分子生物學(xué)基礎(chǔ)知識(shí).docx

資料收集于網(wǎng)絡(luò) 如有侵權(quán)請(qǐng)聯(lián)系網(wǎng)站 刪除 謝謝 素材聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) PCR（生物學(xué)的聚合酶鏈反應(yīng)）一般指聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)是一種用于放大擴(kuò)增特定的DNA片段的分子生物學(xué)技術(shù)，它可看作是生物體外的特殊DNA復(fù)制，PCR的最大特點(diǎn)，是能將微量的DNA大幅增加。由1983年美國(guó)Mullis首先提出設(shè)想，1985年由其發(fā)明了聚合酶鏈反應(yīng)，即簡(jiǎn)易DNA擴(kuò)增法，意味著PCR技術(shù)的真正誕生。到如今2013年，PCR已發(fā)展到第三代技術(shù)。1973 年，臺(tái)籍科學(xué)家錢嘉韻，發(fā)現(xiàn)了穩(wěn)定的Taq DNA聚合酶，為PCR技術(shù)發(fā)展也做出了基礎(chǔ)性貢獻(xiàn)。PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）是利用DNA在體外攝氏95高溫時(shí)變性會(huì)變成單鏈，低溫（經(jīng)常是60C左右）時(shí)引物與單鏈按堿基互補(bǔ)配對(duì)的原則結(jié)合，再調(diào)溫度至DNA聚合酶最適反應(yīng)溫度（72C左右），DNA聚合酶沿著磷酸到五碳糖(5-3)的方向合成互補(bǔ)鏈。基于聚合酶制造的PCR儀實(shí)際就是一個(gè)溫控設(shè)備，能在變性溫度，復(fù)性溫度，延伸溫度之間很好地進(jìn)行控制。真核生物的啟動(dòng)子由于真核生物中有三種不同的RNA聚合酶，因此也有三種不同的啟動(dòng)子，其中以啟動(dòng)子最為復(fù)雜，它和原核的啟動(dòng)子有很多不同：（1）有多種元件：TATA框，GC框，CATT框，OCT等；（2）結(jié)構(gòu)不恒定。有的有多種框盒如組蛋白H2B；有的只有TATA框和GC框，如SV40早期轉(zhuǎn)錄蛋白，（3）它們的位置、序列、距離和方向都不完全相同，（4）有的有遠(yuǎn)距離的調(diào)控元件存在，如增強(qiáng)子；（5）這些元件常常起到控制轉(zhuǎn)錄效率和選擇起始位點(diǎn)的作用；（6）不直接和RNApol結(jié)合。轉(zhuǎn)錄時(shí)先和其它轉(zhuǎn)錄激活因子相結(jié)合，再和聚合酶結(jié)合。(一)類基因的啟動(dòng)子和調(diào)控區(qū)類基因的啟動(dòng)子由核心元件和上游元件組成。核心元件包括TATA框和轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)附近的啟始子（initiator，Inr）。亞克?。ㄓ⒄Z(yǔ)：subcloning）是一種分子生物學(xué)技術(shù)。亞克?。?subclone) 分為細(xì)胞克隆和分子克隆。該技術(shù)旨在將目的基因?qū)肽繕?biāo)載體中，以進(jìn)行進(jìn)一步研究。值得注意的是，亞克隆和分子克隆（molecular cloning）不是同一概念。在細(xì)胞克隆中，對(duì)培養(yǎng)的細(xì)胞來(lái)說(shuō)，從原有的克隆中，再篩選出具有某種特性的細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，就是亞克隆。在分子克隆中，從大片段的克隆中選取特定小片段再克隆。亞克隆就是初步克隆的外源片段往往較長(zhǎng)，含有許多目的基因片段以外的DNA片段，將目的基因所對(duì)應(yīng)的一小段DNA找出來(lái)。對(duì)已經(jīng)獲得的目的DNA片段進(jìn)行重新克隆，其目的在于對(duì)目的DNA進(jìn)行進(jìn)一步分析，或者進(jìn)行重組改造等。亞克隆的基本過(guò)程包括：(1)目的DNA片段和載體的制備；(2)目的DNA片段和載體的連接；(3)連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化；(4)重組子篩選。亞克隆技術(shù)：限制性內(nèi)切酶是一類能識(shí)別雙鏈DNA分子中特異核苷酸序列的DNA水解酶，該類酶是體外剪切基因片段的重要工具。首先，使用限制酶將目的基因切下。切下來(lái)的目的基因需經(jīng)過(guò)純化（常用手法是凝膠分離法）。之后，可以通過(guò)PCR來(lái)制造一定數(shù)量的該目的基因的拷貝。同時(shí)，需要用切割目的基因的那種限制酶切割載體，以讓載體產(chǎn)生與目的基因互補(bǔ)的黏性末端，以使得它們能在后續(xù)步驟中被DNA連接酶連接。磷酸酯酶（通常是小牛腸道堿性磷酸酶（CIAP）在該過(guò)程中也必不可少，因?yàn)樗芊乐馆d體的自身黏合。之后，再對(duì)目標(biāo)載體進(jìn)行分離/純化。接下來(lái)，將目的基因與載體混合，并添加DNA連接酶。通常，目的基因和載體的分子數(shù)之比設(shè)定為5比1或10比11（也有文獻(xiàn)認(rèn)為應(yīng)為3比12）。目的基因與載體的數(shù)量過(guò)量都會(huì)造成不利影響。另外，目的基因也不應(yīng)過(guò)長(zhǎng)。超過(guò)10kb（千堿基對(duì)）的話，目的基因?qū)㈦y以和載體有效結(jié)合。一般操作人員會(huì)把反應(yīng)容器放在冰上，讓反應(yīng)進(jìn)行一整晚促卵泡激素糖蛋白激素，多肽識(shí)別其他數(shù)據(jù)基因座11 p13促卵泡激素（英語(yǔ)：follicle-stimulating hormone, FSH，亦稱為卵泡刺激素）是一種由腦垂體合成并分泌的激素，屬于糖基化蛋白質(zhì)激素，因最早發(fā)現(xiàn)其對(duì)女性卵泡成熟的刺激作用而得名。后來(lái)的研究表明，促卵泡激素在男女兩性體內(nèi)都是很重要的激素之一，調(diào)控著發(fā)育、生長(zhǎng)、青春期性成熟、以及生殖相關(guān)的一系列生理過(guò)程。促卵泡激素和黃體化激素在生殖相關(guān)的生理過(guò)程中協(xié)同發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。結(jié)構(gòu)促卵泡激素是一種糖蛋白，活性形式是糖基化的異源二聚體，由和兩條多肽組成。黃體化激素，甲狀腺激素，人絨毛膜促性腺激素等糖蛋白激素采用了與促卵泡激素相似的結(jié)構(gòu)。它們共享同樣的亞基（含92位氨基酸殘基），而亞基則隨激素的不同而不同。促卵泡激素的亞基含有118位氨基酸殘基，負(fù)責(zé)與促卵泡激素受體的相互作用。促卵泡激素表面的糖基化涉及海藻糖、半乳糖、甘露糖、半乳糖胺、葡萄糖胺、以及硅鋁酸。其中，硅鋁酸與促卵泡激素的生物半衰期緊密相關(guān)。促卵泡激素的半衰期為3至4小時(shí)。促卵泡激素的分子量約為30000Da?；虼俾雅菁に貋喕幕蛭挥谌旧w6p21.1-23，在多種不同細(xì)胞中有表達(dá)；亞基的基因位于染色體11p13，在腦垂體細(xì)胞中表達(dá)，受促性腺激素釋放激素的控制，被抑制素所抑制，被激活素所增強(qiáng)。