（遺傳學(xué)專業(yè)論文）小鼠卵子突變基因修飾基因的qtls定位.pdf

河南農(nóng)業(yè)大學(xué)2 0 1 0 屆碩上研究生學(xué)位論文 摘要 自2 0 世紀(jì)初，小鼠的遺傳學(xué)研究從寵物農(nóng)場進(jìn)入哈佛大學(xué)的實(shí)驗(yàn)室只有短短一百年的歷 史；但是，由于小鼠基因組與人類基因組高度同源、小鼠基因組改造手段非常成熟以及小鼠 近交系、突變系和工具小鼠品系種類繁多，小鼠遺傳學(xué)已成為發(fā)育生物學(xué)、功能基因組學(xué)和 疾病機(jī)理研究的核心研究領(lǐng)域，小鼠也成為最重要的模式生物之一。 d d k 近交系小鼠，是日本學(xué)者從一種屬于m m d o m e s t i c u s 亞種起源的德國小鼠培育而 成，其表現(xiàn)出一種被稱為“d d k 綜合癥”( d d ks y n d r o m e ) f f j 奇特繁殖現(xiàn)象：如同品系內(nèi)交配 一樣，d d k 雄鼠能夠使其它近交系雌鼠正常受孕。但是，當(dāng)d d k 雌鼠與同亞種內(nèi)其它近 交系雄鼠交配時(shí)，f l 受精卵在妊娠3 5 日因胚泡形成障礙而死亡，使得d d k 雌鼠幾乎不孕。 后經(jīng)研究證明這種極性不育的特性是由d d k 卵子細(xì)胞質(zhì)物質(zhì)和其它品系精子因子之間存在 不親和性引起的，它們二者均受到位于小鼠第l i 條染色體上的卵子突變( o v u mm u t a n t 或o m ) 位點(diǎn)的一對等位基岡所控制。 近年來，趙衛(wèi)東等發(fā)現(xiàn)b 6 遺傳背景中存在著卵子突變基因的修飾基因，這些修飾基因使 o m 位點(diǎn)雜合型的雌鼠胚胎死亡率隨著其b 6 背景基因頻率的增加而升高。同時(shí)，也有學(xué)者采 用不同的方法和手段先后發(fā)現(xiàn)和報(bào)道了o m 修飾基岡的存在，但在修飾基因的數(shù)目多少和表 達(dá)方式上，存在著不同的認(rèn)識。 本實(shí)驗(yàn)旨在探明b 6 小鼠品系中存在的o m 基岡修飾基因的數(shù)目及其在染色體上的位置， 從而為研究修飾基因的作用機(jī)理打下基礎(chǔ)。在趙衛(wèi)東前期收集1 6 4 個(gè)樣本的基礎(chǔ)上，通過三 年來的努力，順利獲得1 2 5 個(gè)樣本的表型數(shù)據(jù)，并完成其中8 6 個(gè)樣本的全基因組掃描工作。 運(yùn)用w i n q t l c a r t 軟件對8 6 個(gè)樣本數(shù)據(jù)進(jìn)行復(fù)合區(qū)間作圖分析，發(fā)現(xiàn)在第4 條染色體上可能 存在胚胎著床數(shù)的q t l ，其l o d 值為3 0 ：另外，在第l 、9 、1 4 和1 7 條染色體上也可能 存在q t l s ，它們的l o d 值均達(dá)到1 5 以上，此結(jié)果與趙衛(wèi)東的定位結(jié)果基本吻合。 本實(shí)驗(yàn)還揭示了小鼠胚泡形成過程中多基因調(diào)控的事實(shí)，初步了解和認(rèn)識到卵子突變基 因的影響作用及作用規(guī)律，為以后開展卵子突變基因的修飾基因( o m m f ) 的功能表達(dá)研究 提供了必要的準(zhǔn)各。 關(guān)鍵詞：小鼠卵子突變基因d d k 綜合癥修飾基因q t l s 河南農(nóng)業(yè)人學(xué)2 0 1 0 屆碩士研究生學(xué)位論文 l o c a t i n g o fo v u mm u t a n tm o d i f l e rg e n e ( o m m f ) b yq t l si nm i c e s u p e r v i s o r ：p r o f z h a ow e i d o n g m a s t e rc a n d i d a t e ：h u ax i n x i n a b s t r a c tt h eh i s t o r yo fm o u s e g e n e t i c ss t a r t e dw h e nm i c es t r a i n sw e r e i m p o r t e df r o mp e tf a r mt oc a s t l e sl a b o r a t o r yi nh a r v a r du n i v e r s i t ya b o u to n e h u n d r e dy e a r sa g o m o u s eg e n o m ei sh i g h l yh o m o l o g o u st oh u m a na n dc a l lb e m o d i f i e db yv a r i o u sa p p r o a c h e s m o r e o v e r ，t h o u s a n d so fi n b r e ds t r a i n s ，m u t a n ts t r a i n s a n di m p l e m e n t a ls t r a i n sh a v eb e e nd e v e l o p e d t h e r e f o r e ，m o u s eh a sb e c o m et h ek e y m o d e la n i m a lf o rt h er e s e a r c ho fd e v e l o p m e n tb i o l o g y ，f u n c t i o n a lg e n o m i c sa n d d i s e a s em e c h a n i s m t h ei n b r e ds t r a i no fd d km i c ew e r eb r e e d e db yj a p a n e s ef r o mak i n do fg e r m a n i c m i c ew h i c ha t t r i b u t et h em 歷d o m e s t i c u ss u b s p e c i f i c a n di ts h o w sa u n i q u ep r o p e r t y k n o w na s “d d ks y n d r o m e ：t h ed d km a l e sc a l ln o r m a l l yf e r t i l i