DNA甲基化與個(gè)體年齡的相關(guān)性研究進(jìn)展

DNA 甲基化與個(gè)體年齡的相關(guān)性研究進(jìn)展 DNA 甲基化與個(gè)體年齡的相關(guān)性研究進(jìn)展 【摘 要】年齡推斷在法醫(yī)實(shí)踐中占有重要的地位。分子生物學(xué)的巨大進(jìn)展使得人們借助于生物學(xué)標(biāo)記推斷個(gè)體年齡成為可能。作為表觀遺傳學(xué)重要組成部分的 dna 甲基化，在機(jī)體生長(zhǎng)、發(fā)育、衰老的過程中存在著動(dòng)態(tài)變化過程通過檢測(cè) dna 甲基化改變，有望構(gòu)建與之相關(guān)的年齡變化模式，用以推斷個(gè)體年齡。本文著重介紹 dna 甲基化水平的改變與個(gè)體年齡的相關(guān)性及其在判斷個(gè)體年齡方面的前景?！娟P(guān)鍵詞】法醫(yī)物證； dna 甲基化；年齡推斷；生物體衰老【中圖分類號(hào)】d9l9 2【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】 a【文章編號(hào)】 1007 9297(2006)04 0284 05當(dāng)前在法醫(yī)學(xué)實(shí)踐中，對(duì)個(gè)體年齡的推斷主要是依據(jù)人類學(xué)方法測(cè)量骨骼、牙齒等一些具有年齡相關(guān)性的檢材并根據(jù)相關(guān)模型進(jìn)行計(jì)算。分子生物學(xué)的飛速發(fā)展，開拓了人們的視野。借助于分子生物學(xué)理論和方法在細(xì)胞水平、分子水平發(fā)現(xiàn)一些可能與年齡相關(guān)的遺傳學(xué)改變，如 dna 損傷修復(fù)能力、端粒的長(zhǎng)度、線粒體片段的缺失、 dna 甲基化水平、 b 一半乳糖苷酶活性以及基因表達(dá)譜等。 lll dna 甲基化是表觀遺傳學(xué) (epigenetics)的重要組成部分 ，在維持正常細(xì)胞功能、遺傳印記、胚胎發(fā)育以及人類腫瘤發(fā)生中起著重要作用在衰老的過程中某些細(xì)胞會(huì)發(fā)生年齡相關(guān)的變化， 121 例如某個(gè) cpg 島的從頭甲基化會(huì)關(guān)閉一個(gè)基因，使這個(gè)基因相關(guān)的生理功能喪失：同樣。甲基化的丟失也會(huì)激活正常情況下沉默的基因造成不恰當(dāng)?shù)漠愇槐磉_(dá)(ectopic expression)。必須指出，表觀遺傳研究絲毫沒有降低遺傳學(xué)或基因組學(xué)的重要性，恰恰相反，表觀遺傳學(xué)是在以孟德爾式遺傳為理論基石的經(jīng)典遺傳學(xué)和分子遺傳學(xué)母體中孕育的專門研究基因功能實(shí)現(xiàn)的一種特殊機(jī)制的遺傳學(xué)分支學(xué)科。認(rèn)識(shí)到表觀 基因組在發(fā)育、生長(zhǎng)和衰老過程中存在著一個(gè)動(dòng)態(tài)變化的過程，以及體細(xì)胞的表觀基因組有重新編程的可能性，有助于我們以新的觀點(diǎn)來探索衰老的機(jī)制，構(gòu)建年齡變化的模式。本文就 dna 甲基化與個(gè)體年齡的相關(guān)性及其在判斷個(gè)體年齡方面的前景進(jìn)行探討。一、概述 (一 )表觀遺傳學(xué)和 dna 甲基化遺傳學(xué)是與表觀遺傳學(xué) (genetic)相對(duì)應(yīng)的概念。遺傳學(xué)是指基于基因序列改變所致基因表達(dá)水平變化，如基因突變、基因雜合丟失和微衛(wèi)星不穩(wěn)定等；而表觀遺傳學(xué)則是指基于非基因序列改變所致基因表達(dá)水平變化，如 dna 甲基化和染色質(zhì)構(gòu)象變化等：表觀基因組 學(xué) (epigenomics)0是在基因組水平上對(duì)表觀遺傳學(xué)改變的研究。甲基化是最重要的表觀遺傳修飾形式。 