鏈霉素發(fā)酵工藝驗證方案要點.doc

鏈霉素發(fā)酵工藝驗證方案1. 目的：確認(rèn)鏈霉素發(fā)酵系統(tǒng)工藝流程，確認(rèn)種子工藝、小小罐工藝、小罐工藝、中罐工藝、大罐發(fā)酵工藝，驗證該發(fā)酵系統(tǒng)工藝的穩(wěn)定性和可靠性及制備 的發(fā)酵液能否達到中間體規(guī)格要求。2. 范圍：此方案包括一個50噸大罐鏈霉素發(fā)酵液的生產(chǎn)過程。2.1 驗證地點：403車間發(fā)酵工段：2.2 驗證對象：2.2.1 原斜面2.2.2 代1、代2斜面2.2.3 母瓶2.2.4 子瓶2.2.5 小小罐2.2.6 小罐2.2.7 中罐2.2.8 大罐2.3 驗證步驟：確定驗證方案，確定驗證計劃，內(nèi)容、步驟，以便準(zhǔn)確驗證鏈霉素發(fā)酵系統(tǒng)。3. 驗證措施概要：3.1 生產(chǎn)記錄：原斜面：冷藏期10天外觀無菌外觀集落:白色豐滿、正常代1或代2斜面：冷藏期14天外觀無菌外觀集落：白色豐滿、正常母瓶：無菌斜面及外觀無菌菌絲粘稠、色澤米黃、無顆粒狀菌絲效價68小時1700u/ml效價96小時3500u/ml效價120小時6700u/ml冷藏期5天菌齡5064小時菌絲IIIII子瓶：無菌斜面及外觀無菌菌絲粘稠、色澤米黃、無顆粒狀菌絲效價120小時7000u/ml效價144小時7500u/ml冷藏期7天菌齡3044小時菌絲IIIII小小罐：菌絲IIIII鏡檢無菌放罐效價800u/ml，殘C3.5g/100ml，殘N140mg/100ml，PH7.5小罐：菌絲IIIII鏡檢無菌放罐效價1200u/ml，殘C3.5g/100ml，殘N140mg/100ml，PH7.5中罐：菌絲IIIII鏡檢無菌放罐效價1800u/ml，殘C3.5g/100ml，殘N140mg/100ml，PH7.5大罐：放罐殘?zhí)?.0克/100毫升放罐殘氮120毫克/100毫升放罐透光度40%放罐效價14000u/ml3.2 原材料：生產(chǎn)過程中所用的各種原材料及其規(guī)格（見原材料一覽表）3.3 設(shè)備：生產(chǎn)鏈霉素所及設(shè)備見設(shè)備一覽表。3.4 以上所及設(shè)備的每一部分，必須在本次驗證前確保經(jīng)過適當(dāng)鑒定（IQ/OQ），并且任何相關(guān)的測試裝置經(jīng)過校正。3.5 人員培訓(xùn)，作為驗證研究的一部分，涉及生產(chǎn)鏈霉素發(fā)酵的每位職工均經(jīng)GMP及有關(guān)崗位SOP培訓(xùn)。4. 生產(chǎn)程序和流程表：4.1 生產(chǎn)過程的描述：4.1.1 我廠用于生物合成鏈霉素的生產(chǎn)菌種為灰色鏈霉菌，為了保持菌種的生命活力和穩(wěn)定性，將孢子保存于干燥的沙土內(nèi)冷藏在24冰庫內(nèi)，或者將孢子制成牛奶懸濁液，密閉冷藏于196液氮中。每年對生產(chǎn)菌株進行兩次自然分離，控制菌落變異率5%，并進行菌絲八代遺傳穩(wěn)定性考查，考查其母、子代謝及效價單位的穩(wěn)定性。挖取清潔海灘細沙（不能污染各種有機物），用自來水漂洗清潔，洗至漂出來的水澄清不渾濁為止，烘干、100目篩子過篩，用磁鐵充分吸盡砂內(nèi)鐵屑備用，挖取郊區(qū)地面二尺深處的黃土（不能污染各種有機物），用自來水充分漂洗消毒，洗至漂出來的水澄清為止，烘干，120目篩子過篩,用磁鐵充分吸盡土內(nèi)鐵屑備用。