活性促卵泡激素調(diào)控人體的發(fā)育、生長(zhǎng)、青春期性成熟、以及生殖相關(guān)的一系列生理過(guò)程，特別是刺激生殖細(xì)胞的成熟。在女性體內(nèi)在卵巢中，促卵泡激素刺激尚未成熟的卵泡的生長(zhǎng)，直至成熟為格拉夫卵泡。卵泡在生長(zhǎng)過(guò)程中會(huì)釋放抑制素以阻斷促卵泡激素的進(jìn)一步合成。這一機(jī)制保證了排卵的選擇性。在黃體化階段的末尾，促卵泡激素水平也有小幅度提升，可能與下一個(gè)排卵周期的開(kāi)始有關(guān)。在男性體內(nèi)編輯在睪丸中，促卵泡激素提高塞爾托利氏細(xì)胞合成男性激素結(jié)合蛋白的水平，誘發(fā)塞爾托利細(xì)胞的緊密結(jié)合，同時(shí)分泌抑制素，在成精子過(guò)程中起到至關(guān)重要的作用。作用機(jī)理編輯促卵泡激素的目標(biāo)細(xì)胞表面表達(dá)有促卵泡激素受體，屬于G蛋白偶聯(lián)受體家族。促卵泡激素與其受體蛋白的結(jié)合將導(dǎo)致后者的構(gòu)象變化。作為跨細(xì)胞膜的膜蛋白，促卵泡激素受體胞外的變構(gòu)將引發(fā)胞內(nèi)的變構(gòu)，改變其與G蛋白的結(jié)合狀態(tài)，并通過(guò)其它蛋白的參與，進(jìn)一步誘發(fā)環(huán)磷酸腺苷等第二信使的生成，將信號(hào)傳至細(xì)胞核內(nèi)，實(shí)現(xiàn)對(duì)蛋白表達(dá)和細(xì)胞發(fā)育進(jìn)程的調(diào)節(jié)。相關(guān)疾病編輯促卵泡激素水平在兒童期較低，而在女性的更年期之后則很高。高促卵泡激素水平編輯促卵泡激素的高水平預(yù)示著性腺引發(fā)的限制性反饋(負(fù)反饋)缺失，導(dǎo)致腦垂體不斷合成促卵泡激素。這在女性接近或處于更年期時(shí)屬于正?，F(xiàn)象，但對(duì)于處于生育年齡的女性則是不正常的，可能是以下疾病的信號(hào)：過(guò)早絕經(jīng)也稱為卵巢早衰性腺障礙或Turner綜合征閹割斯外爾綜合征先天腎上腺增生的某些病例睪丸失效低促卵泡激素水平編輯促卵泡激素分泌水平的降低將導(dǎo)致性腺功能的缺失。在男性精子數(shù)量不足的病癥中尤為典型。在女性中表現(xiàn)為生育周期的停止，具體相關(guān)的疾病有:多卵囊巢綜合征，可能的體征有肥胖，多毛，不育等等；考曼綜合征下丘腦抑制癥垂體機(jī)能減退癥泌乳激素過(guò)多癥性腺功能低下癥正在接受性腺抑制治療使用促性腺激素釋放激素結(jié)抗劑使用促性腺激素釋放激素促進(jìn)劑（負(fù)調(diào)節(jié)）醫(yī)療應(yīng)用編輯促卵泡激素可在絕經(jīng)期女性的尿液中提取得到，也可以通過(guò)基因工程的方法重組表達(dá)得到。臨床用于對(duì)不育癥患者的治療，用以刺激卵泡的發(fā)育成熟，同時(shí)也用于體外人工受精和體內(nèi)人工受精的相關(guān)治療中。促卵泡激素受體FSHR 基因位于人的2號(hào)染色體上p21區(qū)，長(zhǎng)約2080個(gè)核苷酸調(diào)控序列（英語(yǔ)：Regulatory sequence，又譯調(diào)節(jié)序列）是DNA中一段包含啟動(dòng)子、增強(qiáng)子，以及其他可與調(diào)節(jié)蛋白，如轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的位置。這些序列調(diào)控了基因的表現(xiàn)，進(jìn)而影響蛋白質(zhì)的生產(chǎn)。除此之外，mRNA也有調(diào)控序列，可與RNA結(jié)合蛋白或其他RNA結(jié)合DNase I，即Deoxyribonuclease I，脫氧核糖核酸酶I，是一種可以消化單鏈或雙鏈DNA產(chǎn)生單脫氧核苷酸或單鏈或雙鏈的寡脫氧核苷酸的核酸內(nèi)切酶。DNase I水解單鏈或雙鏈DNA后的產(chǎn)物，5端為磷酸基團(tuán)，3端為羥基。 DNase I活性依賴于鈣離子，并能被鎂離子或二價(jià)錳離子激活。鎂離子存在條件下，DNase I可隨機(jī)剪切雙鏈DNA的任意位點(diǎn)；二價(jià)錳離子存在條件下，DNase I可在同一位點(diǎn)剪切DNA雙鏈，形成平末端，或1-2個(gè)核苷酸突出的粘末端。 特點(diǎn)：不含RNase(RNase free)，可以用于各種RNA樣品的處理。提供了用于DNase I失活所需的EDTA。 用途：制備不含DNA的RNA樣品；RT-PCR反應(yīng)前RNA樣品中去除基因組DNA等可能的DNA污染；體外T7, T3, SP6等RNA Polymerases催化的RNA轉(zhuǎn)錄后去除DNA模板； DNase I footprinting研究DNA-蛋白質(zhì)相互作用；缺口平移(nick translatioin)；產(chǎn)生DNA隨機(jī)片段文庫(kù)；細(xì)胞凋亡TUNEL檢測(cè)中部分剪切基因組DNA作為陽(yáng)性對(duì)照。 來(lái)源：從牛胰腺純化得到。 分子量：約32kDa(單體)。 活性定義：3710分鐘內(nèi)，將能夠完全降解1g pBR322質(zhì)粒DNA所需的酶量定義為1個(gè)活性單位。 活性檢測(cè)條件：40mM Tris-HCl(pH8.0)，10mM MgSO4，1mM CaCl2，1g of pBR322 DNA。 純度：不含其它DNA內(nèi)切酶和外切酶，不含RNA酶。 酶儲(chǔ)存溶液：50mM Tris-acetate(pH7.5)，10mM CaCl2，50%(v/v)glycerol。 Reaction Buffer(10X)：100mM Tris-HCl(pH7.5 at 25)，25mM MgCl2，1mM CaCl2。失活或抑制：加入EDTA至終濃度為2.5mM后，65加熱10分鐘可使DNase I失活。酚氯仿抽提也可以使DNase I失活。金屬離子螯合劑，達(dá)到毫摩爾/升濃度的鋅離子，0.1%的SDS，DTT、巰基乙醇等還原劑，50-100mM以上鹽濃度均對(duì)DNase I有顯著抑制作用。塞爾托利氏細(xì)胞會(huì)分泌以下的物質(zhì)： 抗苗勒管激素（AMH）于胎兒生命的早期就開(kāi)始分泌。 抑制素及活化素于青春期后分泌，配合調(diào)節(jié)促濾泡成熟激素（FSH）的分泌。 雄激素結(jié)合蛋白促進(jìn)精子生成及精子成熟。 膠質(zhì)源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（GDNF）證實(shí)是助長(zhǎng)精原細(xì)胞，以確保精細(xì)胞在產(chǎn)期時(shí)的自我更新。 Ets相關(guān)分子滋養(yǎng)在成人睪丸精原細(xì)胞內(nèi)的精細(xì)胞。 轉(zhuǎn)鐵蛋白1結(jié)構(gòu)編輯塞爾托利氏細(xì)胞之間的連接形成了血睪屏障，血睪屏障是一個(gè)結(jié)構(gòu)分隔睪丸空隙血液區(qū)及精細(xì)管內(nèi)的向管腔區(qū)。塞爾托利氏細(xì)胞控制養(yǎng)份、激素及其他化合物進(jìn)出睪丸的細(xì)管，且令向管腔區(qū)成為高度免疫的位點(diǎn)。它亦負(fù)責(zé)確立及維持精原細(xì)胞的干細(xì)胞利基，以確保精子的更新及精原細(xì)胞在精子生成的過(guò)程中逐步分裂為成熟的生殖細(xì)胞，而最終為放出精子。其他在精子生成的成熟階段，塞爾托利氏細(xì)胞會(huì)消耗精子沒(méi)有用的部分。產(chǎn)生細(xì)胞一旦塞爾托利氏細(xì)胞完全分裂，就不能再增生。