dna 甲基化是生物體在 dna甲基化轉(zhuǎn)移酶 (dnmts)的作用下，以 s 一腺苷酰一 l 一甲硫氨酸 (sam)為甲基供體，將甲基轉(zhuǎn)移到特定堿基上去的過程， dna 甲基化多發(fā)生在胞嘧啶，大多在一 cpg 一序列上。胞嘧啶由此被修飾為 5 甲基胞嘧啶 (5-methylcytosine 5-mc)。這種 dna 修飾方式并沒有改變基因序列。但它調(diào)控了基因的表達(dá)。哺乳動(dòng)物中 cpg 序列在基因組中出現(xiàn)的頻率僅有 l，遠(yuǎn)低于基因組中的其他 核苷酸序列。但在基因組的某些區(qū)域中， cpg 序列密度很高，可以達(dá)均值的 5 倍以上，成為鳥嘌呤和胞嘧啶的富集區(qū)形成所謂 cpg 島。通常 cpg 島大約含有 500 多個(gè)堿基。在哺乳動(dòng)物基因組中約有 4 萬個(gè) cpg 島，而且只有 cpg 島的胞嘧啶能夠被甲基化， cpg 島通常位于基因的啟動(dòng)子區(qū)或是第一個(gè)外顯子區(qū) 。人類基因組中大小為 100 l 000 bp 左右且富含 cpg 二核苷酸的 cpg 島總是處于未甲基化狀態(tài)并且與 56的人類基因組編碼基因相關(guān)。人類基因組序列草圖分析結(jié)果表明，人類基因組 cpg 島約為 45 000 個(gè)大部分染色體每 1 mb 就有 5 15 個(gè) cpg 島。平均值為每 mb 含 lo 5 個(gè) cpg 島， cpg 島的數(shù)目與基因密度有良好的對(duì)應(yīng)關(guān)系。健康人基因組中 cpg 島中的 cpg 位點(diǎn)通常是處于非甲基化狀態(tài)，而在 cpg 島外的 cpg 位點(diǎn)則通常足甲基化的。這種甲基化的形式在細(xì)胞分裂的過程中能夠穩(wěn)定的保留。閣基因調(diào)控元件 (如啟動(dòng)子 )所含 cpg 島中的 5-mc 會(huì)阻礙 作者簡(jiǎn)介 李鑫 (1974 一 )，男，山東淄博人，主檢法醫(yī)師，碩士研究生，主要從事法醫(yī)遺傳學(xué)研究。法律與醫(yī)學(xué)雜志 2006 年第 l3 卷 (第 4 期 )轉(zhuǎn) 錄因子復(fù)合體與 dna 的結(jié)合，所以 dna 甲基 化一般與基因沉默(gene silence)相關(guān)聯(lián)；而去甲基化 (demethylation)往往與一個(gè)沉默基因的重新激活 (re activation)相關(guān)聯(lián)。當(dāng)機(jī)體衰老或呈病理狀態(tài)，特別是腫瘤發(fā)生時(shí)，抑癌基因 cpg 島以外的 cpg 序列非甲基化程度增加，而 cpg 島中的 cpg 則呈高度甲基化，以至于染色體螺旋程度增加及抑癌基因表達(dá)的丟失。一般說來， dna 的甲基化對(duì)維持染色體的結(jié)構(gòu)、 x 染色體的失活、基因印記和腫瘤的發(fā)生發(fā)展都起重要的作用。【 6】 (二 )dna 甲基化的生物作用及特點(diǎn) 1 dna 甲基化與基因表達(dá) dna 甲基化在 維持正常細(xì)胞功能、遺傳印記、胚胎發(fā)育過程以及衰老過程中起著極其重要的作用。研究表明胚胎的正常發(fā)育得益于基因組 dna 適當(dāng)?shù)募谆?。例如：缺少任何一種甲基轉(zhuǎn)移酶對(duì)小鼠胚胎的發(fā)育都是致死性的。 31 此外，等位基因的抑制被印記控制區(qū) (icrs)所調(diào)控，該區(qū)域在雙親中的一個(gè)等位基因是甲基化的。 17印記基因的異常表達(dá)可以引發(fā)伴有突變和表型缺陷的多種人類疾病。甲基化抑制基因轉(zhuǎn)錄主要通過以下機(jī)制來實(shí)現(xiàn)。 (1)直接抑制。 cpg 島甲基化真接干擾 tf 與調(diào)控區(qū) dna 的結(jié)合 例如 camp 反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(creb)， ap 一 2， e2f， nfkb 等 tf 不能與相應(yīng)的 dna 位點(diǎn)相結(jié)合。