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使用RNAscope 技術(shù)探索 HBV DNA， cccDNA以及mRNA 在肝組織中的分布簡介HBV的感染侵入病人體內(nèi)細(xì)胞后，其內(nèi)含的HBV-DNA脫離包裹的蛋白質(zhì)被釋放形成rcDNA，依賴宿主的DNA聚合酶補(bǔ)齊形成更加穩(wěn)定的cccDNA，并以cccDNA作為模板轉(zhuǎn)錄出不同大小的mRNA，作為各種抗原蛋白以及HBV-DNA的逆轉(zhuǎn)錄模板。基于各類核酸不同但同樣重要的作用，本項目旨在用一種新型的RNA ISH技術(shù)RNAscope來標(biāo)定HBV-DNA，cccDNA，mRNA，探索各類核酸在乙肝病人組織中的差異分布，并比較在乙肝病人四個發(fā)展階段（immunotolerant, immune active, inactive carrier, and HBeAg-negative hepatitis）的不同變化，以及INF治療效果不同病人之間的差異變化。本項目有助于我們進(jìn)一步了解HBV傳播的機(jī)制，為HBV的治療提供指導(dǎo)。背景HBV cccDNA的形成HBV 侵入人的肝細(xì)胞 ,在細(xì)胞質(zhì)中脫去核殼 ,形成 rcDNA。rcDNA 進(jìn)入肝細(xì)胞核中解脫正鏈 3端連接的末端蛋白、負(fù)鏈 5端的 RNA 殘段 （圖一） ;依賴宿主細(xì)胞的 DNA 聚合酶補(bǔ)齊兩條鏈上的缺口 ,并進(jìn)一步折疊、扭曲形成超螺旋結(jié)構(gòu)的 cccDNA ,并以 cccDNA 為模板轉(zhuǎn)錄為不同大小的 mRNA ( 3.5Kb、 2.4Kb、2.1Kb、0.8Kb mRNA) ,從而翻譯各種病毒蛋白。其中 3,5 Kb 的 pgRNA 作為逆轉(zhuǎn)錄模板 ,利用病毒的逆轉(zhuǎn)錄酶合成全長的基因組負(fù)鏈 DNA ,再以負(fù)鏈 DNA 作為模板 ,通過病毒 DNA 聚合酶的作用 ,合成正鏈 DNA , 與負(fù)鏈 DNA 一起組成新的HBV rcDNA。新合成的 HBV rcDNA 一方面進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi) ,轉(zhuǎn)化為新的 cccDNA ,補(bǔ)充細(xì)胞內(nèi)的 cccD2 NA 庫 ,使每個肝細(xì)胞中保持大約 550 個 cccDNA分子 ;另一方面與病毒蛋白裝配成新的完整 HBV ,釋放至細(xì)胞外 ,再感染健康的肝細(xì)胞 (見圖 1) 1。In HBV genome, the incomplete plus strand has a variable 3-end but a defined 5-end around position 1600 near DR2, while the complete minus strand has defined 5- and 3-ends with a terminal redundancy of 9 bases 27. There is a gap around position 1800 near DR1 (Fig. 1).圖一HBV基因組結(jié)構(gòu)。HBV基因組有部分單鏈，部分雙鏈，以及部分的三DNA鏈在病毒粒子中。各HBV正義鏈的長度會有很大的不同，但是負(fù)義鏈有固定的5 -和3 -端靠近1800左右的位置。圓圈，引物酶；鉆石圈，DNA聚合酶。2. 傳統(tǒng)HBV cccDNA 的常用檢測方法根據(jù)cccDNA與rcDNA在結(jié)構(gòu)和理化特性上的不同 ,可以建立檢測 cccDNA 的方法 : (1) rcDNA能與蛋白質(zhì)共價結(jié)合 ,cccDNA 則不能。(2) rcDNA的雙鏈?zhǔn)遣粚ΨQ的 ,全長的一鏈與病毒 mRNA 互補(bǔ) ,為負(fù)鏈 ,較短的一鏈為正鏈。在正鏈和負(fù)鏈上均存在缺口 ,兩鏈 DNA 通過 5端 250300 個互補(bǔ)堿基的氫鍵作用形成部分環(huán)狀結(jié)構(gòu) ,而非超螺旋結(jié)構(gòu) ; cccDNA 的兩條鏈均是完整的 , 形成超螺旋結(jié)構(gòu)。(3) 由于正鏈和負(fù)鏈上均有缺口存在 ,rcDNA 可以被一些能夠切除單鏈或含有缺口 DNA 的核酸酶如Plasmid2Safe TM A TP2dependent DNase、綠豆核酸酶(mung bean nuclease) 等降解成寡核苷酸或單核苷酸 ,而 cccDNA 則由于雙鏈結(jié)構(gòu)完整 ,不會被上述酶降解2,3。(一) Southern blotHBV cccDNA 以往多用 Southern blot 方法進(jìn)行檢測 ,該方法是分子生物學(xué)的經(jīng)典方法 ,但對操作者的技術(shù)要求較高 ,且步驟繁瑣 ,靈敏度較低4。