所以，一旦啟動(dòng)精子生成，就不會(huì)創(chuàng)造更多的塞爾托利氏細(xì)胞。一些科學(xué)家最近發(fā)現(xiàn)在身體以外仍能培育這些細(xì)胞。這提供了治療男性不育缺憾的可能性。命名塞爾托利氏細(xì)胞是由發(fā)現(xiàn)這種細(xì)胞的意大利生理學(xué)家塞爾托利（Enrico Sertoli），他是在意大利帕維亞大學(xué)研究醫(yī)藥時(shí)發(fā)現(xiàn)的。2他是于1862年在研究醫(yī)藥時(shí)用顯微鏡發(fā)現(xiàn)這種細(xì)胞。他于1865年發(fā)表這種細(xì)胞的描述，并以“像樹的細(xì)胞”或“黏性細(xì)胞”來(lái)形容它。于1888年，其他科學(xué)家以他的名字來(lái)稱呼這些細(xì)胞。組織學(xué)標(biāo)準(zhǔn)的染色法，是很容易將塞爾托利氏細(xì)胞與其他生殖上皮細(xì)胞混淆。而它最大的分別就是它那深色的細(xì)胞核。3老鼠睪丸細(xì)管的橫切面病理學(xué)支持間質(zhì)細(xì)胞瘤是屬于卵巢瘤的性腺基質(zhì)癌精子發(fā)生維基百科，自由的百科全書生精小管與成熟精子（蘇木精-伊紅染色）精子發(fā)生（英語(yǔ)：spermatogenesis）是有性生殖的雄性動(dòng)物的睪丸中，生殖細(xì)胞從精原細(xì)胞一直發(fā)育到成熟的精子的過(guò)程。細(xì)胞類型倍性/染色體數(shù)量（人類）DNA拷貝/染色單體數(shù)量（人類）Process entered by cell精原細(xì)胞(types Ad, Ap and B)倍性 (2N) / 462C / 46spermatocytogenesis（有絲分裂）primary精母細(xì)胞倍性 (2N) / 462C / 46spermatidogenesis（減數(shù)分裂1期）2個(gè)次級(jí)精母細(xì)胞倍性 (N) / 232C / 46spermatidogenesis（減數(shù)分裂2期）4個(gè)精細(xì)胞倍性 (N) / 231C / 23spermiogenesis4個(gè)游動(dòng)精子倍性 (N) / 231C / 23spermiation倍性和染色體計(jì)數(shù) are for one cell in G1期,在DNA合成and division之前一個(gè)成熟的人類精子目的繁殖跟動(dòng)植物一樣。位置精子發(fā)生過(guò)程的位置是男性生殖系統(tǒng)的數(shù)個(gè)結(jié)構(gòu)。最開(kāi)始的階段發(fā)生在睪丸，一直到附睪結(jié)束。附睪是發(fā)展中的精子成熟和儲(chǔ)存直到射精的地方。睪丸的生精小管是整個(gè)過(guò)程的起點(diǎn)，在那里鄰近內(nèi)管壁的干細(xì)胞朝著中心分裂從管壁開(kāi)始，進(jìn)行到最內(nèi)層的部分，即內(nèi)腔來(lái)生產(chǎn)未成熟的精子。精子成熟過(guò)程發(fā)生在附睪。階段精母細(xì)胞發(fā)生精母細(xì)胞發(fā)生示意圖主條目：精母細(xì)胞發(fā)生精細(xì)胞生成主條目：精細(xì)胞生成精細(xì)胞生成（spermatidogenesis）是從次級(jí)精母細(xì)胞生成精細(xì)胞（spermatid）的過(guò)程。此過(guò)程前已生成的次級(jí)精母細(xì)胞迅速進(jìn)入減數(shù)分裂II期，分裂產(chǎn)生單倍體精細(xì)胞。精子形成主條目：精子形成在精子形成（spermiogenesis）階段中，精細(xì)胞開(kāi)始長(zhǎng)出一條尾部。塞爾托利氏細(xì)胞的角色睪丸中的塞爾托利氏細(xì)胞（紅色）和精母細(xì)胞（藍(lán)色）。附著于細(xì)胞的腔頂點(diǎn)尚未經(jīng)歷spermination的精細(xì)胞主條目：塞爾托利氏細(xì)胞影響因素激素控制精子發(fā)生的激素控制隨物種而不同。人類精子發(fā)生的激素控制機(jī)制尚未被完全理解。參考文獻(xiàn) The testes and spermatogenesis. University of Wisconsin. 19982006-11-27. Johnson, L; Blanchard, TL; Varner, DD; Scrutchfield, WL.Factors affecting spermatogenesis in the stallion. Theriogenology. 1997,48(7): 11991216.doi:10.1016/S0093-691X(97)00353-1.PMID16728209. BARDIN CW: Pituitary-testicular axis. In: YEN SS , JAFFEE RB , eds: Reproductive Endocrinology, 3rd ed. Philadelphia: WB Saunders, 1991 CHAMBERS CV , SHAFER MA , ADGER H , et al.: Microflora of the urethra in adolescent boys: relationships to sexual activity and nongonococcal urethritis. J Ped 110:314-321, 1987 CZYBA JC , GIROD C: Development of normal testis. In: HAFEZ ESE , ed: Descended and Cryptorchid Testis. The Hague, Martinus Nijhoff, 1980. Whitmore WF, Kars L, Gittes RF: The role of germinal epithelium and spermatogenesis in the privileged survival of intratesticular grafts. J Urol 1985;134:782.DNA的瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗(yàn)原理和方法步驟摘要: 瓊脂糖凝膠電泳是用于分離、鑒定和提純DNA片段的標(biāo)準(zhǔn)方法。瓊脂糖是從瓊脂中提取的一種多糖，具親水性，但不帶電荷，是一種很好的電泳支持物。DNA在堿性條件下（pH8 0的緩沖液）帶負(fù)電荷，在電場(chǎng)中通過(guò)凝膠介質(zhì)向正極移動(dòng)，不同DNA分子片段由于分子和構(gòu)型不同，在電場(chǎng)中的泳動(dòng)速率液不同。溴化乙錠（EB）可嵌入DNA分子堿基對(duì)間形成熒光絡(luò)合物，經(jīng)紫外線照射后，可分出不同的區(qū)帶，達(dá)到分離、鑒定分子量，篩選重組子的目的。Westernblot法即是一種將電泳與KIJSA結(jié)合起來(lái)的技術(shù)，可分為電泳、轉(zhuǎn)印、酶免疫測(cè)定3個(gè)階段。Westernblot法結(jié)合了電泳的高分辨率和酶免疫測(cè)定的高敏感性和特異性，是一種能用于分析樣本組分的免疫學(xué)測(cè)定方法。1 類型 將電泳與KIJSA結(jié)合起來(lái)的技術(shù) 分為電泳、轉(zhuǎn)印、酶免疫測(cè)定3個(gè)階段用途分析樣本組分的免疫學(xué)測(cè)定方法，是美國(guó)斯坦福大學(xué)的喬治斯塔克發(fā)明的，Western Blot法的名字就由發(fā)明者Southern與印跡的對(duì)象DNA相結(jié)合得出的Southern blot。