但有些 tf 如 sp1， ctf 與甲基化和非甲基化位點(diǎn)都能結(jié)合，這表明甲基化單獨(dú)不足以阻止體內(nèi) tf 與 dna 相結(jié)合。 (2)間接機(jī)制。近年來發(fā)現(xiàn)一些甲基化 dna 結(jié)合蛋白如 mdbp1， mdb2 以及甲基化 cpg 結(jié)合蛋白如 mecp1， mecp2 與甲基化 dna 特異結(jié)合，抑制基因轉(zhuǎn)錄。其介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄抑制的程度取決于甲基化密度和啟動(dòng)子的強(qiáng)度。如低密度甲基化可完全抑制一些弱的啟動(dòng)子，但對(duì)強(qiáng)的啟動(dòng)子則收效甚微。 (3)dna 甲基化還可通過影響染色體結(jié)構(gòu)來抑制轉(zhuǎn)錄。不僅甲基化啟動(dòng)子區(qū)形成的 核小體抑制體外起始轉(zhuǎn)錄，而且 mecp1 與甲基化啟動(dòng)子 cpg 位點(diǎn)結(jié)合后，可引起染色質(zhì)聚縮成非活性高級(jí)結(jié)構(gòu)，以至于轉(zhuǎn)錄因子不能與其相結(jié)合，從而抑制轉(zhuǎn)錄。 dna 甲基化狀態(tài)并非固定不變?cè)谠S多哺乳動(dòng)物組織內(nèi)，基因組甲基脫氧胞嘧啶水平隨老化而下降，在鮭魚、小鼠、大鼠、牛與人類的腦、肝臟、大腸粘膜、心臟和脾臟內(nèi)發(fā)現(xiàn)dna 脫甲基化作用。相反，大鼠肺則不發(fā)生脫甲基化，大鼠。腎內(nèi)甲基脫氧胞苷總含量增加。這說明甲基化狀態(tài)隨老化而變化，即發(fā)生甲基化 285 和脫甲基化，但總的說來，最常見的變化似乎是進(jìn)行性的脫甲基化。這些變化 均可導(dǎo)致隨老化而發(fā)生的基因表達(dá)變化。2 dna 甲基化與腫瘤的關(guān)系研究表明， dna 甲基化在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。甲基化狀態(tài)的改變是引起腫瘤的一個(gè)重要因素，這種變化包括 dna 甲基化總體水平降低和啟動(dòng)子等基因表達(dá)調(diào)控元件附近的 cpg 島局部甲基化水平的異常升高，從而導(dǎo)致基因組的不穩(wěn)定(如染色體的不穩(wěn)定、可移動(dòng)遺傳因子的激活、原癌基因的表達(dá) )和抑癌基因的不表達(dá)。如果抑癌基因中有活性的等位基因失活，則發(fā)生癌癥的幾率提高，例如：胰島素樣生長(zhǎng)因子一 2(igf 一 2)基因印記丟失導(dǎo)致多種腫瘤，如 wilms 瘤?！?8j3 dna 甲基化與基因印記基因組印記是性細(xì)胞系的一種表觀遺傳修飾，這種修飾有一整套分布于染色體不同部位的印記中心來協(xié)調(diào)。印記中心直接介導(dǎo)了印記標(biāo)記的建立及其在發(fā)育全過程中的維持和傳遞，并導(dǎo)致以親本來源特異性方式優(yōu)先表達(dá)兩個(gè)親本等位基因中的一個(gè)而使另一個(gè)沉默?；蚪M印記是可遺傳的， dna的甲基化在基因組印記的分子機(jī)理中充當(dāng)重要角色。dna 高甲基化是一個(gè)基因印記抑制信號(hào)， dna 甲基化對(duì)控制印記基因中父子和母子等位基因的不同表達(dá)具有重要作用。 914人類基因組dna 甲基化的特點(diǎn) dna 甲基化的基本特征有： 1)數(shù)量 多、信息容量大；2)可遺傳性：有絲分裂時(shí)分化細(xì)胞可以穩(wěn)定地將甲基化模式傳遞給子代細(xì)胞： 3)相對(duì)穩(wěn)定性，即在體內(nèi)內(nèi)外環(huán)境短時(shí)間變化不會(huì)引起細(xì)胞基因組甲基化譜的改變； 4)與 snp 標(biāo)記毗鄰，提供不同層次信息，相互補(bǔ)充。