以上處理的砂和土，按土一份，砂二份比例混合，分裝于玻璃試管（12100mm），每支裝1g，用紗布棉塞塞緊置于小銅線筐中，放消毒鍋消毒，間歇滅菌三次，每次壓力0.12MPa，溫度122，時間1小時，消毒后置電烘箱烘干，110120、45小時，外表明批號、日期備用，使用前為確保無菌起見，應(yīng)按以上要求再消毒烘干一次。取符合質(zhì)量要求的孢子斜面一支，在無菌操作下,加入0.85%氯化鈉無菌生理鹽水1ml左右，用1#棒將表面孢子輕輕刮下（防止用力過重劃破瓊脂）搖勻，用1ml割頭無菌吸管吸出，準(zhǔn)確仔細地在每支無菌空白砂土管內(nèi)加0.1ml孢子液（加入時應(yīng)注意將吸管伸至接近沙土處，但又不能接觸沙土，也不能使吸管口接觸沙土管口及內(nèi)壁）。塞緊棉塞，將沙土敲松攤開，放在真空干燥器內(nèi)（干燥器內(nèi)放置氯化鈣干燥劑）保持真空度0.10MPa，抽4支時維持抽干4小時，抽5支或以上時，抽干時間酌情增加，取出抽干的沙土孢子，敲松放在盛有無水氯化鈣的廣口瓶中蓋緊密封，放24冰庫中保存?zhèn)溆?。使用時采用干接法接種。孢子沙土管有效使用期為2年。市售新鮮牛奶離心三次，3000rpm,15分鐘棄去上層脂肪,將脫脂牛奶置試管內(nèi)115117，0.07MPa，1520分鐘消毒。將空白安培管洗凈烘干，塞好棉花，置于消毒鍋內(nèi)121，60分鐘，間隙滅菌三次，待用。取符合質(zhì)量要求的孢子斜面一支，加入無菌脫脂牛奶510ml，用2#棒輕輕將孢子刮下，用無菌吸管吸孢子牛奶懸濁液置滅菌珠子瓶，振搖10分鐘,然后用1ml 無菌吸管將珠子瓶內(nèi)的孢子牛奶懸濁液加入無菌安培管中，0.3ml/支，做好標(biāo)記存置于液氮中保存，存放有效期5年。4.1.2 種子組潔凈工作臺潔凈等級100級，每三個月對塵埃粒子（0.5u的塵埃3.5粒/1L空氣）、風(fēng)速（0.35m/s）、無菌（定點開啟雙碟30分鐘1個/碟）進行測定。平時每次操作定點放置定點開啟雙碟30分鐘，控制雜菌菌落1個/碟。每天用前紫外光消毒一小時，每三個月調(diào)換消毒劑（1/600潔爾滅、75%酒精）。4.1.3 孢子斜面：取生產(chǎn)用之孢子沙土管或孢子冷凍管在無菌室內(nèi)，用操作棒勺取適量孢子接種于斜面培養(yǎng)基上，盡量將孢子涂開使長單個集落，然后于271恒溫室內(nèi)培養(yǎng)67天，該生長成之孢子斜面稱為原斜面，僅作孢子傳代使用，不能制備母瓶，液氮冷凍孢子接出原斜面。根據(jù)質(zhì)量情況可酌量考慮制作母瓶，有效使用期在24冷藏中不超過10天。斜面外觀除了個別不正常集落以外，應(yīng)大部份為白色，豐滿梅花型，饅頭型、圓型之集落，將原斜面孢子，挑選23只正常集落點種第一代，用第一代傳代斜面同樣點種第二代傳代斜面，第一第二代孢子斜面，培養(yǎng)條件均為27l恒溫室內(nèi)培養(yǎng)67天，第一、第二代斜面有效使用期為14天，均可制作母瓶，孢子斜面?zhèn)鞯降诙鸀橹梗辉賯鞯谌?，挖塊制作過母瓶之剩余孢子斜面，應(yīng)保留在冷藏庫中一個月，以備檢用。