z et h ef e m a l e so f o t h e rs t r a i n sl i k ei nt h es a m es t r a i n ，w h i l et h ef e m a l e so fd d ks t r a i na r en e a r l y i n f e r t i l ew h e nc r o s s e dt om a l e so fo t h e rs t r a i n s ，o w i n gt ot h ef ie m b r y o sf a i l u r eo f b l a s t o c y s tf o r m a t i o nb e t w e e n3 - 5d a y sa f t e rp r e g n a n c y s t u d i e ss u p p o r t e dt h a tt h e p o l a ri n f e r t i l ec h a r a c t e r i s t i ci sc a u s e db ya l li n c o m p a t i b i l i t yb e t w e e nt h ec y t o p l a m i c m a t e r i a l si nd d k o o c y t ea n ds p e r mf a c t o r si no t h e rs t r a i n s ，t h e yw e r ea l lc o n t r o l l e db y a na l l e l eo fo ml o c u sw h i c hh a sb e e nm a p p e do r nm o u s ec h r o m o s o m e11 r e c e n t l yy e a r s ，p r o f e s s o rz h a of o u n dt h e r ew e r et h eo v l l l im u t a n tm o d i f i e r s ( o m m y ) i nb 6b a c k g r o u n d ，w h i c hm a d et h em o r t a l i t yo fe m b r y oa d v a n c e dw i t ht h ea l t e r a t i o n o ft h eg e n e t i cb a c k g r o u n d m e a n w h i l e ，t h e r ew e r es o m es c h o l a r sf o u n dt h em o d i f i e r s t h r o u g hd i f f e r e n tw a y sa n dm e t h o d s ，b u td i f f e r e n tc o n c l u s i o n sw e r ee x i s t e da b o u tt h e n u m b e ro ft h em o d i f i e ra n dt h ew a yi te x p r e s s e d i nt h ep r e s e n ts t u d y ，w em a i n l yt of i n do u tt h en u m b e ro ft h eo v u mm u t a n t m o d i f i e r s ( o m m j ) ，i tw o u l db et h ef o u n d a t i o no fl a u n c h i n gt h ew a y so fm o d i f i e r s s t u d y a f t e r3y e a r s h a r dw o r k i n g ，w ea d dt h ea m o u n to fs a m p l e sa tt h eb a s i co f16 4 d a t aw h i c hp r o f e s s o rz h a oc o l l e c t e da n dh a v eo b t a i n e dt h ep h e n o t y p ed a t ao fa l lt h e 13 7s a m p l e s ，a n da c c o m p l i s h e dt h eg e n o m es c a n n i n go f8 9s a m p l e s a p p l y i n gt h e s o f t w a r eo fw i n q t l c a r ，w ea n a l y z e dt h e8 9s a m p l e sw i t hc o m p o s i t ei n t e r v a lm a p p i n g i ti ss h o w e dt h a tt h e r em a y b ee x i s t e dt h eq t l so fi m p l a n t a t i o ni nt h ef o u r t h 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)2 0 1 0 屆碩j j 研究生學(xué)位論文 c h r o m o s o m ew i t ht h el o ds c o r eo f3 o ；i na d d i t i o n ，t h e r em a yb eq t l si nt h e f i r s t ，t h en i n t h ，t h ef o u r t e e n t ha n dt h es e v e n t e e n t hc h r o m o s o m ea n dt h e i rl o ds c o r e s a r ea l la b o v e1 5 t h er e s u l t sw e r ei na c c o r d a n c ew i t hp r o f e s s o rz h a o s b e s i d e s ，t h ep o l y g e n er e g u l a t i o ni nt h ep r o c e s so fm o u s e sb l a s t o c y s tf o r m a t i o ni s c o n f i r m e di nt h i se x p e r i m e n t w h i c hc a nh e l pt of i l a do u tt h ee f f e c ta n da c t i o nl a wo f m o u s e so v u mm u t a n t ，a n dm a k en e c e s s a r yp r e p a r a t i o n sf o rt h ef u r t h e rs t u d yo f o m m f sf u n c t i o ne x p r e s s i n go fo v u mm u t a n t k e yw o r d s ：m o u s e ；o v u mm u t a n tg e n e ；d d ks y n d r o m e ；m o d i f i e rg e n e ；q t l s ； 3 7 致謝 感謝導(dǎo)師趙衛(wèi)東老師三年來對我學(xué)習(xí)、研究和生活等方面給予的教導(dǎo)和關(guān) 心。