人類基因組 dna 甲基化還有自身特點(diǎn)。 (1)時(shí)空特異性。dna 甲基化是記錄細(xì)胞分化歷史、維持組織特異性基因表達(dá)的主要機(jī)制之一。有學(xué)者認(rèn)為， dna 甲基化可能使分化細(xì)胞基因組重新編程，通過 dna 甲基化來控制基因的時(shí)空表達(dá)，調(diào)節(jié)發(fā)育過程和各種生理反應(yīng)。在不同組織或同一類型細(xì)胞的不同發(fā)育階段，基因組 dna 上各cpg位點(diǎn)甲基化狀態(tài)的差異構(gòu)成基因組 dna甲基化譜。組織特異的 dna甲基化譜是哺乳動(dòng)物基因組的一個(gè)顯著特征。細(xì)胞之間 dna 甲基化模式的差異是在個(gè)體發(fā)育的過程中逐步形成的，并在以后的有絲分裂中保持不變。在胚胎發(fā)育過程中，細(xì)胞的甲基化模式按一定方向發(fā)生有規(guī)律地變化。成年個(gè)體，組織特異性基因形成組 286 織特異性的甲基化模式。隨著年齡增長(zhǎng)，基因組 dna 甲基化總體水平不斷下降特定 dna 片斷的甲基化程度可以增高或降低。取決于組織細(xì)胞和基因種類。 (2)親緣特異性。在某些基因座，所有組織體細(xì)胞都選擇性地將親代 一方的等位基因甲基化呈現(xiàn)親緣依賴的等位基因甲基化模式。 (3)病理特異性。在病理狀態(tài)下，組織細(xì)胞的 dna 甲基化譜發(fā)生特異性的改變。 dna 甲基化改變?cè)谠S多腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要的作用。目前證實(shí)，啟動(dòng)子高甲基化是腫瘤抑制基因第三種常見的失活途徑。二、 dna 甲基化與年齡相關(guān)性分化細(xì)胞的穩(wěn)定性是高等生物的基本特征之一。然而，在衰老過程中某些細(xì)胞會(huì)發(fā)生年齡相關(guān)的變化。例如，某種 cpg 島的從頭甲基化會(huì)關(guān)閉一個(gè)基因，喪失與這個(gè)基因相關(guān)的生理功能；同樣甲基化的喪失也會(huì)激活正常情況下沉默的基因，造成不恰當(dāng)?shù)漠愇槐磉_(dá)。 2o 世紀(jì) 8o 年代初， wilson 等測(cè)定了體外培養(yǎng)的人、田鼠及小鼠成纖維細(xì)胞 dna 的 5 甲基胞嘧啶含量，發(fā)現(xiàn)均隨細(xì)胞分裂次數(shù)的增加而降低且下降速度以人、田鼠、小鼠的次序遞減而永生化細(xì)胞系的 5 甲基胞嘧啶含量則保持相對(duì)穩(wěn)定。以 dna 甲基化酶抑制劑 5 氮雜胞苷或 5 氮脫氧胞苷處理人二倍體成纖維細(xì)胞或某些腫瘤細(xì)胞，可使其增殖能力下降，體外培養(yǎng)壽限縮短。因此， dna 甲基化水平也可以作為細(xì)胞分裂的 “ 計(jì)時(shí)器 ” 。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)同樣發(fā)現(xiàn)基因組整體甲基化水平有隨齡降低的趨勢(shì)。在基因組整體甲基化水平降低的同時(shí)，衰老過程中也伴有個(gè)別 基因甲基化水平增高的現(xiàn)象。最早證明與年齡相關(guān)啟動(dòng)子 cpg 島的甲基化是人結(jié)腸組織雌激素受體 (estrogen receptor， er)基因，年輕個(gè)體中，幾乎檢測(cè)不到 er 基因的甲基化，以后，隨齡逐漸升高。另外。胰島索樣生長(zhǎng)因子 2(insulinlike growth facror， igf2)、肌原調(diào)節(jié)蛋白myod1、體覺誘發(fā)電位組分 n33 基因啟動(dòng)子 cpg 島的甲基化水平在正常的結(jié)腸組織中同樣隨齡升高。 