiAcademyofAgriculturalSciences，Wuhan430064，China；2.WuhanVegetableTechnicalServiceStation，Wuhan430012，China）Abstract：InordertoprovidetechnicalsupportforbreedingnewvarietiesandgermplasminnovationofChinesecabbage（BrassicacampestrisL.ssppekinensis（Lour.）Olsson）withresistancetoblackspot（Alternariabrassicae），theinfluenceofinoculationsporeconcentration，seedlingstageandtemperatureonblackspotoccurrencewasstudiedwithsixvarieties.Itwasshowedthatbyspraying1.0104pfu/mLor1.0105pfu/mLsporesuspensiononseedlingat34leafstageandthenmoisturizingfor2448hat（251）indoor，theresistanceofradishvarietiesontheblackspotcouldbeaccuratelyevaluated10dafterinoculation.Keywords：Chinesecabbage（BrassicacampestrisL.ssppekinensis（Lour.）Olsson）；blackspot（Alternariabrassicae）；seedlingstage；resistanceidentification大白菜黑斑病是由鏈格孢屬真菌所致的一種常發(fā)性病害，病原菌包括蕓薹鏈格孢（Alternariabrassicae（Berk.）Sacc.），甘藍(lán)鏈格孢（A.brassicicola）和蘿卜鏈格孢（A.japonica）3個(gè)種，其中秋冬白菜黑斑病一般由蕓薹鏈格孢引起，而春夏白菜黑斑病則主要由甘藍(lán)鏈格孢引起，是一種世界性的重要病害，最早于1836年在甘藍(lán)上發(fā)現(xiàn)，1934年開始有為害大白菜的記錄1。大白菜黑斑病主要通過種子傳代形成異地?cái)U(kuò)散和蔓延，危害葉片和整株植物，全生育過程發(fā)病，嚴(yán)重影響白菜產(chǎn)量和質(zhì)量，成為大白菜生產(chǎn)的主要病害之一，尤其在美國、芬蘭、加拿大、中國臺(tái)灣發(fā)生較重2，3。我國最早在1919年于廣東省的甘藍(lán)上發(fā)現(xiàn)，1937年江蘇報(bào)道其為害大白菜。20世紀(jì)70年代末，黑斑病在我國大白菜等十字花科蔬菜上逐漸嚴(yán)重起來4。大白菜黑斑病主要危害葉片、葉柄及種莢。在真葉上，最初形成圓形退綠斑，病斑擴(kuò)大后轉(zhuǎn)為暗黑色。全株葉片由外向內(nèi)干枯，有明顯較稀的同心輪紋，邊緣有黃色暈環(huán)。潮濕時(shí)病斑有一層黑霉。近年來，隨著春大白菜、早秋大白菜的發(fā)展，黑斑病病害問題日益突出，抗病育種是解決大白菜黑斑病經(jīng)濟(jì)而又有效的途徑，而抗性鑒定則是抗病育種的基礎(chǔ)5。國內(nèi)外對(duì)白菜黑斑病的研究主要集中在黑斑病的發(fā)生和危害、寄主植物的抗性、流行病學(xué)因素、病原物生物學(xué)特性和病原物毒素研究及綜合防治等方面6。對(duì)于白菜黑斑病，北京市植保所李明遠(yuǎn)7進(jìn)行了廣泛深入的研究。1989年樊慕貞等8對(duì)河北省白菜黑斑病發(fā)生規(guī)律及防治進(jìn)行了研究。而對(duì)白菜黑斑病鑒定方法的研究目前還比較少見，急需一種快速、簡便而又精確的抗性鑒定方法，對(duì)我國大白菜種質(zhì)資源進(jìn)行篩選，以期建立簡單、快速的品種選育流程。1材料與方法1.1試驗(yàn)材料供試黑斑病菌種（BHB）采自湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜科技中心試驗(yàn)基地。菌種接種前用PDA碳源減半（馬鈴薯200g，葡萄糖/蔗糖5g，瓊脂15g，pH7.0，去離子水1000mL）固體培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。供試大白菜品種為湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜科技中心提供，分別為品種1、品種2、品種3、品種4、品種5、品種6六種類型大白菜品種。