在導(dǎo)師的悉心指導(dǎo)下，我順利的完成了碩士學(xué)位論文，在理論知識和科研能 力上都有了很大提高。導(dǎo)師進(jìn)取的精神、創(chuàng)新的意識、執(zhí)著的追求和嚴(yán)謹(jǐn)?shù)墓ぷ?態(tài)度永遠(yuǎn)是我學(xué)習(xí)的榜樣，高尚的人格魅力將永遠(yuǎn)激勵(lì)著我前進(jìn)。 感謝導(dǎo)師組鄭振宇、李春麗老師三年來對我學(xué)習(xí)、實(shí)驗(yàn)以及生活等方面給予 的大力幫助和熱心照顧。感謝河南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院吳建宇副院長、邱立友 老師、王明道老師等在我研究生學(xué)習(xí)、論文開題及實(shí)驗(yàn)中所提供的寶貴建議和指 導(dǎo)。 感謝河南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物遺傳工程實(shí)驗(yàn)室的師兄弟武剛、張?zhí)煨恰⒐?、宋?娣、雷建、柴保國、宋佳晟、周鑫、王棟、王善強(qiáng)，師姐妹徐雪麗、王婷婷、趙 炎蔥、韓露、黃仙仙、張晶在我們朝夕相處的日子里給予我的友愛和幫助。 感謝家人和朋友多年來對我的鼓勵(lì)和支持，再次感謝所有關(guān)心和幫助過我 的老師、同學(xué)、朋友和親人們。 華欣欣 2 0 1 0 年6 月 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)2 0 1 0 屆碩士研究生學(xué)位論文 1 文獻(xiàn)綜述 小鼠( m i c e ) ，學(xué)名：m u s m u s c u l u s ，俗名：鼷鼠。從動物分類學(xué)的角度講，它屬于動 物界( k i n g d o m ) 、脊椎動物f - l ( p h y l u m ) 、哺乳綱( c l a s s ) 、嚙齒( o r d e r ) 、鼠科( s e c t i o no rf a m i l y ) 、 小鼠屬( g e n u s ) 、小家鼠種( s p e c i e s ) l l 】。小鼠具有喜歡群居、體型較小、性情溫順、易 于飼養(yǎng)管理等生活習(xí)性，以及發(fā)育迅速、性成熟早、性周期短、繁殖力強(qiáng)等生殖特征，尤其 是它們還與人類同屬于哺乳類物種，因而被作為常用的實(shí)驗(yàn)動物，應(yīng)用于動物的生理學(xué)、解 剖學(xué)、遺傳學(xué)，以及醫(yī)學(xué)、獸醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域的教學(xué)和科研之中1 2 d 1 。 由于小鼠基因組與人類基因組高度同源、小鼠基因組改造手段非常成熟以及小鼠近交 系、突變系和工具小鼠品系種類繁多，小鼠遺傳學(xué)已成為發(fā)育生物學(xué)、功能基因組學(xué)和疾病 機(jī)理研究的核心研究領(lǐng)域，小鼠也成為最重要的模式生物之一1 4 】。近年來，隨著小鼠基因組 序列測序的完成【5 1 ，不同小鼠近交系品系特異的微衛(wèi)星標(biāo)記或單核苷酸多態(tài)性不斷被發(fā)現(xiàn) 降引，小鼠生理生化表型分析手段和數(shù)據(jù)也越來越完善，這些前期工作導(dǎo)致了目前大規(guī)模的 基岡剔除計(jì)劃、基因突變計(jì)劃及構(gòu)建和分析重組近交系計(jì)劃的實(shí)施。這些計(jì)劃可能構(gòu)成未來 1 0 - - 2 0 年中生命科學(xué)和醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域最重要的內(nèi)容之一。 1 1 小鼠的研究歷史及現(xiàn)狀 目前生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域通常所研究的是小家鼠( m u s c u l u s ) ，是一類和人類共居的小型嚙 齒動物，在地球上分布廣泛，種類繁多。小鼠作為實(shí)驗(yàn)材料的最早記載是在1 6 6 4 年，r o b e r t h o o k e 在空中觀察了小鼠的反應(yīng)，這也是小鼠做為科學(xué)研究的第一個(gè)報(bào)告。然后在1 9 0 0 年， 退休的中學(xué)教師a b b i el a t h r o p 在其位于馬薩諸塞州g 啪b y 的農(nóng)場里開始飼養(yǎng)一種名為 “f a n c y ”的小鼠，最初這種小鼠作為一種寵物，后來它成了研究中的重要材料。直至1 j 1 9 0 2 年， 哈佛大學(xué)的c a s t l e 才在當(dāng)時(shí)孟德爾遺傳學(xué)研究的影響下開始了小鼠遺傳學(xué)研究，并在其學(xué)生 的幫助下對小鼠的遺傳和基岡變化進(jìn)行系統(tǒng)的分析【9 l 。1 9 0 8 年，w i l l i a mc a s t l e 開設(shè)t h a r v l o p b u s s e y 研究所，許多早期的小鼠遺傳學(xué)家都源于那里。后來為了更好的進(jìn)行科學(xué)研究，人們 開始培育近交系小鼠。1 9 0 9 年c a s t l e 實(shí)驗(yàn)室的l i t t l e 得到了第一個(gè)近交系小鼠d b a 品系 后，在c o l ds p r i n gh a r b o fl a b o r a t o r y 和t h ej a c k s o nl a b o r a t o r y l 作中陸續(xù)得到了c 5 7 b l 6 、 c 3 h 、c b a 和b a l b c 等多種近交系小鼠，這些近交系構(gòu)成了目前世界上使用最廣泛的幾種 品系。