斜面培養(yǎng)基配制法：名稱配比 %葡萄糖（注射用）0.81.2蛋白胨0.30.6氯化鈉0.40.6豌豆浸出液1216瓊脂（海燕牌）2.02.8pH7.07.4消后規(guī)格:C (g/100ml)0.9-1.2N (mg/100ml)32-38P (ug/ml)60-90pH6.8-7.5豌豆浸出液制備：豌 豆： 30克氯 仿： 0.5%（二次）自來水： 加至1000ml1M H2SO4：調(diào)pH用將30克豌豆洗凈瀝干，加入1000ml自來水，用1M H2SO4，調(diào) pH至4.24.5，加 0.5氯仿、蓋上磨 砂瓶塞，振蕩搖勻后，放出氣體，再蓋緊放置于 37恒溫室一晝夜取出，再用 1MH2SO4調(diào)節(jié)PH值維持在 4.24.5，加 0.5%氯仿?lián)u勻、蓋緊放 371 恒溫室 6天，粗濾除去豌豆，濾液分盛于開口的搪瓷杯中，置沸水浴中，煮沸20分鐘（去除氯仿）冷卻，用濾紙過濾，去除沉淀的蛋白質(zhì)、分裝于 750ml搖瓶中，每瓶裝量約200ml左右，以 0.09Mpa、118120的條件消毒 20分鐘，冷卻后放入冰箱中備用。同時抽樣送化驗，檢驗質(zhì)量，在使用該批豌豆浸出液時，必須再送一次樣品，測定氨氮含量與第一次相接近時可按后一次樣含量計算使用，如第二次含量與第一次不符，須再抽樣復(fù)試，以最后一次化驗數(shù)據(jù)為準(zhǔn)進行計算使用。豌豆浸出液質(zhì)量：項目規(guī)格外觀澄清液氨氮（NH2-N）170200mg/100ml磷(PO4)600ug/100ml左右無菌狀況無雜菌4.1.4 母瓶：用符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的同支孢子斜面（冷藏期不超過14天）在無菌室內(nèi)用挖塊法分別將孢子接種到已準(zhǔn)備好之二只搖瓶中，編號為母I母 II，接種后送至溫度 27l恒溫搖瓶間內(nèi)，在23020r mm搖瓶機上，培養(yǎng)5064小時，菌絲階段 II一III初之母I用牛皮紙包扎存放于24冷庫中，母II繼續(xù)培養(yǎng)作質(zhì)量檢查，做無菌試驗二支，分別進行27及37培養(yǎng)。68小時取樣分別測定單位粘度，氨氮消耗、PH、uml，以后每24小時取一次樣測定上述項目，共計三次（68小時，96小時，120小時三次）如母瓶質(zhì)量符合要求，則母瓶可以進罐使用，母瓶有效冷藏期為5天。制得的母瓶應(yīng)菌絲稠粘，目檢無菌絲團顆粒、米黃色、無異味不化稀無菌正常。效價：120小時6700uml。接子瓶的母瓶制備法，用無菌操作挖一塊斜面，接入一只母瓶，在搖瓶機上培養(yǎng)5064小時，取下，挑選外觀正常菌絲粘稠，色澤米黃，無顆粒狀菌絲的母瓶，作為接子瓶用，接種子瓶的母瓶不冷藏。遇特殊情況，一般冷藏不超過5天。母瓶原材料及配比如下：原材料配比%葡萄糖3.55.5黃豆餅粉3.04.5碳酸鈣0.50.8硫酸銨0.50.8氯化鈉0.250.5磷酸二氫鉀0.040.07消后質(zhì)量規(guī)格：C (g/ml)3.84.8N (mg/100ml)130155P (ug/100ml)1301554.1.4 