后來(lái)又出現(xiàn)了兩個(gè)過(guò)程相似但對(duì)象不同的印跡方法，一個(gè)針對(duì)RNA，一個(gè)針對(duì)蛋白質(zhì)，這兩種技術(shù)分別被稱為Northern和Western，Western Blot法的叫法最終被確定下來(lái)。生物大分子印跡法實(shí)際上是凝膠電泳技術(shù)、固定化技術(shù)及分子親和技術(shù)三者融為一體的綜合性技術(shù)，其核心在于把凝膠電泳已分離的區(qū)帶轉(zhuǎn)移并印跡于固定化紙上。生物大分子印跡法始創(chuàng)于1975年，內(nèi)蘇格蘭愛(ài)丁堡大學(xué)E.M.Southern首先提出。他將限制酶切后的DNA片段先進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，把一張硝酸纖維素紙放在凝膠上，利用毛細(xì)作用原位凝膠中的DNA八片段轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素紙上使之固定化。由于這種技術(shù)類似用吸干作品上的墨跡，使吸墨紙染上墨跡而被稱為印跡法(blotting)。1979年，Towbin等人利用電洗脫裝置作為印跡動(dòng)力，首先把Westernblot法用于抗原撿出，并稱之為免疫印跡法(immunoblotting)。對(duì)應(yīng)于Southern(DNA分子雜交)、NoHhern(RNA分子雜交)。1981年Burnette把免疫印跡法稱為Western blotting即蛋白質(zhì)印跡法-Westernblot法。2 分子生物學(xué)、生物化學(xué)和免疫遺傳學(xué)中時(shí)常會(huì)用到的一種實(shí)驗(yàn)方法，并且是一種能對(duì)蛋白進(jìn)行定性和半定量的分析方法。是通過(guò)特異性抗體對(duì)凝膠電泳處理過(guò)的細(xì)胞或生物組織樣品進(jìn)行著色，并且通過(guò)分析著色的位置和著色深度獲得特定蛋白質(zhì)在所分析的細(xì)胞或組織中的表達(dá)情況的信息。蛋白質(zhì)分析W estern雜交法DNA分析Southern雜交法均是把電流分離的組分從凝膠轉(zhuǎn)移至一種固相支持體，并均以針對(duì)特定氨基酸(Westernblot法)或核苷酸(Southern雜交法)序列所制備的特異性樣品作為探針檢測(cè)其相同或相似序列。蛋白質(zhì)的探針是抗體，它與附著于固相支持體的靶蛋白所呈現(xiàn)的抗原表位發(fā)生特異性反應(yīng)。Westernblot法的主要優(yōu)點(diǎn)在于，它能夠從生物組織的粗提物或部分純化的粗提物中檢測(cè)和識(shí)別幾種特異的蛋白質(zhì)。將聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDSPAGE)分離的蛋白質(zhì)從聚丙烯酰胺凝膠上通過(guò)電轉(zhuǎn)移到一張合適的印跡膜上，隨后用和靈敏檢測(cè)系統(tǒng)相偶聯(lián)的抗體來(lái)識(shí)別結(jié)合在膜上的一種或幾種蛋白質(zhì)。這一技術(shù)的靈敏度能達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)的固相放射免疫分析的水平而又無(wú)需像免疫沉淀法那樣必須對(duì)靶蛋白進(jìn)行放射性標(biāo)記。因此要對(duì)非放射性標(biāo)記蛋白組成的復(fù)雜混合物中的某些特定蛋白進(jìn)行鑒別和定量時(shí)，Westernblot法極為有用。由于蛋白質(zhì)的電泳分離幾乎總在變性條件下進(jìn)行，因此溶解、聚集以及靶蛋白與外來(lái)蛋白的共沉淀等諸多問(wèn)題全都無(wú)需加以考慮。啟動(dòng)子是DNA模板上專一地與RNA聚合酶結(jié)合并決定轉(zhuǎn)錄從何處起始的部位，也決定基因的轉(zhuǎn)錄效率。生物中有許多啟動(dòng)子，如大腸桿菌約有2000個(gè)啟動(dòng)子。各啟動(dòng)子的效率可不相同，大腸桿菌的強(qiáng)啟動(dòng)子每2秒鐘啟動(dòng)一次轉(zhuǎn)錄，而弱啟動(dòng)子每10分鐘才啟動(dòng)一次，從百多個(gè)大腸桿菌啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)的分析，得知兩個(gè)強(qiáng)啟動(dòng)子的同源序列的中心在轉(zhuǎn)錄起始部位（基因編碼鏈上第一個(gè)核苷酸） 5側(cè)約10和35個(gè)核苷酸處，弱啟動(dòng)子序列中往往有多處核苷酸被置換。許多原核生物都含有這兩個(gè)重要的啟動(dòng)子區(qū)：真核生物的啟動(dòng)子部位與原核生物不同，而且啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄的活性，除需啟動(dòng)子外，還需某些外加序列。啟動(dòng)子在遺傳學(xué)中是指一段能使基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄的去氧核糖核酸（DNA）序列。啟動(dòng)子可以被RNA聚合酶辨認(rèn)，并開(kāi)始轉(zhuǎn)錄。在核糖核酸（RNA）合成中，啟動(dòng)子可以和決定轉(zhuǎn)錄的開(kāi)始的轉(zhuǎn)錄因子產(chǎn)成相互作用，繼而控制細(xì)胞開(kāi)始生產(chǎn)哪一種蛋白質(zhì)。完全的啟動(dòng)子稱為規(guī)范序列。3 啟動(dòng)子元件啟動(dòng)子代表一些重要的元件可以與其他調(diào)節(jié)區(qū)域（如增強(qiáng)子、沉默子、邊界元件或絕緣子）合作一致，以主導(dǎo)基因轉(zhuǎn)錄的水平。由于啟動(dòng)子一般都是在基因的上游，啟動(dòng)子所在的位置或是轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)會(huì)由+1開(kāi)始編號(hào)。上游的位置所以都是由+1逆數(shù)的負(fù)數(shù)，例如-100就是位置100的上游堿基對(duì)。以下是各種啟動(dòng)子：核心啟動(dòng)子是引發(fā)轉(zhuǎn)錄的必要部份及轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)，位置約為-35。且是RNA聚合酶的結(jié)合位點(diǎn)及一般轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。 近端啟動(dòng)子是基因的近端序列上游，包括一些基本的調(diào)控元件，位置約為-250，且是特定轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。 遠(yuǎn)處啟動(dòng)子是基因的遠(yuǎn)處序列上游，包括一些額外的調(diào)控元件，影響力較近端啟動(dòng)子弱。它是在上游更遠(yuǎn)的位置（但不是位置性的增強(qiáng)子或調(diào)控區(qū)域），是特定轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。啟動(dòng)子規(guī)范序列的用途一般都是有問(wèn)題的，且可引致對(duì)啟動(dòng)子序列的誤解。