在這一百年里人們已經(jīng)建立了近4 0 0 個(gè)近交系1 1 0 1 。 近交系是指通過同窩交配保持2 0 代以上，且除自發(fā)性突變外，基本上保證全部基因位 點(diǎn)同種性的一種品系。它是在血緣關(guān)系極為相近的個(gè)體之間或遺傳組成相似的個(gè)體之間進(jìn)行 交配繁殖。通過近交使一個(gè)種群達(dá)到接近完全純合，即所有同源染色體的相對位置都具有相 同基因的狀態(tài)。因此，通過同胞兄妹或親子交配可以較快獲得近交系動物。近交可以降低雜 合性，并將群體分離為不同的品系。近交系繁殖是小鼠遺傳學(xué)研究史中的重要階段之一，它 徹底改變了發(fā)育生物學(xué)、癌癥研究、組織移植以及免疫學(xué)等多領(lǐng)域的研究狀況。使用近交系 小鼠的主要優(yōu)點(diǎn)有【l u ：1 具有相同的基因型，表現(xiàn)型也一致，所以其反應(yīng)是一致的，實(shí)驗(yàn) 2 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)2 0 1 0 屆碩七研究生學(xué)位論文 結(jié)果上e 確、可靠。由于連續(xù)近交繁殖，同一近交系的各個(gè)體具有相同的基因型，在相同的環(huán) 境條件下又具有相同的表現(xiàn)型，故其性狀即其各種生物學(xué)特性比較一致，對外來刺激反應(yīng)也 一致。2 各品系均有其獨(dú)特的特性，根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康目蛇x用不同品系來作實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)性 好，所用動物少，實(shí)驗(yàn)周期短，節(jié)省人力、物力和時(shí)間。3 國際上分布廣泛，不同國家的 科研單位由于使用同一近交系動物所得結(jié)果是相似的，便于國內(nèi)和國際問學(xué)術(shù)交流和實(shí)驗(yàn)重 復(fù)。4 可以作為有價(jià)值的病理學(xué)模型，如有致癌品系、抗癌品系、致白血病品系，嗜酒性 品系、易抽搐品系等，是研究人類疾病的重要實(shí)驗(yàn)材料。5 它是標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)材料，動物生 長發(fā)育到一定時(shí)間就有一定的規(guī)格。6 有大量的歷史資料可查，每個(gè)品系均有其詳細(xì)的遺 傳學(xué)資料，遺傳背景明確，其生物學(xué)特性、生理生化特點(diǎn)、常見疾病( 包括自發(fā)性疾病) 等 都有過系統(tǒng)的研究，便于研究者查閱和選擇應(yīng)用。因此，近交系小鼠倍受遺傳學(xué)、醫(yī)學(xué)、獸 醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域科研工作者的青睞。 小鼠作為模式生物相對于其他物種有自身優(yōu)勢。首先，從進(jìn)化的角度上看小鼠作為哺乳 動物的代表有其不可動搖的地位。除了小鼠以外的四種模式動物至少在2 7 億年前就在進(jìn)化 上與人類走到了不同的分支，而小鼠在6 千萬年前還和人類共同擁有一個(gè)祖先。在2 0 0 2 年 小鼠基因組的測序工作初步完成時(shí)，研究者們分析了9 6 小鼠基因組序列。在這其中有9 9 的基岡能在人的基因組序列中找到同源序列，證實(shí)了小鼠與人類在基因水平上的高度同源。 同樣，小鼠的生理生化指標(biāo)及其調(diào)控機(jī)制和人類相同或相似，因此小鼠的研究成果就可以推 演到人類，所以對小鼠進(jìn)行研究有很大的應(yīng)用價(jià)值。其次，和狗、猴等大型哺乳動物相比， 小鼠的繁殖能力強(qiáng)，生殖周期短。通常實(shí)驗(yàn)用的近交系小鼠一胎生育5 1 0 只幼鼠，而遠(yuǎn)交 群的小鼠的生殖能力更強(qiáng)。這些幼鼠在6 - - - 8 周之后就能達(dá)到性成熟的狀態(tài)，開始繁殖下一 代。同時(shí)小鼠沒有親子相殘的習(xí)性，這樣生產(chǎn)后的雌鼠和幼鼠仍可以和雄鼠同籠。這樣不但 確保了幼鼠的成活率，同時(shí)也能提高交配的頻率，確保了繁殖的高效率。小鼠飼養(yǎng)也相對簡 單，由于小鼠體積小( 通常成年鼠的體重在2 0 - - 4 0 9 之間) ，所以可以在有限的空間內(nèi)進(jìn)行大 規(guī)模飼養(yǎng)，因而十分利于進(jìn)行大規(guī)模的實(shí)驗(yàn)。再次，小鼠交配時(shí)會形成陰栓，這有助于判斷 交配的時(shí)間，對研究中判斷不同發(fā)育階段十分重要。因?yàn)槠渌麆游锏氖芫珪r(shí)間通常要通過觀 察交配行為來確定，而小鼠的這種特性就使研究人員不必時(shí)刻注意實(shí)驗(yàn)動物的行為，為工作 提供了便利。小鼠的大多數(shù)品系比較溫順，容易抓取和進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作。最后，由于小鼠的這 些特點(diǎn)使其在世界范圍內(nèi)廣泛使用，而且形成了各種實(shí)驗(yàn)用近交系，使用有基本一致遺傳背 景的近交系小鼠所做出的實(shí)驗(yàn)結(jié)果容易在不同的實(shí)驗(yàn)室重復(fù)，這就使實(shí)驗(yàn)結(jié)果更容易被接 受。這也是小鼠作為模式生物的主要優(yōu)勢之一。 小鼠的分子生物學(xué)研究進(jìn)展為揭秘小鼠全部生命遺傳奧秘提供了可能。由于不同的小鼠 近交系在生長、發(fā)育、代謝、行為等指標(biāo)上存在著明顯的差異，因此，通過這些近交系基因 組的多態(tài)性連鎖分析，可以建立特定功能表型在基因組上的定位，發(fā)現(xiàn)和確定表型與基因型 之間的關(guān)系。從最早的簡單分析不同近交系的分子多態(tài)性，進(jìn)而采用微衛(wèi)星標(biāo)記，最新發(fā)展 3 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)2 0 10 屆碩士研究生學(xué)位論文 到單核苷酸多態(tài)性，使在基因組中將一個(gè)表達(dá)特定功能或表型的基因定位到l k b 將不再是夢 想【l 玉1 4 】。