tra 等用限制性界標(biāo)基因組掃描技術(shù)對(duì) t 淋巴細(xì)胞 2000 個(gè)基因座的甲基化年齡變化情況進(jìn)行了調(diào)查，發(fā)現(xiàn) 29 個(gè)基因座有變 化，其中 23 個(gè)增加， 6 個(gè)降低。也許這些特定基因的甲基化是更好的衰老生物學(xué)標(biāo)志。陳培利等 _10利用人胚肺二倍體成纖維細(xì)胞 (human fetal lung diploid fibroblasts。 2bs)進(jìn)行體外培養(yǎng)。發(fā)現(xiàn)其 p16 基因啟動(dòng)子區(qū)及外顯子 i 處的 dna 甲基化水平隨個(gè)體細(xì)胞代齡的增加而降低。他們首先將 2bs 細(xì)胞在體外作常規(guī)傳代培養(yǎng) (規(guī)定 3o 代齡以內(nèi)為法律與醫(yī)學(xué)雜志 2006 年第 l3 卷 (第 4期 )年輕細(xì)胞， 55 代齡以上為衰老細(xì)胞，在 31 至 54 代齡之問位中年細(xì)胞 )。然后用有機(jī)法提取細(xì)胞 dna，取各組 dna 各 llxg 加入 sinai約 40u， 25c 酶切過夜 (smai 不具備甲基化修飾作用 )。然后對(duì) p16基因外顯子 i 及 13-actin 進(jìn)行 pcr 擴(kuò)增。 ll 二 | 。 _ llll | _ _⋯；一 _l l _ _l _li _l il 、 l i、 4 _ li 0_ _l年輕細(xì)胞中年 j 田胞老年細(xì)胞圍 1 不同代齡 2bs 細(xì)胞 p16 外顯于 pcr擴(kuò)增條帶的吸光度掃描值【 。寰 1 不同代齡 2bs 細(xì)胞 pl6 外丑于 l殛 i-actinpcr 擴(kuò)增條帶的吸光度掃描值組別 n 灃： #以 b actin的值校正后結(jié)果； t 檢 驗(yàn)，與年輕細(xì)胞相比， p<；o 05 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 (參見表 1)表明，不同代齡 2bs 細(xì)胞 p16 基因外顯子 i 上的擴(kuò)增產(chǎn)物均低于相對(duì)的未酶切的 b actin 對(duì)照組，且其 dna 甲基化水平隨代齡的增加而趨于降低，在年輕細(xì)胞中甲基化水平約為 64而在衰老細(xì)胞中僅為 24，降低約 40。在之后的研究中，陳培利等在以 2bs為模型的衰老研究中發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞分裂一次端區(qū) (即端粒 )縮短 50bp，抑制 dna 甲基化則可導(dǎo)致細(xì)胞早衰。 ⋯；】他們測(cè)定了去甲基化處理后的 2bs 細(xì)胞的端區(qū)長(zhǎng)度研究表明老年 2bs 細(xì)胞衰老表型更加明顯，端區(qū)長(zhǎng)度較對(duì)照細(xì)胞縮短，而年輕細(xì)胞則變化不 顯著。從而推斷甲基化的改變可以影響染色質(zhì)的構(gòu)象，從而可能改變端區(qū)結(jié)合蛋白與 dna 的作用 l1 1，后者可以進(jìn)一步引起端區(qū)長(zhǎng)度改變。三、 dna 甲基化檢測(cè)方法隨著對(duì)甲基化研究的不斷深入，各種各樣甲基化檢測(cè)方法被開發(fā)出來以滿足不同類型研究的要求。 dna 甲基化可以從甲基化含量、甲基化水平、甲基化模式和甲基化圖譜分析等多種途徑進(jìn)行分析。甲基化含量分析 5mc 在基因組中所占的總體比例：甲基化水 2 1 8 6 4 2 0l n n 瓔輟 越法律與醫(yī)學(xué)雜志 2006 年第 13 卷 (第 4 期 )平分析單個(gè) cpg 胞嘧啶甲基化的發(fā)生率，若同時(shí) 分析多個(gè) cpg 位點(diǎn)，則可以制作甲基化水平圖譜；甲基化模式分析一段單鏈 dna 上一組 cpg的甲基化狀態(tài)組合。