在規(guī)范序列中，轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)在特定細(xì)胞情況下有一個(gè)單獨(dú)的序列會(huì)與蛋白質(zhì)牢固地結(jié)合。但是自然選擇會(huì)偏向較低能量的結(jié)合，作為一種調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄輸出。這種最普遍的序列稱為野生型序列。這縱然不是最有利的序列，最近證據(jù)顯示多種基因（包括原癌基因）都有G四股結(jié)構(gòu)作為潛在調(diào)控信號(hào)。在演化生物學(xué)的一個(gè)主要問(wèn)題是修補(bǔ)啟動(dòng)子序列在演化過(guò)程中的重要性，例如人類血統(tǒng)從黑猩猩分開(kāi)后的改變。某些演化生物學(xué)家建議啟動(dòng)子的演化或調(diào)節(jié)區(qū)域可能比序列編碼更重要。5側(cè)翼區(qū)DNase I 足跡法（footprinting） 方法原理：先將待測(cè)雙鏈DNA片段中一條單鏈的一端選擇性地進(jìn)行末端標(biāo)記,然后加入恰當(dāng)濃度的DNase,使在DNA鏈上隨機(jī)形成缺口,經(jīng)變性后電泳分離,放射自顯影,即可形成以相差一個(gè)核苷酸為梯度的DNA條帶。但當(dāng)DNA片段與相應(yīng)的序列特異性DNA結(jié)合蛋白結(jié)合后,DNA結(jié)合蛋白可保護(hù)相應(yīng)的DNA序列不受DNase的攻擊,因而在放射自顯影圖譜上,DNA梯度條帶在相應(yīng)于DNA結(jié)合蛋白的結(jié)合區(qū)域中斷,從而形成一空白區(qū)域,恰似蛋白質(zhì)在DNA上留下的足跡,因而被形象地稱作足跡法。如果同時(shí)進(jìn)行DNA化學(xué)測(cè)序,即可判斷出結(jié)合區(qū)的精確順序。apply vt. 涂；敷；搽；應(yīng)用；運(yùn)用具體操作步驟（舉具體的例子）：探針制備及純化分別以BamH(標(biāo)記Lower strand)和Xho(標(biāo)記Upper strand)酶切含104bp啟動(dòng)子片段的質(zhì)粒pEGFP2104,回收純化后依次加入5l 10Klenow緩沖液,2l 115 mmolPLdGTP、dCTP和dTTP混合物,2l232 P2dATP,1l的Klenow酶,加水補(bǔ)至50l混勻后,37溫育20min,對(duì)兩個(gè)3粘端補(bǔ)平,并參入同位素進(jìn)行標(biāo)記。標(biāo)記后用Xho和BamH進(jìn)行酶切,電泳回收標(biāo)記后的啟動(dòng)子片段備用.DNase足跡分析樣品處理根據(jù)對(duì)A33表達(dá)情況的檢測(cè)11,本實(shí)驗(yàn)以LoVo細(xì)胞為A33基因表達(dá)的陽(yáng)性細(xì)胞,293細(xì)胞為陰性對(duì)照。在Eppendorf管中混合下列成分:5l 5結(jié)合緩沖液,一端標(biāo)記的探針(cpm值為104),LoVo(分30g和60g兩組)和293細(xì)胞核蛋白(60g),poly(dI2dC)polydI2dC)1l,用去離子水調(diào)至50l體積。不加核蛋白的對(duì)照組加入40g BSA。室溫放置30min。加入5l 10Ca2+PMg2+室溫放置1min。加入適量的DNase室溫作用1min,立即加入140l終止液(012molPL NaCl,20mmolPL EDTA pH 810 ,1% SDS,0125gPL carrier RNA)終止反應(yīng)。加入200l Tris飽和酚：氯仿(11)抽提一次。將水相轉(zhuǎn)移至另一Eppendorf管中,加入500l無(wú)水乙醇于-80沉淀30min。12000g離心10min,棄上清。用75%乙醇漂洗2次,干燥后溶于3l甲酰胺上樣緩沖液中。G+A化學(xué)測(cè)序反應(yīng)在Eppendorf管中加入一端標(biāo)記的探針(cpm值為105),015gPl的小牛胸腺DNA 2l,用TE將總體積調(diào)整至10l。加入1l 4%甲酸,37溫育25min。將樣品置于冰上冷卻,加入150l 1molPL哌啶,90溫育30min。樣品置于冰上5min,加入1ml正丁醇,震蕩混勻。高速離心2min沉淀DNA,棄上清。用150l 1% SDS溶解沉淀。加入1ml正丁醇劇烈震蕩,高速離心2min,去除上清。用015ml正丁醇漂洗2次,干燥后溶于10l上樣緩沖液中。電泳及結(jié)果分析將足跡實(shí)驗(yàn)樣品及G+A化學(xué)測(cè)序樣品上6%聚丙烯酰胺變性凝膠電泳分離。50W恒功率電泳約115h至溴酚藍(lán)前沿到達(dá)底端.將凝膠轉(zhuǎn)移至濾紙上,80真空干燥1h。于-80放射自顯影48h。 DNase I足跡試驗(yàn)是一種鑒別RNA聚合酶等蛋白質(zhì)在DNA上結(jié)合位點(diǎn)的方法，它不僅能找到與特異性DNA結(jié)合的目標(biāo)蛋白，而且能告知目標(biāo)蛋白結(jié)合在哪些堿基部位。DNase I足跡試驗(yàn)定義蛋白質(zhì)結(jié)合在DNA片段上，能保護(hù)結(jié)合部位不被DNase破壞，DNA分子經(jīng)酶切作用后遺留下該片段(亦稱“足跡”)，進(jìn)而可以確定它的序列。在電泳凝膠的放射性自顯影圖片上，相應(yīng)于蛋白質(zhì)結(jié)合的部位沒(méi)有放射性標(biāo)記條帶。DNase I足跡試驗(yàn)是一種鑒別RNA聚合酶等蛋白質(zhì)在DNA上結(jié)合位點(diǎn)的方法，它不僅能找到與特異性DNA結(jié)合的目標(biāo)蛋白，而且能告知目標(biāo)蛋白結(jié)合在哪些堿基部位。足跡試驗(yàn)的方法較多，常用的有DNase I足跡試驗(yàn)和硫酸二甲酯足跡試驗(yàn)(dimethylsulfate，DMS)，兩者原理基本相同。DNase I足跡試驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)流程DNase I足跡試驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)流程如下：待檢雙鏈DNA分子用P作末端標(biāo)記，通常只標(biāo)記一端；蛋白質(zhì)與DNA混合，等兩者結(jié)合后，加入適量的DNase I，消化DNA分子，控制酶的用量，使之達(dá)到每個(gè)DNA分子只發(fā)生一次磷酸二酯鍵斷裂，并列設(shè)置未加蛋白質(zhì)的對(duì)照；從DNA上除去蛋白質(zhì)，將變性的DNA加樣在測(cè)序凝膠中作電泳和放射性自顯影，與對(duì)照組相比后解讀出足跡部位的核苷酸序列。DNA甲基化（英語(yǔ)：DNA methylation）為DNA化學(xué)修飾的一種形式，能在不改變DNA序列的前提下，改變遺傳表現(xiàn)。為外遺傳編碼（epigenetic code）的一部分，是一種外遺傳機(jī)制。DNA甲基化過(guò)程會(huì)使甲基添加到DNA分子上，例如在胞嘧啶環(huán)的5碳上：這種5方向的DNA甲基化方式可見(jiàn)于所有脊椎動(dòng)物。在人類細(xì)胞內(nèi)，大約有1%的DNA堿基受到了甲基化。在成熟體細(xì)胞組織中，DNA甲基化一般發(fā)生于CpG雙核苷酸（CpG dinucleotide）部位；而非CpG甲基化則于胚胎干細(xì)胞中較為常見(jiàn)。