將供試的種子播種在裝有滅菌基質(zhì)的花盆（8cm8cm）內(nèi)，出苗后每盆留13株。1.2試驗(yàn)方法1.2.1環(huán)境的選擇在抗病育種過程中，大田期對(duì)黑斑病進(jìn)行抗性鑒定往往由于氣候條件不適宜發(fā)病而無法進(jìn)行，而苗期在室內(nèi)進(jìn)行鑒定則溫濕度條件較易控制，鑒定周期短、速度快，能節(jié)省大量人力物力。為此，進(jìn)行了室內(nèi)苗期鑒定蘿卜黑斑病抗性的研究，以找出更適于苗期抗病性鑒定的方法，確定苗期黑斑病適宜的誘導(dǎo)發(fā)病條件，并用篩選出的最適方法對(duì)大白菜種質(zhì)資源進(jìn)行苗期抗病性鑒定和分級(jí)，獲得抗黑斑病材料。1.2.2影響因素的選擇為選擇一個(gè)好的抗性鑒定方法，根據(jù)各國學(xué)者在這方面進(jìn)行了系統(tǒng)研究，即選擇從接種物濃度、苗齡、環(huán)境溫度等各方面探討影響大白菜黑斑病抗性鑒定的因素9。1.2.3接種方法的選擇接種方法包括拌種法、浸種法、土壤接種法、蘸根接種法、根部切傷接種法、噴霧法和針刺法10。在確定以接種物濃度、苗齡和溫度這3個(gè)因素為變量的情況下，選擇噴霧法對(duì)大白菜苗進(jìn)行接種。1.3接種將BHB菌株單孢分離同一時(shí)期的菌體都配制成孢子濃度為1.0103、1.0104、1.0105、1.0106個(gè)孢子/mL的懸浮液。當(dāng)大白菜苗長至34片真葉期時(shí)，將每個(gè)品種的1/3再均分成12份，平均分配到（181）、（231）、（281）3個(gè)溫度條件下的光照培養(yǎng)室中適應(yīng)2d，這2d里，將培養(yǎng)室的溫度每天上調(diào)1，之后保持不變11，12。將等體積的4個(gè)不同濃度的菌懸液以噴霧法分別接種于同一品種4份大白菜苗上，蓋上保鮮膜保濕2448h后揭掉保鮮膜，誘導(dǎo)發(fā)病，接種后于每天早中晚各澆水1次，于接種后第4、7、10、14和18天進(jìn)行病情調(diào)查6。當(dāng)剩余的大白菜苗長至56片真葉期時(shí)，再將每個(gè)品種的1/2搬回培養(yǎng)室進(jìn)行同樣的接種處理。待最后剩余的一批大白菜苗長至78片真葉期時(shí)，也對(duì)其進(jìn)行同樣的接種處理。試驗(yàn)因素以及水平見表1。1.4病情指數(shù)分級(jí)真葉期接種鑒定調(diào)查分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)13：0級(jí)，無??；1級(jí)，接種葉生褐色小點(diǎn)，無退綠斑；3級(jí)，接種葉生直徑3mm以下的退綠斑，無霉層；5級(jí)，接種葉生直徑3mm以上的退綠斑，有極少霉層，病斑不連成片；7級(jí)，接種葉生直徑3mm以上的退綠斑，有較多的霉層，病斑連成片；9級(jí)，接種葉病斑連成片，大面積枯死，霉層明顯。1.5抗病性劃分病情分級(jí)調(diào)查后，計(jì)算病情指數(shù)：病情指數(shù)=（病級(jí)數(shù)該病級(jí)發(fā)病株數(shù)）/（最高發(fā)病級(jí)數(shù)總調(diào)查株數(shù)）10010。根據(jù)發(fā)病程度進(jìn)行分級(jí)13。免疫（I），病情指數(shù)=0；高抗（HR），病情指數(shù)=0.1011.11；抗?。≧），病情指數(shù)=11.1233.33；中抗（MR），病情指數(shù)=33.3455.55；感病（S），病情指數(shù)=55.5677.77；高感（HS），病情指數(shù)=77.78100。1.6數(shù)據(jù)處理所有數(shù)據(jù)均采用SPSS11.5軟件（LSD，P<；0.05）處理，采用MicrosoftOfficeExcel2003進(jìn)行制圖。2結(jié)果與分析2.1接種天數(shù)對(duì)抗性表現(xiàn)的影響由于在接種后第4天和第7天時(shí)大白菜苗的感病情況不太明顯，而接種后第14天和第18天，多數(shù)大白菜苗因生理原因?qū)е抡昕菟?，無法判斷其發(fā)病情況，因而在這4個(gè)時(shí)期進(jìn)行病情調(diào)查時(shí)所得到的數(shù)據(jù)有殘缺或不準(zhǔn)確，不能代表各個(gè)品種的大白菜苗的感病情況；而在接種后第10天時(shí)，這兩方面的問題相對(duì)而言比較小，調(diào)查所得的數(shù)據(jù)比較全面，這也與嚴(yán)紅等14的研究相符。