根據(jù)研究目的，甲基化檢測(cè)方法分為：基因組整體水平的甲基化檢測(cè)，特異位點(diǎn)甲基化的檢測(cè)和尋找新甲基化位點(diǎn)。從研究所用的處理方法不同分為：基于 pcr 的甲基化分析方法；基于限制性內(nèi)切酶的甲基化分析方法；基于重亞硫酸鹽的分析方法和層析法等。 31以下歸納總結(jié)了主要的甲基化分析方法以及相關(guān)特性。 (一 )基因組整體水平甲基化分析高效液相色譜柱 (hplc)及相關(guān)方法。 hplc是一種比較傳統(tǒng)的方法，能夠定量測(cè)定基因組整體水平 dna 甲基化水平。它由 kuo 等 1980 年 131 首次報(bào)道。過程是將 dna 樣品先經(jīng)鹽酸或氫氟酸水解成堿基，水解產(chǎn)物通過色譜柱，結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)品比較，用紫外光測(cè)定吸收峰值及其量，計(jì)算 5mc (5mc+5c)的積分面積就得到基因組整體的甲基化水平。 oefner 等 1992 年提出變性高效液相色譜法 (dhplc)用于分析單核苷酸和 dna 分子。鄧大君等 2001 年 i141 將其改進(jìn)與 pcr 聯(lián)用建：立了一種檢測(cè)甲基化程度的 dhplc 分析方法。將重亞硫酸鹽處理后的產(chǎn)物進(jìn)行差異性擴(kuò)增。由于原甲基化的在重亞硫酸鹽處理時(shí)仍被保留為胞嘧啶， 因此原甲基化的在 pcr 擴(kuò)增時(shí)，其變性溫度也相應(yīng)上升。使 pcr 產(chǎn)物在色譜柱中保留的時(shí)間明顯延長(zhǎng)這樣就可以測(cè)定出 pcr 產(chǎn)物中甲基化的情況。這種方法的最明顯優(yōu)點(diǎn)是：可用于高通量混合樣本檢測(cè)能夠明確顯示目的片段中所有cpg 位點(diǎn)甲基化的情況但不能對(duì)甲基化的 cpg 位點(diǎn)進(jìn)行定位。其他基因組水平甲基化分析還有 sssi 甲基轉(zhuǎn)移酶法，免疫化學(xué)法，氯乙醛法等。各具優(yōu)缺點(diǎn)。 (二 )特異性位點(diǎn)的 dna 甲基化的檢測(cè) 1甲基化敏感性限制性內(nèi)切酶 (ms re pcr southern)法這種方法利用甲基化敏感性限制性內(nèi)切酶對(duì)甲基化區(qū) 的不切割的特性將 dna 消化為不同大小的片段后再進(jìn)行分析。 這是一種經(jīng)典的甲基化研究方法，其優(yōu)點(diǎn)是：相對(duì)簡(jiǎn)單，成本低廉，甲基化位點(diǎn)明確，實(shí)驗(yàn)結(jié)果易解釋；2甲基化特異性的 pcr(ms pcr)herman 等 161 1996 年在使用重亞硫酸鹽處理的基礎(chǔ)上新建的一種方法。它將 dna 先用重亞硫酸鹽處理。這樣未甲基化的胞嘧啶轉(zhuǎn)變?yōu)槟蜞奏?，而甲基化的不變。隨后行引物特異性的 pcr。檢測(cè) msp 擴(kuò)增產(chǎn)物如果用針對(duì)處理后甲基化 dna鏈的引物能擴(kuò)增 287 出片段，則說明該被檢測(cè)的位點(diǎn)存在甲基化；若用針對(duì)處理后的非甲 基化 dna 鏈的引物擴(kuò)增出片段則說明被檢測(cè)的位點(diǎn)不存在甲基化 (見圖 2)。 1517 5 衄 _{；2 盈_ 平 盈 3 5-啪 _曩墨 |_唧 h _霉疊 _甲 3 _ p1 m ri 一 一圖 2 甲基特異性的 pcr 擴(kuò)增 (ms pcr)示意 i 莩 i。 dna 經(jīng)重亞硫酸鹽處理后。以處理后的產(chǎn)物作為模板加入甲基化特異性的引物(primer 1)或非甲基化的引物 (primer) 進(jìn)行特異性的擴(kuò)增 (如圖所示 )，只有結(jié)合完全的甲基化或非甲基化特異性引物的片段才能擴(kuò)增出產(chǎn)物。 