近年來，在基因組計(jì)劃完成的基礎(chǔ)上，通過化學(xué)誘變、d n a “基因陷阱”或轉(zhuǎn)座 子轉(zhuǎn)座作用建立新的突變小鼠品系成為一種時(shí)尚，這種以新突變品系的病理表型為出發(fā)點(diǎn)， 然后通過突變的染色體定位，最終克隆突變基岡的方法已經(jīng)大大推動了疾病模型的研究，并 在短期內(nèi)提供了大量的新的小鼠品系i ”d 7 l 。經(jīng)典的小鼠遺傳學(xué)家也找到了新的思路，他們正 在建立上百種通過現(xiàn)有近交系雜交而形成的新的重組近交系t 1 8 1 。通過對這些新的近交系與 母本近交系在生理生化表型和基因型的連鎖比較，我們有望對一些復(fù)雜性狀( 如代謝過程) 的 調(diào)控作深入的遺傳學(xué)分析，從而發(fā)現(xiàn)復(fù)雜疾病( 包括糖尿病、肥胖癥、高血壓、免疫失調(diào)、 及神經(jīng)性疾病等) 的發(fā)病機(jī)理機(jī)制。從2 0 0 5 年起，大規(guī)模開展基因剔除的研究計(jì)劃分別在美 國、歐盟和加拿大實(shí)施，第一期總投資達(dá)l 億多美元。該計(jì)劃的最終目標(biāo)是要將小鼠的3 萬多 個(gè)基因逐一進(jìn)行基因剔除，建立基因剔除小鼠品系，從而分析基因的功能i 悖l ?？梢灶A(yù)見， 小鼠的突變品系，將在不遠(yuǎn)的將來達(dá)- 至l j 4 5 萬個(gè)品系。 1 2d d k 小鼠的研究歷史及現(xiàn)狀 d d k 近交系小鼠，是日本學(xué)者從一種屬于m 研d o m e s t i c u s 亞種起源的德國小鼠培育而 成1 2 0 】，其攜帶有卵子突變基因( o v u mm u t a n t 或o m ) ，并表現(xiàn)出一種被稱為“d d k 綜合癥”( d d k s y n d r o m e ) 的奇特繁殖現(xiàn)象：如同品系內(nèi)交配一樣，d d k 雄鼠能夠使其它近交系雌鼠正常受 孕。但是，當(dāng)d d k 雌鼠與其它近交系雄鼠交配時(shí)，f l 受精卵在妊娠3 5 日岡胚泡形成障礙而 死亡，使得d d k 雌鼠幾乎不孕【2 1 2 3 1 。 有關(guān)“d d k 綜合癥”及o m 基因的研究，國外主要集中在3 個(gè)國家：美國、法國和日本【2 啦6 1 。 美國小組的研究方向主要是o m 位點(diǎn)的基岡傳遞率扭曲和鋤基因在小鼠克隆胚胎中的表達(dá) 等方面【2 7 。2 9 j ；法國小組的研究集中在對o m 基因堿基序列的解析方面1 3 0 , 3 1 】；日本研究小組則 主要集中于d d k 綜合癥的組織胚胎學(xué)和o m 修飾基因的研究 3 2 , 2 5 1 ；國內(nèi)除河南農(nóng)業(yè)大學(xué)趙衛(wèi) 東研究小組外，尚未見相關(guān)研究報(bào)道。趙衛(wèi)東曾在日本參與相關(guān)研究，回國后主要致力于 o m 修飾基岡和精卵親和性研究1 3 3 - 3 5 l 。 1 2 1o m 基因的發(fā)現(xiàn) 1 9 6 0 年，日本學(xué)者t o m i t a j l 匝過d d k 品系與k k 品系的正反交實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：當(dāng)d d k 品系雌鼠 與k k 品系雄鼠交配時(shí)，平均胎仔數(shù)為2 24 - 0 5 ，但是當(dāng)k k 品系雌鼠與d d k 品系雄鼠交配時(shí)， 平均胎仔數(shù)為6 74 - 0 8 。同時(shí)，他在d d k 品系與k s a 品系的交配實(shí)驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)了類似的情況 【2 們。1 9 9 0 年，b a b i n e t 等以d d k 品系和b a l b c 品系作為實(shí)驗(yàn)動物，得到了與t o m i t a l 9 6 0 年研 究相類似的結(jié)果，并把這種奇特的繁殖現(xiàn)象命名為“d d k 綜合癥”p 6 1 。1 9 6 7 年，w a k a s u g i 在 t o m i t a l 9 6 0 年研究的基礎(chǔ)上，采用d d k 品系、k k 品系與n c 品系作為實(shí)驗(yàn)動物，通過采集 d d k 早x k k 3 和d d k 2 n c 3 不同時(shí)期的受精卵，研究發(fā)現(xiàn)2 細(xì)胞期、4 細(xì)胞期、8 細(xì)胞期與 桑葚胚胚胎發(fā)育正常，但當(dāng)胚胎發(fā)育從桑葚胚到胚泡的過程中( 妊娠3 5 日) ，胚泡形成障 礙，胚胎因不能著床而死亡1 2 。七十年代，基于交配實(shí)驗(yàn)結(jié)果的遺傳分析，w a k a s u g i 提出 4 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)2 0 1 0 局頂一七研究生學(xué)位論文 了解釋這一現(xiàn)象的遺傳假謝”j ，其要點(diǎn)如圖1 所示i ”】： ( 1 ) ( d d k 早x 其它品系d ) fz 代胚 胎死亡的原因，是由于卵子細(xì)胞質(zhì)因子( c y t o p l a s m i cf a c t o ro f e g g s ) 與精子岡子( s p e r mf a c t o r ) 的不親和性造成的，而這些不親和性因子的產(chǎn)生均受到位于染色體同一位點(diǎn)上的一對等位基 岡控制；( 2 ) d d k 占i ! n 系染色體上存在的是卵子突變基因( 鋤) ，它分別控制著0 卵子細(xì)胞 質(zhì)因子和s 精子因子的合成：而其它品系的相同位點(diǎn)上存在的是正?；颉? ”，它分別控 制著“o ”卵子細(xì)胞質(zhì)岡子和“s ”精子因子的合成；( 3 ) 在這些因子形成的四種組合中，只有 當(dāng)帶有“o ”的卵子和帶有“s ”的精子相遇( o s ) 時(shí)，才形成卵子細(xì)胞質(zhì)岡子與精子因子的不 親和型，導(dǎo)致胚胎正常發(fā)育受阻并最終死亡；而其余三種組合( o s 、o s 、o s ) ，則 全部為親和型，從而使胚胎能夠正常發(fā)育并最終產(chǎn)仔。