DNA甲基化可能使基因沉默化，進(jìn)而使其失去功能。此外，也有一些生物體內(nèi)不存在DNA甲基化作用。組蛋白（histones）真核生物體細(xì)胞染色質(zhì)中的堿性蛋白質(zhì)，含精氨酸和賴氨酸等堿性氨基酸特別多，二者加起來(lái)約為所有氨基酸殘基的1/4。組蛋白與帶負(fù)電荷的雙螺旋DNA結(jié)合成DNA-組蛋白復(fù)合物。因氨基酸成分和分子量不同，主要分成5類。組蛋白是真核生物染色體的基本結(jié)構(gòu)蛋白，是一類小分子堿性蛋白質(zhì)，有六種類型：H1、H2A、H2B、H3、H4及古細(xì)菌組蛋白，它們富含帶正電荷的堿性氨基酸，能夠同DNA中帶負(fù)電荷的磷酸基團(tuán)相互作用轉(zhuǎn)錄因子（Transcription factors ，TFs)。真核生物轉(zhuǎn)錄起始十分復(fù)雜，往往需要多種蛋白因子的協(xié)助，轉(zhuǎn)錄因子與RNA聚合酶形成轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合體，共同參與轉(zhuǎn)錄起始的過(guò)程。根據(jù)轉(zhuǎn)錄因子的作用特點(diǎn)可分為二類；第一類為普遍轉(zhuǎn)錄因子,它們與RNA聚合酶共同組成轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合體時(shí)，轉(zhuǎn)錄才能在正確的位置開(kāi)始。除TFD以外，還發(fā)現(xiàn)TFA，TFF，TFE，TFH等，它們?cè)谵D(zhuǎn)錄起始復(fù)合體組裝的不同階段起作用。第二類轉(zhuǎn)錄因子為組織細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子，這些TF是在特異的組織細(xì)胞或是受到一些類固醇激素生長(zhǎng)因子或其它刺激后，開(kāi)始表達(dá)某些特異蛋白質(zhì)分子時(shí)，才需要的一類轉(zhuǎn)錄因子。RNA的轉(zhuǎn)錄合成從化學(xué)角度來(lái)講類似于DNA的復(fù)制，多核苷酸鏈的合成都是以53的方向，在3-OH末端與加入的核苷酸磷酸二酯鍵，但是，由于復(fù)制和轉(zhuǎn)錄的目的不同，轉(zhuǎn)錄又具有其特點(diǎn)：（1）對(duì)于一個(gè)基因組來(lái)說(shuō)，轉(zhuǎn)錄只發(fā)生在一部分基因，而且每個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄都受到相對(duì)獨(dú)立的控制（圖17-2）；（2）轉(zhuǎn)錄是不對(duì)稱的。（3）轉(zhuǎn)錄時(shí)不需要引物，而且RNA鏈的合成是連續(xù)的。轉(zhuǎn)錄因子(transcription factor)是一群能與基因5端上游特定序列專一性結(jié)合，從而保證目的基因以特定的強(qiáng)度在特定的時(shí)間與空間表達(dá)的蛋白質(zhì)分子。分類真核生物在轉(zhuǎn)錄時(shí)往往需要多種蛋白質(zhì)因子的協(xié)助。一種蛋白質(zhì)是不是轉(zhuǎn)錄機(jī)構(gòu)的一部分往往是通過(guò)體外系統(tǒng)看它是否是轉(zhuǎn)錄起始所必須的。一般可將這些轉(zhuǎn)錄所需的蛋白質(zhì)分為三大類：亞基RNA聚合酶的亞基，它們是轉(zhuǎn)錄必須的，但并不對(duì)某一啟動(dòng)子有特異性。復(fù)合物某些轉(zhuǎn)錄因子能與RNA聚合酶結(jié)合形成起始復(fù)合物，但不組成游離聚合酶的成分。這些因子可能是所有啟動(dòng)子起始轉(zhuǎn)錄所必須的，但亦可能僅是譬如說(shuō)轉(zhuǎn)錄終止所必須的。但是，在這一類因子中，要嚴(yán)格區(qū)分開(kāi)哪些是RNA聚合酶的亞基，哪些僅是輔助因子，是很困難的。特異順序某些轉(zhuǎn)錄因子僅與其靶啟動(dòng)子中的特異順序結(jié)合。如果這些順序存在于啟動(dòng)子中，則這些順序因子是一般轉(zhuǎn)錄機(jī)構(gòu)的一部分。如果這些順序僅存在于某些種類的啟動(dòng)子中，則識(shí)別這些順序的因子也只是在這些特異啟動(dòng)子上起始轉(zhuǎn)錄必須的。黑腹果蠅的RNA聚合酶需要至少兩個(gè)轉(zhuǎn)錄因子方能在體外起始轉(zhuǎn)錄。其中一個(gè)是B因子，它與含TATA盒的部位結(jié)合。人的因子TFD亦和類似的部位結(jié)合。同樣，CTF(CAAT結(jié)合因子)則與腺病毒的主要晚期啟動(dòng)子中與CAAT盒同源的部位相結(jié)合。結(jié)合在上游區(qū)的另一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子是USF(亦稱MLTF)，則可以識(shí)別腺病毒晚期啟動(dòng)子中靠近-55的順序。轉(zhuǎn)錄因子Sp1則能和GC盒相結(jié)合。在SC40啟動(dòng)子中有多個(gè)GC盒，位于-70到-110之間。它們均能和Sp1相結(jié)合。然而含有GC盒的不同的DNA順序與Sp1的親和力卻各不相同?？梢?jiàn)GC盒兩側(cè)的順序?qū)p1-GC盒的結(jié)合究竟如何能影響轉(zhuǎn)錄。有時(shí)候需要幾個(gè)轉(zhuǎn)錄因子才能起始轉(zhuǎn)錄。例如胞苷激酶的啟動(dòng)子需要Sp1與GC盒結(jié)合和CTF與CAAT盒結(jié)合;腺病毒晚期啟動(dòng)子需要TFD與TATA盒結(jié)合和USF與其鄰近部位相結(jié)合。以上所述的因子是一般轉(zhuǎn)錄都需要的，似乎并沒(méi)有什么調(diào)節(jié)功能。另一些轉(zhuǎn)錄因子則可以調(diào)控一組特殊基因的轉(zhuǎn)錄。熱休克基因就是一個(gè)很好的例子。真核生物的熱休克基因在轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)的上游15bp處有一個(gè)共同順序。HSTF因子僅在熱休克細(xì)胞中有活性。它與包括熱休克共同順序在內(nèi)的一段DNA相結(jié)合，所以這個(gè)因子的激活可以引起約包括20個(gè)基因的一組基因起始轉(zhuǎn)錄。在這里，轉(zhuǎn)錄因子和RNA聚合酶之間關(guān)系很類似細(xì)菌的因子與核心酶之間的關(guān)系。轉(zhuǎn)錄因子是一種具有特殊結(jié)構(gòu)、行使調(diào)控基因表達(dá)功能的蛋白質(zhì)分子，也稱為反式作用因子。特異型轉(zhuǎn)錄因子，能夠選擇性調(diào)控某種或某些基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。典型的轉(zhuǎn)錄因子含有DNA結(jié)合區(qū) (DNA-binding domain)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū) (activation domain)、寡聚化位點(diǎn)(oligomerization site) 以及核定位信號(hào)(nuclear localization signal) 等功能區(qū)域。這些功能區(qū)域決定轉(zhuǎn)錄因子的功能和特性 (Liu et al., 1999)。