1s,1(三 )尋找新甲基化 位點(diǎn) 1限制性標(biāo)記基因組掃描(rlgs)costello 等 2000 年報(bào)道的 rlgs 81 能對(duì)整個(gè)基因組的甲基化狀態(tài)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)新甲基化基因的方法。這種方法聯(lián)合使用了限制性內(nèi)切酶及二維電泳。其過程是：先用甲基化敏感的稀頻限制性內(nèi)切酶 noti 消化基因組 dna，甲基化位點(diǎn)保留，標(biāo)記末端、切割、行一維電泳，隨后再用更高頻的甲基化不敏感的內(nèi)切酶切割。行二維電泳，這樣甲基化的部分被切割開并在電泳時(shí)顯帶，得到 rlgs 圖譜與正常對(duì)照得出缺失條帶即為甲基化的可能部位。 2聯(lián)合甲基化敏感性限制性內(nèi)切酶的 mb(com pare ms)srinivasan yegnasubramaniant 91 2006 年報(bào)道了一種新方法 compare ms該法將 mbd 柱層析法與 ms re 聯(lián)用。互補(bǔ)了各自單用的弊處，能夠快速、敏感的檢測(cè) dna 甲基化情況 (見圖 3)。 19j 四、甲基化型分析的優(yōu)勢(shì)以及存在的問題 (一 )甲基化作為檢測(cè)對(duì)象的優(yōu)勢(shì) 1甲基化型既能反映有關(guān)基因功能狀態(tài)及與此相連的多種疾病相關(guān)的豐富信息。叉具有簡(jiǎn)單的 “ 二元化 ” 性質(zhì)，即令甲基化為 “0” ，非甲基化為 “1” ，就可以進(jìn)行數(shù)字化處理，便于開展大規(guī)模和自動(dòng)化監(jiān)測(cè)分析。 2 dna分子十 分穩(wěn)定。有可能將它和 dna的 snp分析等置于同一個(gè)技術(shù)平臺(tái)。同時(shí)它又比 rna 和蛋白質(zhì)更便于保存和運(yùn)輸。并可對(duì)已經(jīng)石蠟、甲醛或乙醇預(yù) 288 _f 簟 圖 3 聯(lián)臺(tái)甲基化敏豫性限制性內(nèi)切酶的 mbd (compare-ms)示意圍。用甲基化以外的位點(diǎn)的內(nèi)切酶 ia 酶 )與甲基化敏雅的內(nèi)切酶 (b 酶 )聯(lián)用則甲基化的 dna 鏈不被切開。非甲基化的切開再行 mbd 捕獲存在甲基化位點(diǎn)的 dna 片段。最后行實(shí)時(shí) pcr 擴(kuò)增并分析。 f 刪處理的樣本進(jìn)行分析，可以開發(fā)歷史上儲(chǔ)備的病理學(xué)資料。 (二 )存在的問題目前還未找到 dna 甲基化 改變與年齡之間的精確的量化關(guān)系式。雖然人們對(duì)個(gè)體細(xì)胞的衰老及其基因甲基化水平的改變有了初步的了解但還在研究探索二者之問的精確的量化關(guān)系。 201 對(duì)使用 dna 甲基化改變來推斷個(gè)體年齡的大小，仍需要進(jìn)行大量的研究和調(diào)查。 (三 )付諸于實(shí)踐之前還必須解決的問題1確定表觀遺傳修飾與特定生理指標(biāo)的相關(guān)性： 2 證實(shí)將這些指標(biāo)作為鑒別診斷的潛在可能性和技術(shù)可行性： 3通過一定規(guī)模的流行病學(xué)調(diào)查來驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)室內(nèi)的表觀遺傳生理及病理發(fā)現(xiàn)在人群中的真實(shí)性。五、 dna 甲基化在法醫(yī)學(xué)中判定個(gè)體年齡上的展望目前，研究dna 甲基化水平改 變與個(gè)體年齡的相關(guān)性尚處于試驗(yàn)階段，但已引起許多學(xué)者的關(guān)注。人類表觀基因組協(xié)會(huì) (human epigenome con sortium， hec)于 2003 年 1o 月正式宣布開始投資和實(shí)施人類表觀基因組計(jì)劃 (human epigenome project， hep)。 