子瓶：取符合種子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)之母瓶，在無菌操作條件下，用吸管接入已準(zhǔn)備好的子瓶培養(yǎng)基中，每瓶接種量約3ml，瓶數(shù)按需而定（母瓶接子瓶前做無菌試驗斜面二支，分別培養(yǎng)于27，37恒溫室，母瓶接子瓶后，吸管做無菌試驗斜面一支，在37恒溫室培養(yǎng)），接種后子瓶送27l恒溫室培養(yǎng)3044小時，菌絲階段在IIIII初，長好后，留五瓶繼續(xù)培養(yǎng)，作質(zhì)量分析，其中三瓶在120及144小時分別取樣測定效價，一瓶測粘度及氨氮，一瓶接無菌斜面二支作無菌試驗（分別培養(yǎng)于27，37恒溫室）及觀察菌絲形態(tài)，（新菌株要加測C及PH）其他瓶冷藏于24冰庫中備用有效冷藏期為7天，如在保存期間發(fā)現(xiàn)有化稀現(xiàn)象或有染菌嫌疑，即停止使用，改用其他批號種子，放搖瓶種子應(yīng)同時準(zhǔn)備有23批瓶存?zhèn)溆谩Ｖ频玫淖悠繎?yīng)菌絲稠粘，目檢無菌絲團顆粒，米黃色，無異味。不化?。ū饶钙亢瘢Ｐr：120小時7000u ml，144小時7500u ml。子瓶原材料及配比如下：原材料配比%葡萄糖3.55.5黃豆餅粉2.33.5碳酸鈣0.20.7硫酸銨0.50.7氯化鈉00.2磷酸二氫鉀0.0450.07豆油1L玉米漿00.2消后質(zhì)量規(guī)格：C (g/ml)6.04.8N (mg/100ml)160180P (ug/100ml)1551804.1.5 小小罐：在某罐種子移植到下一級罐后，進行罐內(nèi)的沖洗及閥墊的更換檢查嚴(yán)密度，檢查部分包括空氣分布管，攪拌軸封，與罐相連之法蘭焊接及閥門等，如遇染菌罐則注明下次空消延長15分鐘并檢查過濾器有無培養(yǎng)基倒流。培養(yǎng)基實行實消：空消時預(yù)熱至壓力達到0.160.19MPa。排出罐內(nèi)冷凝水后計空消時間為1545分鐘，溫度為125130，空消時間到后壓力跌0MPa進行投料實消。先加水至攪拌處，然后投入已配好的培養(yǎng)基，攪拌成勻漿狀加熱，打開各支路蒸汽，關(guān)閉罐蓋待壓力上升至0.070.12MPa時計時20分鐘左右，消毒溫度為115124，結(jié)束后保壓冷卻待接種，取消后樣測定C、N、P、PH。小小罐采用搖瓶28瓶火焰接種，加空氣流量至0.1m3分，5小時流量加至0.5m3分，一只小小罐種子可移入23只小罐作種子用。接后開始每4小時取無菌樣，每8小時測PH和菌絲濃放罐測C和效價，25小時左右始每8小時測N，種子罐移種標(biāo)準(zhǔn)菌絲呈II一III初階段，無菌，接種前2小時須將種液涂片鏡檢什菌狀況，培養(yǎng)條件：271，35030rmin，4668h，0.5m3/分，若種子罐生長過程中遇代謝過快時可適時降溫培養(yǎng)，遇代謝慢種子罐pH上升，可減少通氣量，調(diào)節(jié)配方等工藝調(diào)節(jié)措施，以期使各級種子罐質(zhì)量符合種子質(zhì)量要求。小小罐原材料及配比如下：原材料名稱小小罐（120L）配比小小罐(500L)配比葡萄糖3.55.54.55.5黃豆餅粉2.53.52.53.5硫酸銨0.50.70.50.7碳酸鈣0.20.70.20.7磷酸二氫鉀0.0450.070.050.07玉米漿0.10.2(機動)0.10.2(機動)豆油1L/罐批1L/罐批氯化鈉0.10.20.10.2配料體積100L250L消后體積100L250L消后規(guī)格如下pH消后C消后N消后P小小罐6.08.02.84.4115170120200小小罐控制規(guī)格：（1）消后CNP必須符合質(zhì)量要求，若不符合則重新投料、消毒。