DNA結(jié)合區(qū)帶共性的結(jié)構(gòu)主要有：1）HTH 和 HLH 結(jié)構(gòu)：由兩段-螺旋夾一段-折疊構(gòu)成，-螺旋與-折疊之間通過(guò)-轉(zhuǎn)角或成環(huán)連接，即螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋結(jié)構(gòu)和螺旋-環(huán)-螺旋結(jié)構(gòu)。2）鋅指結(jié)構(gòu)： 多見(jiàn)于 TFIII A 和類固醇激素受體中，由一段富含半胱氨酸的多肽鏈構(gòu)成。每四個(gè)半光氨酸殘基或組氨酸殘基螯合一分子 Zn2+ ，其余約 12-13 個(gè)殘基則呈指樣突出，剛好能嵌入 DNA 雙螺旋的大溝中而與之相結(jié)合。3）亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)：多見(jiàn)于真核生物DNA 結(jié)合蛋白的 C 端，與癌基因表達(dá)調(diào)控有關(guān)。由兩段 - 螺旋平行排列構(gòu)成，其 - 螺旋中存在每隔 7 個(gè)殘基規(guī)律性排列的亮氨酸殘基，亮氨酸側(cè)鏈交替排列而呈拉鏈狀，兩條肽鏈呈鉗狀與 DNA 相結(jié)合。轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)同一家族的轉(zhuǎn)錄因子之間的區(qū)別主要在轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)。轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)包括轉(zhuǎn)錄激活區(qū) (transcription activation domain) 和轉(zhuǎn)錄抑制區(qū) (transcription repression domain) 二種。近年來(lái)，轉(zhuǎn)錄的激活區(qū)被深入研究。它們一般包含DNA結(jié)合區(qū)之外的30-100個(gè)氨基酸殘基，有時(shí)一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子包含不止一個(gè)轉(zhuǎn)錄激活區(qū)。如控制植物儲(chǔ)藏蛋白基因表達(dá)的VP1和PvALF轉(zhuǎn)錄因子，它們的N-末端酸性氨基酸保守序列都具有轉(zhuǎn)錄激活能力，與酵母轉(zhuǎn)錄因子GCN4和病毒轉(zhuǎn)錄因子的VP16的酸性氨基酸轉(zhuǎn)錄激活區(qū)有較高同源性(Bobb et al., 1996)。典型的植物轉(zhuǎn)錄因子激活區(qū)一般富含酸性氨基酸、脯氨酸或谷氨酰胺等，如GBF (G-box binding factor) 含有的GCB盒 (GBF conserved box) 激活結(jié)構(gòu)域(lunwen114 and Bevan, 1998)。轉(zhuǎn)錄抑制區(qū)也是轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控表達(dá)的重要位點(diǎn)，但是對(duì)其作用機(jī)理研究尚不深入。可能的作用方式有三種：1）與啟動(dòng)子的調(diào)控位點(diǎn)結(jié)合，阻止其它轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合；2）作用于其它轉(zhuǎn)錄因子，抑制其它因子的作用；3）通過(guò)改變DNA的高級(jí)結(jié)構(gòu)阻止轉(zhuǎn)錄的發(fā)生。轉(zhuǎn)錄因子必須在核內(nèi)作用，才能起到調(diào)控表達(dá)的目的。因此，轉(zhuǎn)錄因子上的核定位序列是其重要的組成部分。一般一個(gè)或多個(gè)核定位序列在轉(zhuǎn)錄因子中不規(guī)則分布，同時(shí)也存在不含核定位序列的轉(zhuǎn)錄因子，它們通過(guò)結(jié)合到其它轉(zhuǎn)錄因子上進(jìn)入細(xì)胞核。核定位序列一般是轉(zhuǎn)錄因子中富含精氨酸和賴氨酸殘基的區(qū)段。目前，水稻中的GT-2、西紅柿中的HSFA1-2、玉米的O2和碗豆的PS-IAA4和6等轉(zhuǎn)錄因子中的核定位序列都已被鑒定 (Boulikas, 1994; Dehesh et al., 1995; Lyck et al., 1997; Varagona et al., 1992; Abel and Theologis, 1995)。絕大多數(shù)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合 DNA前需通過(guò)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用形成二聚體或多聚體。所謂二聚體化就是指兩分子單體通過(guò)一定的結(jié)構(gòu)域結(jié)合成二聚體，它是轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合DNA時(shí)最常見(jiàn)的形式。由同種分子形成的二聚體稱同二聚體，異種分子間形成的二聚體稱異二聚體。這種多聚體的形成是轉(zhuǎn)錄因子上的寡聚化位點(diǎn) (oligomerization site) 相互作用的結(jié)果，寡聚化位點(diǎn)的氨基酸序列很保守，大多與DNA結(jié)合區(qū)相連并形成一定的空間構(gòu)象。除二聚化或多聚化反應(yīng)，還有一些調(diào)節(jié)蛋白不能直接結(jié)合DNA，而是通過(guò)蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)相互作用間接結(jié)合DNA，調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄，這樣就形成了一個(gè)表達(dá)調(diào)控的復(fù)合物。作用是通過(guò)和順式因子的互作來(lái)實(shí)現(xiàn)的。這段序列可以和轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合域?qū)崿F(xiàn)共價(jià)結(jié)合，從而對(duì)基因的表達(dá)起抑制或增強(qiáng)的作用。目前，人工轉(zhuǎn)錄因子(Artificial Transcription Factor，ATF)的構(gòu)建已用于轉(zhuǎn)錄因子的生物學(xué)功能研究中起到重要作用。ATF是指將不同的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域與效應(yīng)結(jié)構(gòu)域組合在一起，人為地構(gòu)建具有新的序列特異性與作用效果的轉(zhuǎn)錄因子 ，在基礎(chǔ)研究、藥物設(shè)計(jì)以及基因治療等領(lǐng)域得到了廣泛研究，目前研究較多的ATF主要為C2H2型鋅指結(jié)構(gòu)。Myo D全稱Myogenic Differentiation Antigen，成肌分化抗原，是以其命名的一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子家族的重要成員。該家族成員的時(shí)空表達(dá)具有特異性，同時(shí)彼此之間有較大差異，但是都參與成肌細(xì)胞向肌細(xì)胞的分化過(guò)程，是對(duì)于肌肉組織發(fā)育具有重要作用的轉(zhuǎn)錄因子家族。