后來，這一假說得到了卵子細(xì)胞質(zhì)移 植和受精卵原核移植實(shí)驗(yàn)的證明1 36 1 ，d d k f i ；j 子細(xì)胞質(zhì)岡子作為一種r n a 分子的存在也已被 確認(rèn)( 改稱為卵子細(xì)胞質(zhì)物質(zhì)) p8 1 。 c o m p a t i b l ec o m p a t i b l ei n c o m p a t i b l ec o m p a t i b l e a l i e ne 9 8 ( o ) a n d d d ks p e r m ( s ) a l i e n e g g ( o ) a n d a l i e ns p e r m ( s ) d d k e g g ( o ) a n d a l i e ns p e r m ( s ) d d ke g g ( o ) a n d d d k s p e r m ( s ) 圖i小鼠1l 號染色體上卵子突變基因控制的卵子細(xì)胞質(zhì)物質(zhì)與精子因子相互作用 注：實(shí)驗(yàn)室大多數(shù)小鼠的正常卵子突變位點(diǎn)產(chǎn)生的卵子細(xì)胞質(zhì)物質(zhì)和精子因子分別表示為“0 s ”，d d k 小鼠卵子突變位點(diǎn)產(chǎn)生的卵子細(xì)胞質(zhì)物質(zhì)和精子因子分別表示為“o ”“s ”，在卵子細(xì)胞質(zhì)物質(zhì)與精子因子 的組合中，只有在“o ”和“s ”的組合中是不親和的，其它三種組合( o s ，o s 手l l o s ) 均為親和的。 f i g i i n t e r a c t i o n sb e t w e e nc y t o p l a s m i cf a c t o r so fe g g sa n ds p e r mf a c t o r sc o n t r o l l e db yt h ea l l e l e sa to v u m m u t a n tc o r n ) l o c u so nm o u s ec h r1i n o t e ：t h en o r m a la l l e l ea tt h eo ml o c u sp o s s e s s e db yt h em a j o r i t yo fl a b o r a t o r ym o u s es t r a i n sp r o d u c e sa c y t o p l a s m i cf a c t o r ( o ) i nt h eo o c y t ea n das p e r mf a c t o r ( s ) t h ea l l e l eo fd d k s t r a i nm a k e sac y t o p l a s m i cf a c t o r ( o ) a n das p e r mf a c t o r ( s ) t h ec o m b i n a t i o nb e t w e e nt h ec y t o p l a s m i cf a c t o r ( o ) a n dt h es p e r mf a c t o r ( s ) i s i n c o m p a t i b l e ，a n do t h e rt h r e ec o m b i n a t i o n s ( o - s ，o - sa n do s ) a r ec o m p a t i b l e 1 2 2o m 基因的定位 九十年代，許多學(xué)者分別通過微衛(wèi)星分子標(biāo)記等方法，對o m 基因定位展開了研究：1 9 9 2 年，b a l d a c c i 等采用d d k 品系3 1 1 b a l b c 品系作為實(shí)驗(yàn)動物，將o m 基因定位在第1 1 條染色體 上，且與酒p 位點(diǎn)緊密連鎖；1 9 9 2 年，s a p i e n z 等采用d d k 品系和c 5 7 b l 6 品系作為實(shí)驗(yàn) 動物，將o m 基因定位在第1 l 條染色體上接近) c m v 4 2 位點(diǎn)的位置【4 0 】：1 9 9 6 年，b a l d a c c i 等采 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)2 0 1 0 屆碩士研究生學(xué)位論文 用d d k 品系和b a l b c 品系作為實(shí)驗(yàn)動物，將o m 基因定位在第1 1 條染色體上引物s e y a 2 和 d l l m i t 3 6 之間2 c m 的位置【4 l l ：1 9 9 6 年，p a r d o - m a n u e ld ev i l l e n a 采用d d k 品系和c 5 7 b l 6 品系 作為實(shí)驗(yàn)動物，將o m 基因定位在第l l 條染色體_ l d l l m i t 3 8 和d 1 1 m i t 6 6 芝l 剮4 2 1 ；1 9 9 7 年， p a r d o m a n u e ld ev i l l e n a 采：用d d k 品系和c 5 7 b l 6 品系作為實(shí)驗(yàn)動物，將o m 基因定位在第1 l 條染色體上接近瑚，位點(diǎn)的位置 4 3 1 ；2 0 0 0 年，p a r d o - m a n u e ld ev i l l e n a 采用d d k 品系和 c 5 7 b l 6 品系作為實(shí)驗(yàn)動物，將o m 基因定位在第ll 條染色體j _ d l l m i t 3 5 4 和d j n 衙配之間大 約4 7 c m 的位置l ( 圖2 ) ，從此，“d d k 綜合癥”也已作為研究小鼠早期胚胎發(fā)育中雙親基 因型與卵子細(xì)胞質(zhì)相互作用機(jī)理的很好模式而被應(yīng)用。 