（2）中間控制溫度必須在271，超過30時間較長則不能作為種子。（3）染菌罐不能作種子用。（4）氨氮在中間代謝中必須逐漸利用，若后期回升則不作種子用。（5）放罐控制：殘?zhí)?.5g/100ml，殘氮140mg/100ml，PH7.5，效價800uml。（6）菌齡必須以控制菌絲階段 IIIII初為主。（7）接種量母瓶必須2瓶以上，子瓶3瓶以上。4.1.6 小罐：在某罐種子移植到下一級罐后，進行罐內(nèi)的沖洗及閥墊的更換，檢查嚴(yán)密度，檢查部分包括空氣分布管，攪拌軸封，與罐相連之法蘭焊接及閥門等，如遇染菌則注明下次空消延長15分鐘并檢查過濾器有無培養(yǎng)基倒流。培養(yǎng)基實行連消：經(jīng)清洗，檢查嚴(yán)密后的罐批方可進行空消，空消時罐予熱至壓力達到0.160.19MPa時，排出罐內(nèi)冷凝水后再開始計算空消時間，一般為4045分鐘，溫度為125130之間，待空罐消毒罐壓維持在0.080.1MPa時導(dǎo)入無菌空氣保壓，即可進入連消狀態(tài)。連消時總蒸汽壓力不低于0.25MPa，按生產(chǎn)進度把各類罐空消完畢，同時各所用管路也必須經(jīng)蒸汽消毒，壓力0.20.25MPa，45分鐘后可進入連消連消時通過泵把培養(yǎng)基輸入消毒維持罐，連消條件為0.2MPa，126135、56噸h。消入罐中，冷卻培養(yǎng)基至近培養(yǎng)溫度，保壓待接種，取消后樣測C、N、P、PH。培養(yǎng)基實行實消：空消時預(yù)熱至壓力達到0.160.19MPa。排出罐內(nèi)冷凝水后計空消時間為1545分鐘，溫度為125130，空消時間到后壓力跌0MPa進行投料實消。則先加水至攪拌處，然后投入已配好的培養(yǎng)基，攪拌成勻漿狀加熱。打開各支路蒸汽，關(guān)閉罐蓋待壓力上升至0.070.12MPa時計時2025分鐘，消毒溫度為115124，結(jié)束后保壓冷卻待接種，取消后樣測定C、N、P、PH。小罐可用搖瓶火焰接種，68瓶或小小罐種子移入種子，或小罐移入種子，接種后加流量至0.2m3分，5小時以后流量加至lm3分，一只小罐種子通常移入一只中罐，特殊情況時一只小罐種子可移入二只中罐。接后開始每4小時取無菌樣，每8小時測PH和菌絲濃放罐測C和效價，25小時左右始每8小時測N，種子罐移種標(biāo)準(zhǔn)菌絲呈IIIII初階段，無菌，接種前2小時須將種液涂片鏡檢什菌狀況，培養(yǎng)條件：271，33020rmin，4060h，1m3/分。若種子罐生長過程中遇代謝過快時可適時降溫培養(yǎng)，遇代謝慢種子罐PH上升，可減少通氣量，調(diào)節(jié)配方等工藝調(diào)節(jié)措施，以期使各級種子罐質(zhì)量符合種子質(zhì)量要求。小罐原材料及配比如下：原材料名稱小罐(500L)配比葡萄糖4.55.5黃豆餅粉2.53.5硫酸銨0.50.7碳酸鈣0.20.7磷酸二氫鉀0.050.07玉米漿0.10.2(機動)豆油1L/罐批氯化鈉0.10.2配料體積250L消后體積250L消后質(zhì)量規(guī)格如下：pH消后C消后N消后P小 罐6.08.03.55.5120180130190接后體積200300L小罐控制規(guī)格：（1）消后CNP必須符合質(zhì)量要求，若不符合（指差距較大）；在接種前必須糾正。