因此，最終選擇用接種后第10天調(diào)查所得的數(shù)據(jù)進(jìn)行制圖分析。2.2接種濃度對(duì)抗病性表現(xiàn)的影響從圖1可看出，隨著接種物濃度的增加，其發(fā)病程度也相應(yīng)加強(qiáng)。當(dāng)接種物濃度為1.0103個(gè)孢子/mL時(shí)，由于其中某些品種的抗性比較強(qiáng)，發(fā)病程度比較輕，而某些品種的抗性較弱，發(fā)病較重，不能進(jìn)行正確的抗性評(píng)價(jià)；而當(dāng)接種物濃度為1.0106個(gè)孢子/mL時(shí)，6個(gè)品種都嚴(yán)重發(fā)病，且基本無差異，也不能進(jìn)行正確的抗性評(píng)價(jià)；當(dāng)接種物濃度為1.0104個(gè)孢子/mL或1.0105個(gè)孢子/mL時(shí)，植株發(fā)病比較重且有差異，參考柯桂蘭等9的研究結(jié)果，可作為評(píng)價(jià)的濃度。2.3接種苗齡對(duì)抗病性表現(xiàn)的影響從圖2可以看出，隨著苗齡的增大，植株發(fā)病程度有所下降，整體的抗病性在增強(qiáng)。當(dāng)苗齡為56片真葉或78片真葉時(shí)，植株發(fā)病程度普遍較低且差異不大，不能進(jìn)行正確的評(píng)價(jià)；當(dāng)苗齡為34片真葉時(shí)，抗病性強(qiáng)的品種與抗病性弱的品種間的差異非常明顯，可作為抗病性鑒定評(píng)價(jià)的苗齡。2.4接種溫度對(duì)抗病性表現(xiàn)的影響由圖3可以看出，溫度與植株發(fā)病程度呈正相關(guān)。當(dāng)環(huán)境溫度為（201）時(shí)，多數(shù)品種的發(fā)病程度都比較低，不能進(jìn)行正確的評(píng)價(jià)；當(dāng)環(huán)境溫度為（301）時(shí)，6個(gè)品種發(fā)病程度都比較嚴(yán)重，且品種間的抗性差異與濃度和苗齡不一致，也不能進(jìn)行正確的抗性評(píng)價(jià)；當(dāng)環(huán)境溫度為（251）時(shí)，品種間的發(fā)病程度比較明顯且與濃度和苗齡的一致，參考柯桂蘭等9的研究結(jié)果，可作為抗性評(píng)價(jià)的溫度。3結(jié)論本研究結(jié)果表明，在（251）光照培養(yǎng)室內(nèi)，選擇濃度為1.01041.0105個(gè)孢子/mL的黑斑病病菌孢子懸浮液噴霧接種于苗齡為34片真葉的大白菜幼苗，保濕2448h，10d后進(jìn)行病情調(diào)查，可對(duì)大白菜種質(zhì)資源抗黑斑病的級(jí)別進(jìn)行正確評(píng)價(jià)。參考文獻(xiàn)：1劉紀(jì)書.河北省蔬萊學(xué)會(huì)論文集A.1988.174.2何啟偉，吳春燕，宋廷宇.大白菜良種繁殖技術(shù)J.長江蔬菜，2007（6）：31-33.3張百俊，張國英，楊東平，等.大白菜主要病害無公害防治技術(shù)J.長江蔬菜，2009（15）：18-19.4李明遠(yuǎn).十字花科蔬菜黑斑病識(shí)別與防治J.當(dāng)代蔬菜，2004（10）：34-35.5張鳳蘭，徐家炳，嚴(yán)紅，等.大白菜苗期對(duì)黑斑病抗性遺傳規(guī)律的研究J.華北農(nóng)學(xué)報(bào)，1997，12（3）：115-119.6劉影，馬海霞，楊信東.白菜黑斑病空間分布型研究及殺菌劑篩選J.北方園藝，2008（10）：171-174.7李明遠(yuǎn).大白菜黑斑病的發(fā)生與防治J.中國蔬菜，2006（7）：49-50.8樊慕貞，崔麗珍.白菜黑斑病的發(fā)生和化學(xué)防治研究J.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1987，10（1）：53-61.9柯桂蘭，劉煥然，趙稚雅.大白菜黑斑病病原種群組成及人工接種抗性鑒定J.西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，1998（3）：92.10方中達(dá).植病研究方法M.第三版.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，1998.11楊曉紅，劉天文.大白菜抗軟腐病接種鑒定及抗源篩選研究J.山東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009（5）：67-69.1