7 10c mi l 陋1 7 l l m i t 2 0 1 m i t 6 7 i m 誣6 l j m i l l 6 8 圖2 第l l 條染色體上o m 位點(diǎn)的連鎖圖 f i g 2 m e i o t i cm a po f t h eo mr e g i o no nm o u $ ec h r o m o s o m e ，j 1 2 3o m 基因的其他相關(guān)研究 d d k 綜合癥的胚胎死亡發(fā)生在8 細(xì)胞到1 6 細(xì)胞期的過渡期，細(xì)胞學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，這個(gè)時(shí) 期的胚胎自發(fā)的發(fā)生了去聚縮化，胚胎細(xì)胞因無法正常形成內(nèi)細(xì)胞團(tuán)和滋養(yǎng)外胚層而死亡， m i a b u e h r 等在細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，用甲胺處理培養(yǎng)基提高細(xì)胞內(nèi)p h 值可以明顯提高 d d k c 3 h 型胚胎在1 6 細(xì)胞期的存活率，但是一旦去聚縮化發(fā)生，這種處理已經(jīng)沒有效果。 6 硒強(qiáng) 一一一|萋 巧 綰腮巧o i 室 腳嬲刪枷 ， d d d d d d d d d d 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)2 0 1 0 屆碩上研究生學(xué)位論文 用間隙連接抗體處理胚胎細(xì)胞d d k d d k 型合子細(xì)胞和d d k c 3 h 型胚胎，一樣發(fā)生了凋亡 1 4 列。據(jù)此推測，d d k 綜合癥影響了細(xì)胞的間隙連接，造成細(xì)胞間通訊或物質(zhì)交流異常，導(dǎo) 致胚胎發(fā)育阻斷。最新研究證實(shí)，f l ( d d k 早b 6 古) 的胚胎在發(fā)育中和細(xì)胞內(nèi)有機(jī)酸和羧 酸代謝相關(guān)的基因與對照組胚胎表達(dá)量相比顯著升耐4 6 1 ，這便可以解釋f l ( d d k 早x b 6 8 ) 胚胎在發(fā)育過程中細(xì)胞p h 值偏低以及細(xì)胞間隙連接弱化的現(xiàn)象：這些基因的高表達(dá)導(dǎo)致細(xì) 胞內(nèi)p h 值下降，而細(xì)胞間p h 的下降正是導(dǎo)致間隙連接滲透率下降的主要原因1 4 卯。 o m 基因已經(jīng)精細(xì)定位在小鼠第l l 號染色體上遠(yuǎn)端4 7 e m 處大約2 c m 的范圍內(nèi)， c o h e n t a n n o u d j i 4 7 1 以及s t e 7 p h a n i el eb r a s 等使用外顯子捕獲等技術(shù)篩選了若干候選基因 【4 3 l ，這為o m 基因的圖位克隆或定位候選克隆提供了重要依據(jù)。r e n a r d 等發(fā)現(xiàn)所謂的卵子 細(xì)胞質(zhì)物質(zhì)是以r n a 分子的形式存在的1 3 引，并且通過二維變性聚丙烯酰胺蛋白電泳，c h a r l e s b a b i n e t 等在d d k 胚胎中發(fā)現(xiàn)并分離到了一個(gè)特異表達(dá)的蛋白d 1 4 ，這種蛋白在胚胎發(fā)育的 一細(xì)胞期( 生發(fā)泡破裂后幾個(gè)小時(shí)) 開始合成，在2 細(xì)胞期的合成停止，繼而穩(wěn)定存在到8 細(xì) 胞期，這種蛋白合成的停止與合子基因組的活動并無直接的關(guān)系，并且在其它供試的7 種純 系小鼠中未檢測到d 1 4 的表達(dá)。但r i c h o u x l 4 4 1 等人在w m p ( d o m e s t i c s ) 、m b t 、m a i 和p w k 這幾種小鼠的胚胎發(fā)育過程中發(fā)現(xiàn)有特異蛋白的合成，其中w m p 的特異蛋白為d 1 4 ，在 p w k 中檢出的蛋白和d 1 4 極為相似，并且細(xì)胞學(xué)定位發(fā)現(xiàn)，d 1 4 在小鼠早期胚胎的胞質(zhì)和 細(xì)胞核內(nèi)均有表達(dá)，對在合子基因轉(zhuǎn)錄激活前的蛋白質(zhì)功能的研究將有助于揭示母源岡子對 合子發(fā)育的影響【4 9 1 。 1 3 基因定位方法 基因定位( g e n el o c a t i o n ) 是用一定的方法將基因確定到染色體的實(shí)際位置。這是現(xiàn)代 遺傳學(xué)的重要研究內(nèi)容之一。將不同的基岡確定于染色體的具體位置之后，即可繪制出基因 圖( g e n em a p ) ?；蚨ㄎ豢蓮募蚁捣治?、細(xì)胞、染色體和分子水平進(jìn)行研究，同時(shí)由于使 用手段的不同派生出多種方法，不同方法又可聯(lián)合使用，互為補(bǔ)充?，F(xiàn)僅就幾個(gè)主要方法加 以說明。 1 3 1 體細(xì)胞雜交法 體細(xì)胞是生物體除生殖細(xì)胞外的所有細(xì)胞，將從身體分離的體細(xì)胞做組織培養(yǎng)進(jìn)行遺傳 學(xué)研究的學(xué)科稱為體細(xì)胞遺傳學(xué)( s o m a t i cg e n e t i c s ) 。體外培養(yǎng)細(xì)胞可人為控制或改變環(huán)境 條件，并可建立細(xì)胞株，長期保存，進(jìn)行各種正常和病理研究。與基因定位有關(guān)的是體細(xì)胞 雜交( s o m a t i cc e l lh y b r i d i z a t i o n ) 。細(xì)胞雜交又稱細(xì)胞融合( c e l lf u s i o n ) ，是將來源不同的 兩種細(xì)胞融合成一個(gè)新細(xì)胞。大多數(shù)體細(xì)胞雜交是用人的細(xì)胞與小鼠、大鼠或倉鼠的體細(xì)胞 ( h y b r i dc e l l ) 進(jìn)行雜交。這種新產(chǎn)生的融合細(xì)胞稱為雜種細(xì)胞( h y b r i dc e l l ) ，含有雙親不同 的染色體。雜種細(xì)胞有一個(gè)重要的特點(diǎn)是在其繁殖傳代過程中出現(xiàn)保留嚙齒類一方染色體而 人類染色體則逐漸丟失，最后只剩一條或幾條，其原因至今不明。這種僅保留少數(shù)甚至一條 人染色體的雜種細(xì)胞正是進(jìn)行基因連鎖分析和基因定位的有用材料。 7 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)2 0 1 0 屆碩 ：研究生學(xué)位論文 1 3 2 克隆嵌板法 克隆嵌板法( c l o n ep a n e lm e t h o d ) 是應(yīng)用雜種細(xì)胞保留或丟失人染色體有時(shí)有重疊現(xiàn)象 而設(shè)計(jì)的一種簡便有用的基因定位方法。