（2）中間控制溫度必須在271。（3）染菌罐不能作種子用。（4）放罐控制：殘?zhí)?.5g/100ml，殘氮140mg/100ml，PH7.5，效價1200uml。（5）菌齡必須以控制菌絲階段 IIIII初為主，一般在4048小時。（6）中間代謝中，氨氮必須逐步利用。（7）一只小小罐最好接2只小罐。（8）一只小小罐可全部接入中罐作種子用。4.1.7 中罐：在某罐種子移植到下一級罐后，進行罐內(nèi)的沖洗及閥墊的更換，檢查嚴(yán)密度，檢查部分包括空氣分布管，攪拌軸封，與罐相連之法蘭焊接及閥門等，如遇染菌罐則注明下次空消延長15分鐘并檢查過濾器有無培養(yǎng)基倒流。培養(yǎng)基實行連消： 經(jīng)清洗，檢查嚴(yán)密后的罐批方可進行空消，空消時罐予熱至壓力達到0.160.19MPa時，排出罐內(nèi)冷凝水后再開始計算空消時間，一般為4045分鐘，溫度為125130之間，待空罐消毒罐壓維持在0.080.1MPa時導(dǎo)入無菌空氣保壓，即可進入連消狀態(tài)。連消時總蒸汽壓力不低于0.25MPa， 按生產(chǎn)進度把各類罐空消完畢，同時各所用管路也必須經(jīng)蒸汽消毒，壓力0.20.25MPa，45分鐘后可進入連消，連消時通過泵把培養(yǎng)基輸入消毒維持罐，連消條件為0.2MPa，126135、56 噸h。消入罐中，冷卻培養(yǎng)基至近培養(yǎng)溫度，保壓待接種，取消后樣測C、N、P、PH。中罐由小罐移入種子（或整只小小罐移入），開始加空氣流量，前5小時微量，以后逐步遞加流量至360m3h，每二只中罐可移入一只大罐。各級罐壓出種子前均先用被接種罐內(nèi)培養(yǎng)基壓到壓出罐接種管進行冷卻管道，防止?fàn)C傷種子。接后開始每4小時取無菌樣，每8小時測PH和菌絲濃放罐測C和效價，25小時左右始每8小時測N，種子罐移種標(biāo)準(zhǔn)菌絲呈IIIII初階段，無菌，接種前2小時須將種子液涂片鏡檢什菌狀況。培養(yǎng)條件：271，18020rmin，3560h，6 m3/分，若種子罐生長過程中遇代謝過快時可適時降溫培養(yǎng)，遇代謝慢種子罐PH上升，可減少通氣量，調(diào)節(jié)配方等工藝調(diào)節(jié)措施，以期使各級種子罐質(zhì)量符合種子質(zhì)量要求。中罐原材料及配比如下表：原材料配比 %葡萄糖4.55.5黃豆餅粉2.53.5硫酸銨0.50.7氯化鈉0.102(機動)碳酸鈣0.20.7玉米漿0.10.2(機動)豆油8L/罐硫酸二氫鉀0.050.07配料體積3.23.5M消后體積3.03.2M消后質(zhì)量規(guī)格如下：PH消 后 C(g/100ml)消后N (mg/100ml)消后 P (r/l)6.08.03.55.5120180130190接后體積2.53.5M3中罐控制規(guī)格：（1）消后CNP必須符合質(zhì)量要求，若不符合（指差距較大）在接種前必須采取措施糾正。（2）中間控制溫度必須在271，超過30時間較長則不能作為種子用。（3）染菌罐不能作種子用。（4）氨氮在中間代謝中必須逐漸利用。（5）菌齡必須以控制菌絲階段IIIII初為主，一般在3050小時。