c-myc基因是myc基因家族的重要成員之一，c-myc基因既是一種可易位基因，又是一種多種物質(zhì)調(diào)節(jié)的可調(diào)節(jié)基因，也是一種可使細(xì)胞無(wú)限增殖，獲永生化功能，促進(jìn)細(xì)胞分裂的基因，myc基因參于細(xì)胞凋零，c-myc基因與多種腫瘤發(fā)生發(fā)展有關(guān)。表觀遺傳學(xué)（英語(yǔ)：epigenetics）又譯為表征遺傳學(xué)、擬遺傳學(xué)、表遺傳學(xué)、外遺傳學(xué)以及后遺傳學(xué)，在生物學(xué)和特定的遺傳學(xué)領(lǐng)域，其研究的是在不改變DNA序列的前提下，通過(guò)某些機(jī)制引起可遺傳的基因表達(dá)或細(xì)胞表現(xiàn)型的變化1。表征遺傳現(xiàn)象包括DNA、RNA干擾、組蛋白修飾等。其研究?jī)?nèi)容主要包括兩類，一類為基因選擇性轉(zhuǎn)錄表達(dá)的調(diào)控，有DNA甲基化、基因印記、組蛋白共價(jià)修飾和染色質(zhì)重塑；另一類為基因轉(zhuǎn)錄后的調(diào)控，包括基因組中非編碼RNA、微小RNA、反義RNA、內(nèi)含子及核糖開(kāi)關(guān)等。表征遺傳學(xué)指基因組相關(guān)功能改變而不涉及核苷酸序列變化。例如DNA和組蛋白修飾，兩者均能在不改變DNA序列的前提下調(diào)節(jié)基因的表達(dá)；阻遏蛋白通過(guò)結(jié)合沉默基因從而控制基因的表達(dá)。這些變化可能可以通過(guò)細(xì)胞分裂而得以保留，并且可能持續(xù)幾代。這些變化都僅是非基因因素導(dǎo)致的生物體基因表現(xiàn)（或“自我表達(dá)”）的不同2，由于目前尚不清楚組蛋白的化學(xué)修飾是否可遺傳。在真核生物中主要表現(xiàn)在細(xì)胞分化過(guò)程。在胚胎形態(tài)形成過(guò)程中，全能干細(xì)胞將分化成完全不同的細(xì)胞，也就是說(shuō)，一個(gè)受精卵細(xì)胞分化出各種不同類型的細(xì)胞，包括神經(jīng)細(xì)胞、肌肉細(xì)胞、上皮細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞等，并通過(guò)抑制其他細(xì)胞和激活相關(guān)基因而進(jìn)行持續(xù)的細(xì)胞分裂。關(guān)于表征遺傳學(xué)的共識(shí)，即“由染色體改變所引起的穩(wěn)定的可遺傳的表現(xiàn)型，而非DNA序列的改變?！氨碚骰蚪M”是“基因組”的平行詞，指的是一個(gè)細(xì)胞的整體表征遺傳狀態(tài)?！斑z傳密碼”與“表征遺傳密碼”對(duì)應(yīng)，用于描述不同細(xì)胞產(chǎn)生不同表現(xiàn)型的一系列表征遺傳特征。“表征遺傳密碼”可代表細(xì)胞的總體狀態(tài)，按每個(gè)分子在表征遺傳地圖上所占的位置，可得出DNA甲基化和組蛋白修飾狀態(tài)的特定基因組區(qū)域的基因表達(dá)圖表。表征遺傳的改變可以導(dǎo)致特定基因的激活，而不必改變DNA序列。此外，染色質(zhì)蛋白與DNA相關(guān)聯(lián)可能被激活或沉默。這是不同的細(xì)胞在多細(xì)胞有機(jī)體中只表達(dá)其活動(dòng)必需基因的原因。當(dāng)細(xì)胞進(jìn)行分裂時(shí)，表征遺傳的變化得以保存。大多數(shù)表征遺傳變化只發(fā)生在生物個(gè)體的一生中，但是，如果形成受精卵的精子或卵細(xì)胞發(fā)生了基因失活，那么這種表征遺傳變化將被傳遞給下一代。由此拉馬克學(xué)說(shuō)提出了一個(gè)問(wèn)題：這種生物體表征遺傳的變化是否可改變DNA的基本結(jié)構(gòu)。特殊的表征遺傳過(guò)程包括副突變、書簽、基因組銘印、基因沉默、X染色體去活化、位置效應(yīng)、重構(gòu)、縮并、母體效應(yīng)、致癌過(guò)程、致畸劑影響、組織蛋白修飾及異染色質(zhì)的調(diào)控，最后是受技術(shù)局限的單性生殖及克隆。DNA損傷也會(huì)導(dǎo)致表征遺傳變化。DNA損傷發(fā)生頻繁，人體平均每天會(huì)發(fā)生10000次。這些損傷大部分被修復(fù)，但在DNA修復(fù)時(shí)仍然可能發(fā)生表征遺傳變化。尤其是雙鏈DNA的斷裂可能會(huì)引起未編程的表征遺傳基因沉默，導(dǎo)致DNA甲基化和促進(jìn)沉默蛋白質(zhì)組的修飾（染色質(zhì)重構(gòu)）。此外，多聚二磷酸腺苷核糖酶（Parp1酶）及其產(chǎn)物多聚二磷酸腺苷核糖（PAR）在修復(fù)過(guò)程中會(huì)積聚DNA的損傷。這種累積，反過(guò)來(lái)，直接補(bǔ)充和激活染色質(zhì)重塑蛋白ALC1進(jìn)而導(dǎo)致核小體的重構(gòu)。而核小體的重構(gòu)會(huì)導(dǎo)致DNA修復(fù)基因MLH1的沉默。能造成DNA損傷的化學(xué)物質(zhì)，如苯、對(duì)苯二酚、苯乙烯、四氯化碳和三氯乙烯，可通過(guò)激活氧化應(yīng)激通路導(dǎo)致大量的DNA低甲基化。細(xì)胞核個(gè)體的表現(xiàn)型受到自身基因轉(zhuǎn)錄的影響，因此可遺傳的轉(zhuǎn)錄能提高表征遺傳效應(yīng)。基因表達(dá)分多層調(diào)控，基因調(diào)控的一種途徑是通過(guò)染色質(zhì)重構(gòu)。染色質(zhì)是DNA和組蛋白結(jié)合的復(fù)合體，DNA纏繞著組蛋白球體，若DNA纏繞組蛋白的方式發(fā)生改變，基因表達(dá)也將改變。染色質(zhì)重構(gòu)通過(guò)以下兩個(gè)主要機(jī)制完成：1. 第一條途徑是組成組蛋白的氨基酸的平移修改。組蛋白由長(zhǎng)鏈氨基酸構(gòu)成，如果鏈中的氨基酸改變，組蛋白的形態(tài)將發(fā)生改變。復(fù)制期間的DNA并非完全解鏈，因此，經(jīng)過(guò)修改的組蛋白可能被用于每個(gè)新復(fù)制的DNA，這些組蛋白將作為模板，以新的方式合成新形態(tài)的組蛋白。通過(guò)改變周圍蛋白的形態(tài)，這些修改的組蛋白將確保分化的細(xì)胞保持分化狀態(tài)，而不是重新回到干細(xì)胞狀態(tài)。2. 第二條途徑是通過(guò)增加位于CpG島上的DNA的甲基，使胞嘧啶轉(zhuǎn)化為5-甲基胞嘧啶。5-甲基胞嘧啶同正常的胞嘧啶一樣與鳥嘌呤配對(duì)，然而，基因組某些區(qū)域的甲基化較多，甲基化較高的區(qū)域通過(guò)不完全清楚的機(jī)制使得轉(zhuǎn)錄的活力減小。甲基化的胞核嘧啶也可以從父母一方的生殖細(xì)胞保留在受精卵中，標(biāo)記染色體遺傳自雙親（遺傳印記）。細(xì)胞分化過(guò)程中DNA甲基化將導(dǎo)致組蛋白性狀的變化。某些酶（如DNMT1）對(duì)甲基化胞嘧啶有較高的親和力。如果這種酶達(dá)到DNA的“半甲基化”部分（兩條DNA鏈中只有一個(gè)甲基胞嘧啶），這種酶將催化另一部分。雖然組蛋白修飾發(fā)生在整個(gè)序列中，非結(jié)構(gòu)化的N-末端的蛋白（稱為組蛋白尾端）特別容易被修改。這些修改包括乙?；谆?，泛素化，磷酸化和修飾作用。乙酰化是這些修飾中研究得最多的。例如，組蛋白H3尾部的K14和K9賴氨酸被組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶（HATs）乙?；ǔＥc轉(zhuǎn)錄能力有關(guān)。有人認(rèn)為這種與“激活的”轉(zhuǎn)錄有關(guān)的乙?；瘍A向于