如表l 所示，選擇3 個(gè)都保留有4 條人染色體的雜 種細(xì)胞克隆，但染色體各不相同。如果某一表型特征只出現(xiàn)于克隆a 、c 而不見于b ，就可 決定該特征的基因只能在3 號染色體上，因?yàn)閍 、c 克隆都有3 號染色體，而b 克隆則無， 其它亦可同理判斷。這樣3 個(gè)克隆可對8 條( 2 3 = 8 ) 染色體作出判斷：如果是5 個(gè)克隆( 2 5 = 3 2 ) 就可對人類2 2 條常染色體和2 條性染色體作出判斷。例如半乳糖激酶( g k ) 、尿苷磷酸 激酶( u m k ) 和氨基已糖菅酶a ( h e x a ) 的基因就是用此法分別定位于人的1 7 號、1 號 和1 5 號染色體上的。此外，還可對雜種細(xì)胞進(jìn)行特殊染色，來識別雜種細(xì)胞中人和鼠染色 體，以助基岡定位。 表l 克隆嵌板法示意 t a b l e1t h ec l o n ep a n e lm e t h o d 1 3 3 原位雜交和熒光原位雜交 原位雜交( i ns i t uh y b r i d i z a t i o n ) 是分子雜交技術(shù)在基因定位中的應(yīng)用，也是一種直接 進(jìn)行基因定位的方法。其基本原理是堿基的互補(bǔ)配對，同源的d n a d n a 雙鏈或d n a r n a 鏈在一定條件下能結(jié)合成雙鏈，用放射性或非放射性物質(zhì)標(biāo)記的d n a 或r n a 分子作為探 針，可探測到細(xì)胞基因組中的同源部分。原位雜交的特點(diǎn)是雜交在顯微鏡載玻片上中期染色 體標(biāo)本上進(jìn)行。所謂原位即指標(biāo)本上d n a 原位變性，在利用放射性或非放射性標(biāo)記的已知 核酸探針雜交后，通過放射自顯影或非放射性檢測體系來檢測染色體上特異d n a 或r n a 順序，可用放射性顆粒在某條染色體的區(qū)帶出現(xiàn)的最高頻率或熒光的強(qiáng)弱來確定探針的位 置，從而進(jìn)行準(zhǔn)確的基岡定位。但原位雜交必須在已知探針的情況下方可進(jìn)行，而在未知致 病基因時(shí)，則無法進(jìn)行基因定位。放射性同位素標(biāo)記核酸探針與染色體顯帶結(jié)合進(jìn)行原位雜 交仍有不少缺點(diǎn)和局限性。例如需要使用放射性同位素的特殊實(shí)驗(yàn)室，自顯影曝光時(shí)間長， 同位素標(biāo)記的探針不易保存，放射污染不利健康，特別是高質(zhì)量的中期染色體標(biāo)本在細(xì)胞培 養(yǎng)基礎(chǔ)上難以得到，觀察費(fèi)時(shí)，對間期核的研究難以進(jìn)行等。 熒光原位雜交( f l u o r e s c e n c ei ns i t uh y b r i d i z a t i o n ，f i s h ) 是一種非放射性原位雜交方 法。用特殊熒光素標(biāo)記核酸( d n a ) 探針，可在染色體、細(xì)胞和組織切片標(biāo)本上進(jìn)行d n a 雜交，對檢測細(xì)胞內(nèi)d n a 或r n a 的特定序列存在與否最為有效。探針不是放射性的而是 將熒光染料與抗體蛋白結(jié)合進(jìn)行檢測。它們具有高度親和力，有與放射性探針相同或更高的 8 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)2 0 1 0 屆碩十研究生學(xué)位論文 分辯率。現(xiàn)已可用不同的熒光染料同時(shí)進(jìn)行多重原位雜交，顯示出不同的熒光色澤。這種多 色f i s h 技術(shù)近年來發(fā)展迅速，已成為基因定位作圖和醫(yī)學(xué)診斷的重要手段。 1 3 4 連鎖分析 基因定位的連鎖分析是根據(jù)基因在染色體上呈直線排列，不同基因相互連鎖成連鎖群的 原理，即應(yīng)用被定位的基因與同一染色體上另一基因或遺傳標(biāo)記相連鎖的特點(diǎn)進(jìn)行定位。生 殖細(xì)胞在減數(shù)分裂時(shí)發(fā)生交換，一對同源染色體上存在著兩個(gè)相鄰的基因座位，距離較遠(yuǎn)， 發(fā)生交換的機(jī)會較多，則出現(xiàn)基因重組；若兩者較近，則重組機(jī)會較少。重組d n a 和分子 克隆技術(shù)的出現(xiàn)，發(fā)現(xiàn)了許多遺傳標(biāo)記位點(diǎn)，利用某個(gè)擬定位的基因是否與某個(gè)遺傳存在連 鎖關(guān)系，以及連鎖的緊密程度就能將該基因定位到染色體的一定部位，使經(jīng)典連鎖方法獲得 新的廣闊用途，成為人類基因定位的重要手段。 從分子水平進(jìn)行基因定位，還有不少有效的新技術(shù)，它們相互配合使用，使基因定位得 到迅速發(fā)展。例如，利用染色體自身結(jié)構(gòu)及染色體畸變法進(jìn)行缺失作圖和基因劑量法等?？?之，人們已不只是用單一技術(shù)進(jìn)行基因定位，而是將細(xì)胞、染色體和分子水平技術(shù)結(jié)合起來， 綜合分析，互相印證，以達(dá)到快速、準(zhǔn)確基因定位的目的。 1 4 分子標(biāo)記技術(shù) 1 4 1 分子標(biāo)記的概念 分子標(biāo)記是以個(gè)體間遺傳物質(zhì)內(nèi)核營酸序列變異為基礎(chǔ)的遺傳標(biāo)記，是d n a 水平遺傳 多態(tài)性的直接的反映。與其他幾種遺傳標(biāo)記形態(tài)學(xué)標(biāo)記、生物化學(xué)標(biāo)記、細(xì)胞學(xué)標(biāo)記相 比，d n a 分子標(biāo)記具有的優(yōu)越性有：大多數(shù)分子標(biāo)記為共顯性，對隱性的性狀的選擇十分 便利；基因組變異極其豐富，分子標(biāo)記的數(shù)量兒乎是無限的；在生物發(fā)育的不同階段，不同 組織的d n a 都可用于標(biāo)記分析；分子標(biāo)記揭示來自d n a 的變異；表現(xiàn)為中性，不影響目 標(biāo)性狀的表達(dá)，與不良性狀無連鎖；檢測手段簡單、迅速。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，現(xiàn) 在d n a 分子標(biāo)記技術(shù)已有數(shù)十種，