（6）接種量一只小罐接一只中罐，或一只小小罐可接一只中罐。（7）放罐控制：殘?zhí)?.5g/100ml，殘氮140mg/100ml，PH7.5，效價1800u ml。（8）小小罐、小罐、中罐遇到氨氮消耗快時可將罐溫調(diào)節(jié)到26 0. 5培養(yǎng)。4.1.8 大罐：4.1.8.1 大罐放罐后，降罐壓至零磅，開蓋用水沖洗，將沖洗后的殘留發(fā)酵液，壓入提煉承接桶內(nèi)，再打開罐蓋，進罐內(nèi)清除積垢后，檢查攪拌，空氣分布管，葉子及上下婆司是否松，同時進行閥墊及填料的更換和檢修工作。然后蓋好罐蓋，通入空氣，進行各連接處法蘭等、閥門、配根、罐蓋、氨水、空氣等嚴(yán)密度檢查。待檢查完畢后，蓋緊罐蓋、準(zhǔn)備下次空罐消毒。如遇染菌，可下去敲鏟，清除積垢，空消時延長消毒30分鐘。罐空消：依次打開罐的各路蒸汽，加熱至壓力 0.160.19MPa進行壓水后進行消毒45分鐘，結(jié)束后導(dǎo)入無菌空氣至0.080.1MPa保壓，若上一罐批染菌，則金屬過濾器進行消毒。發(fā)酵罐培養(yǎng)基消毒：發(fā)酵罐采用連消法消毒培養(yǎng)基，總蒸汽壓力不低于0.3MPa，用泵將已配制的氮源（餅粉等）碳源（糖水）依次分別進入消毒塔、維持罐消入發(fā)酵罐，維持罐壓力為0.2MPa維持時間5分種（殘余料維持8分鐘）?？刂葡舅囟仍?28133，流速控制在每小時1012噸。先消餅粉，后消糖水，二者可間隔消 2噸自來水，最后可酌情消入自來水補足體積。發(fā)酵罐原材料及配比如下：原材料配比黃豆餅粉1.82.2葡萄糖4.06.0硫酸銨0.20.7氯化鈉00.2碳酸鈣0.20.7磷酸二氫鉀0.060.09豆油1030L玉米漿0.10.2氯化鈷0.2配料體積3440M消后體積2537M消后質(zhì)量規(guī)格如下：pH消后C(g/100ml)消后N(mg/100ml)消后P(r/ml)大于6.24.56.5130160200260接后體積3040M3罐內(nèi)培養(yǎng)基的接受：當(dāng)培養(yǎng)基進入維持罐內(nèi)78分鐘后，通知關(guān)罐進氣及開排氣閥，控制罐壓004006MPa，開啟入罐閥接入培養(yǎng)基，當(dāng)培養(yǎng)基遇到蛇形管、即開冷卻水冷卻。當(dāng)接料完畢，關(guān)閉入罐閥，進空氣，保持罐壓008009MPa，待溫度冷至29準(zhǔn)備接種。消后測PH要求62以上，如低則加NaOH調(diào)節(jié)。接種前、接種后取樣測C、N、P、PH并做無菌測驗。4.1.8.2 發(fā)酵罐（大罐）接種和培養(yǎng)，發(fā)酵工藝。發(fā)酵罐接種：先提高中罐或倒種罐罐壓，在01MPa以上，保持發(fā)酵罐之接種罐罐壓為0.030.05MPa，打開接種入罐閥，種子罐（中罐或倒出發(fā)酵罐）菌液借壓力差流入發(fā)酵大罐內(nèi)，接完后關(guān)罐入罐閥，開入適量空氣流量在10m3分以上，保持罐壓0.050.06MPa，溫度29開始培養(yǎng)。發(fā)酵罐在接入種子前應(yīng)先將罐內(nèi)培養(yǎng)基壓到壓出種子罐接種管道進行管道冷卻，防止?fàn)C傷種子。4.1.8.3 發(fā)酵罐培養(yǎng)和工藝接種：發(fā)酵大罐由23只中罐接種一只大罐，也可由48110hr菌齡的發(fā)酵罐作種子接入一只大罐，種子體積在35t。