dna 甲基化已經(jīng)成為表觀遺傳學(xué)和表觀基因組學(xué)的重要研究?jī)?nèi)容， hep 的最終目標(biāo)是就要確認(rèn)這些 dna 甲基化位點(diǎn)在人類基因組的分布與頻率，以指導(dǎo)和系統(tǒng)研究 dna 甲基化在人類表觀遺傳、胚胎發(fā)育、基因印記等發(fā)揮的作用。 借助于該計(jì)劃的實(shí)施和分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展 ，在法醫(yī)實(shí)踐中可以通過調(diào)查各年齡段人群基因組 dna 甲基化分布以及相關(guān)頻率，建立相關(guān)統(tǒng)計(jì)學(xué)模型，將來有望成為法醫(yī)個(gè)體年齡判定的一項(xiàng)重要的生物學(xué)指標(biāo)。 (感謝西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附法律與醫(yī)學(xué)雜志 2006 年第 l3 卷 (第 4 期 )屬醫(yī)院婦產(chǎn)科、環(huán)境與疾病相關(guān)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室鄭鵬生教授和顧婷婷同學(xué)的支持和幫助。 )參考文獻(xiàn)【 1 j 馬宏，張宗玉，童坦君衰老的生物學(xué)標(biāo)志 j】生理科學(xué)進(jìn)展， 2002， 33：65 692】陳朝飛，房靜遠(yuǎn)衰老的表觀遺傳修飾研究 j】上海醫(yī)學(xué)， 2006， 29(1)： 58 60【 3】 dahlc，guldbergp dnamethylationanalysistechniquesj】 biogerontology， 2003， 4(4)： 233250【 4 bird a p cpg rich islands and the function ofdna methylationj nature， 1986， 321： 209231【 5 j depamphilis ml， zorbas h identifying 5 一 methyic 08ine and relatedmodifications in dna genomesj】 nucleic acids res 1998， 26(10)： 2255 22646】 黃慶，郭穎，府偉靈人類表觀基因組計(jì)劃 jj生命的化學(xué)， 2004， 24(2)： 1011027】董玉瑋，侯進(jìn)慧，朱必才，等表觀遺傳學(xué)的相關(guān)概念和研究進(jìn)展叨生命的化學(xué)， 2005， 22(1)： 138】 feinberg a p， tycko b the history of cancer epigenetic nat revcancer， 2004， 4(2)： l43-1539】李素婷 真核生物 dna 甲基化狀態(tài) 河北醫(yī)學(xué)， 1999， 5： 85-881o】 陳培利，童坦君，張宗玉 dna 甲基化塒基因表達(dá)的影響及其在衰老過程中的表現(xiàn) 同外醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)分冊(cè)， 2000， 22： 155168il】毛澤斌，張宗 ，童坦軍 dna 去甲基化對(duì)細(xì)胞衰老的影響【 j1l 生物化學(xué)雜志， l997， l3(3)： 318 32l12】 lustig aj， kurtz s， shore d involvement of the silencer and usabinding protein rap1 in regulation of telomere lengthj】 science， l 990 250：54955313】 kuo k c， mcc