圖二 Primer selection. PCR was performed to select primer pairs which can specically amplify DNA fragment from HBV cccDNA but not genomic DNA in the PCR. The 106 copies of cccDNA from a plasmid containing HBV genome were used as template in lane 1, 2, 3, 7, 8, 9, 13, 14, and 15; while 1.6106 copies of virus DNA isolated from HepAD38 condition medium were used as template in lane 4, 5, 6, 10, 11, 12, 16,17, and 18. Primer pairs: 1, 4, HBV_CCC_F1/HBV_CCC_R1; 2, 5, HBV_CCC_F1/HBV_CCC_R2; 3, 6, HBV_CCC_F1/HBV_CCC_R3; 7, 10, HBV CCC F2/HBV_CCC_R1; 8, 11, HBV CCC F2=HBV_CCC_R2; 9, 12, HBV CCC F2=HBV CCC R3; 13, 16, HBV CCC F3=HBV CCC R1; 14, 17, HBV CCC F3= HBV CCC R2; 15, 18, HBV CCC F3=HBV CCC R3.HBV_CCC_F1: 5-ACTCTTGGACTCBCAGCAATG-3; HBV_CCC_F2: 5-TGTTCACCAGCACCATGC-3; HBV_CCC_F3: 5-GCGGWCTCCCCGTCTGTGCC-3; HBV_CCC_R1: 5-CTTTATACGGGTCAATGTCCA-3; HBV_CCC_R2: 5-ACAGCTTGGAGGCTTGAACAG-3; HBV_CCC_R3: 5-GTCCATGCCCCAAAGCCACC-3.(二) 普通 PCR基于 rcDNA 的正鏈和負(fù)鏈上均存在缺口 ,故可以設(shè)計跨越兩個缺口的引物 ,使 rcDNA 不被擴(kuò)增 , cccDNA 由于有完整的雙鏈可以被有選擇地擴(kuò)增2,3。(三) Real-Time quantitative PCRHe等3建立了實時熒光定量檢測cccDNA的方法。他們將具有發(fā)光基團(tuán)和淬滅集團(tuán)的 TaqMan探針設(shè)計于負(fù)鏈缺口的下游 ,與負(fù)鏈互補(bǔ)。在上游引物的引導(dǎo)下 ,若負(fù)鏈?zhǔn)峭暾?, Taq 酶則到達(dá) Taq2 Man 探針?biāo)Y(jié)合的位點(diǎn) ,利用其 53的外切酶活性將探針切斷 ,從而 3端的淬滅集團(tuán)失去對 5端發(fā)光集團(tuán)的抑制作用 ,產(chǎn)生熒光信號。若負(fù)鏈含有缺口 ,由于上游引物引發(fā)的鏈延伸不能通過負(fù)鏈缺口 ,故不能產(chǎn)生熒光信號。這樣 ,cccDNA 和 rcDNA 得以區(qū)分開來。此方法變普通 PCR 法的終點(diǎn)監(jiān)測為實時動態(tài)檢測 ,不需對 PCR 反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行開蓋檢測 ,從而減少了 PCR 產(chǎn)物污染的可能 (見圖 3) 。圖 三 RT-qRCR檢測cccDNA（四）入侵檢查（Invader Assay）入侵檢查是近年來剛開始應(yīng)用的技術(shù)。其基本原理是目標(biāo)DNA設(shè)計一對探針 ,一個探針稱為初始探針 (primary probe) ,另一個稱為入侵探針(invader probe) ,初始探針的 5端一段寡核苷酸序列不與目標(biāo) DNA 互補(bǔ) ,入侵探針 3末端的單個堿基不與目標(biāo)DNA互補(bǔ)，F(xiàn)lap核酸內(nèi)切酶I（Flap endonuclease I）將初始探針5端不與目標(biāo)DNA互補(bǔ)的寡核苷酸序列剪切下來，之后此段寡核苷酸序列與具有發(fā)光基團(tuán)和淬滅集團(tuán)的 FRET ( Fluorescence Resonance Energy Transfer) 探針相結(jié)合 ,從而產(chǎn)生熒光信號 , 能夠被實時熒光 PCR 儀器檢測 5。 D KH W 等6根據(jù)此原理 ,分別設(shè)計了與 HBV DR2區(qū)正鏈下游、負(fù)鏈上游相結(jié)合的兩種入侵探針 ,這樣當(dāng)正鏈、負(fù)鏈均為完整時產(chǎn)生兩種熒光信號 ,從而檢測 cccDNA ;rcDNA 由于正鏈含有缺口 ,只能產(chǎn)生一種熒光信號 ,得以和 cccDNA 相區(qū)分 (見圖 4 ,5) 。