各級罐壓出種子前均先用被接種罐罐內(nèi)培養(yǎng)基壓到接種罐進行冷卻管道，防止?fàn)C傷種子。種子罐移種標(biāo)準(zhǔn)菌絲呈IIIII初階段，無菌，接種前2小時須將種液涂片鏡檢什菌狀況.培養(yǎng)條件罐溫: 大罐罐溫在2630，一般控制在29，罐溫測定用電阻溫度計量來控制罐溫，前期代謝速度快可降溫2527培養(yǎng)，后期代謝慢的罐批可提高至30培養(yǎng)數(shù)小時至放罐。罐壓:大罐罐壓在0.020.05Mpa?？諝饬髁?大罐接種后開空氣流量在10m分以上，不開攪拌，以后逐級增加流量2530m/分，進入總過濾器前，空氣溫度4555。如遇發(fā)酵后期反應(yīng)激烈，可適當(dāng)降低空氣流量和提高罐壓。攪拌轉(zhuǎn)速:大罐正常轉(zhuǎn)速在 110120rmin，亦可根據(jù)生長代謝進行調(diào)速。前期罐按菌絲生長速度間歇開攪拌，菌絲濃度長至 70時，攪拌全開，中后期攪拌全開。培養(yǎng)時間:大罐培養(yǎng)時間為16010小時。中間取樣:大罐接后每8小時取無菌斜面2支、肉湯1支，每4小時測氨氮與pH，培養(yǎng)周期至20100小時每8小時測殘?zhí)牵?00小時后每24小時測殘?zhí)?，培養(yǎng)至40小時左右時每8小時測化學(xué)效價。放罐質(zhì)量:殘?zhí)?.0g/100ml，殘氮120mg/100ml，PH8.2，效價14000uml，透光度40%。發(fā)酵大罐中間控制消沫：前期或后期發(fā)酵劇烈時可少量多次加油，中期由于補糖量增加液面升高也可酌情加油，若加油無效可放提煉若干噸。補糖：補糖根據(jù)發(fā)酵液中殘?zhí)茄a入，從大罐培養(yǎng)3050小時可補第一次糖水、糖水濃度控制4060，每隔2030小時補一次，共補46次，遇反常罐可酌情減量補入。第一次控制殘?zhí)呛坎蛔悴糠萏砑又?4.85.2%第二次控制殘?zhí)呛?4.85.0%第三次控制殘?zhí)呛?4.04.5%第四次控制殘?zhí)呛?2.52.8%第五次控制殘?zhí)呛?1.72.0%特別情況一次補糖量3.0時以分二次補入為宜，第三、四、五次補糖按培養(yǎng)時間及放罐殘?zhí)强刂?.5以下計算補入量，若糖耗慢的罐批則第五次糖可以不補。后期控制補糖量應(yīng)與氮耗相調(diào)，防止發(fā)酵液化稀。補氮：補氮可用15的無菌過濾氨水或（NH4）2SO4來調(diào)節(jié)。通氨原則：（1）根據(jù)殘氮用量計算通氨量。（2）參考控氮水平。（3）參考代謝及濃度。培養(yǎng)到2040小時根據(jù)氨氮利用計算通氨量，并加氨水以調(diào)高發(fā)酵液pH，每隔4小時添加一次，補量35l次，若超35l可分次補入，每次通氨為流加，生長期最適pH為6.56.9，氨氮水平可在90120mg100ml，培養(yǎng)40小時菌絲進入分泌期，此時最適PH控制在6.87.2，控氮水平80100mg100ml，若pH超7.10可以適當(dāng)加（NH4）2SO4代替氨水，以調(diào)低pH，（NH4）2SO4 0.l20mg100ml NH2N）。硫酸氨控制補入量0.1，盡可能在140小時前補入，120小時到放罐適當(dāng)