整合型 HBV DNA 在 DR2 區(qū)的 5端也是一段完整的序列 ,但整合多發(fā)生在 112bp 的 DR 區(qū)6,7 , Wong D K等6據(jù)此認(rèn)為用入侵檢查技術(shù)測到整合型 HBVDNA 的幾率應(yīng)該很低。圖四 入侵檢測技術(shù)原理示意圖圖五入侵檢查檢測cccDNA（五）最新型的RNAscope 技術(shù)RNAscope專利技術(shù)是近年來最火的RNA原位雜交技術(shù)，是RNA原位雜交（ISH）領(lǐng)域的一項重大進(jìn)步。由Advanced Cell Diagnostics公司（Newark, CA）開發(fā)，通過專利的雙“Z”探針設(shè)計和信號放大系統(tǒng)，使RNA原位雜交具有高度特異性、單分子檢測的敏感性并有極高的信噪比，能夠在單細(xì)胞水平同時定量多個RNA的表達(dá)，在獲得單細(xì)胞中單拷貝RNA表達(dá)數(shù)據(jù)的同時提供完整的組織形態(tài)學(xué)信息。袁正洪教授8團(tuán)隊利用RNA Scope技術(shù)根據(jù)HBV各核酸的特點(diǎn)設(shè)計了3組探針可以分別識別HBV的totalDNA，cccDNA，mRNA （圖六） ，但是效果還有待評估，特別是免疫染色印跡法標(biāo)記 HBV HBsAg抗原和HBV RNA 重合度很差，并不符合RNA與蛋白之間的表達(dá)關(guān)系。圖六探針組1 與HBV 正義鏈（nt1930-2900）互補(bǔ)，可以和HBV DNA的正鏈以及pgRNA雜交探針組2 與HBV 負(fù)義鏈（nt2957-837）互補(bǔ)，只和HBV DNA結(jié)合探針組3 對應(yīng)HBV 正鏈的缺失段（nt1090-1690），與HBV-DNA負(fù)鏈互補(bǔ)，使用RNAse去除mRNA后可以專門用于檢測cccDNA。圖七 免疫染色印跡法標(biāo)記 HBV HBsAg抗原和HBV RNA 重合度很差實驗?zāi)康哪康囊唬肦NAScope技術(shù)設(shè)計兩套與袁正洪教授組不同的HBV1b 和HBV2a 的DNA，cccDNA，mRNA探針，并與袁正洪教授組的結(jié)果相比較目的二 探索各核酸在乙肝病人肝組織內(nèi)各個不同時期的分布目的三 對比IFN治療反應(yīng)不同病人之間各核酸表達(dá)與分布的不同Reference1. Seeger C, Mason WS (2000) Hepatitis B Virus Biology. Microbiology & Molecular Biology Reviews 64: 51.2. Addison WR, Walters KA, Wong WW, Wilson JS, Madej D, et al. (2002) Half-Life of the Duck Hepatitis B Virus Covalently Closed Circular DNA Pool In Vivo following Inhibition of Viral Replication. Journal of Virology 76: 6356-6363.3. He ML, Wu J, Chen Y, Lin MC, Lau GK, et al. (2002) A new and sensitive method for the quantification of HBV cccDNA by real-time PCR. Biochemical & Biophysical Research Communications 295: 1102.4. Li XM, Yang YB, Hou HY, Shi ZJ, Shen HM, et al. (2003) Interruption of HBV intrauterine transmission: a clinical study. World journal of gastroenterology 9: 1501.5. Kwiatkowski RW, Lyamichev V, De AM, Neri B (1999) Clinical, genetic, and pharmacogenetic applications of the Invader assay. Molecular Diagnosis 4: 353-364.6. Wong DK, Yuen MF, Yuan H, Sum SS, Hui CK, et al. (2004) Quantitation of covalently closed circular hepatitis B virus DNA in chronic hepatitis B patients. Hepatology 40: 727.7. Mason AL, Xu L, Guo L, Kuhns M, Perrillo RP (1998) Molecular basis for persistent hepatitis B virus