分子生物學(xué)資料.doc

1樓一、名詞解釋 1cDNA與cccDNA：cDNA是由mRNA通過(guò)反轉(zhuǎn)錄酶合成的雙鏈DNA；cccDNA是游離于染色體之外的質(zhì)粒雙鏈閉合環(huán)形DNA。 2標(biāo)準(zhǔn)折疊單位：蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)單元螺旋與折疊通過(guò)各種連接多肽可以組成特殊幾何排列的結(jié)構(gòu)塊，此種確定的折疊類(lèi)型通常稱(chēng)為超二級(jí)結(jié)構(gòu)。幾乎所有的三級(jí)結(jié)構(gòu)都可以用這些折疊類(lèi)型，乃至他們的組合型來(lái)予以描述，因此又將其稱(chēng)為標(biāo)準(zhǔn)折疊單位。 3CAP：環(huán)腺苷酸（cAMP）受體蛋白CRP（cAMPreceptorprotein），cAMP與CRP結(jié)合后所形成的復(fù)合物稱(chēng)激活蛋白CAP（cAMPactivatedprotein） 4回文序列：DNA片段上的一段所具有的反向互補(bǔ)序列，常是限制性酶切位點(diǎn)。 5micRNA：互補(bǔ)干擾RNA或稱(chēng)反義RNA，與mRNA序列互補(bǔ)，可抑制mRNA的翻譯。 6核酶：具有催化活性的RNA，在RNA的剪接加工過(guò)程中起到自我催化的作用。 7模體：蛋白質(zhì)分子空間結(jié)構(gòu)中存在著某些立體形狀和拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)頗為類(lèi)似的局部區(qū)域 8信號(hào)肽：在蛋白質(zhì)合成過(guò)程中N端有1536個(gè)氨基酸殘基的肽段，引導(dǎo)蛋白質(zhì)的跨膜。 9弱化子：在操縱區(qū)與結(jié)構(gòu)基因之間的一段可以終止轉(zhuǎn)錄作用的核苷酸序列。 10魔斑：當(dāng)細(xì)菌生長(zhǎng)過(guò)程中，遇到氨基酸全面缺乏時(shí)，細(xì)菌將會(huì)產(chǎn)生一個(gè)應(yīng)急反應(yīng)，停止全部基因的表達(dá)。產(chǎn)生這一應(yīng)急反應(yīng)的信號(hào)是鳥(niǎo)苷四磷酸(ppGpp)和鳥(niǎo)苷五磷酸（pppGpp）。PpGpp與pppGpp的作用不只是一個(gè)或幾個(gè)操縱子，而是影響一大批，所以稱(chēng)他們是超級(jí)調(diào)控子或稱(chēng)為魔斑。 11上游啟動(dòng)子元件：是指對(duì)啟動(dòng)子的活性起到一種調(diào)節(jié)作用的DNA序列，-10區(qū)的TATA、-35區(qū)的TGACA及增強(qiáng)子，弱化子等。 12DNA探針：是帶有標(biāo)記的一段已知序列DNA，用以檢測(cè)未知序列、篩選目的基因等方面廣泛應(yīng)用。 13SD序列：是核糖體與mRNA結(jié)合序列，對(duì)翻譯起到調(diào)控作用。 14單克隆抗體：只針對(duì)單一抗原決定簇起作用的抗體。 15考斯質(zhì)粒：是經(jīng)過(guò)人工構(gòu)建的一種外源DNA載體，保留噬菌體兩端的COS區(qū)，與質(zhì)粒連接構(gòu)成。 16藍(lán)-白斑篩選：含LacZ基因（編碼半乳糖苷酶）該酶能分解生色底物X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖苷)產(chǎn)生藍(lán)色，從而使菌株變藍(lán)。當(dāng)外源DNA插入后，LacZ基因不能表達(dá)，菌株呈白色，以此來(lái)篩選重組細(xì)菌。稱(chēng)之為藍(lán)-白斑篩選。 17順式作用元件：在DNA中一段特殊的堿基序列，對(duì)基因的表達(dá)起到調(diào)控作用的基因元件。 18Klenow酶：DNA聚合酶I大片段，只是從DNA聚合酶I全酶中去除了53外切酶活性 19錨定PCR：用于擴(kuò)增已知一端序列的目的DNA。在未知序列一端加上一段多聚dG的尾巴，然后分別用多聚dC和已知的序列作為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。 20融合蛋白：真核蛋白的基因與外源基因連接，同時(shí)表達(dá)翻譯出的原基因蛋白與外源蛋白結(jié)合在一起所組成的蛋白質(zhì)。 二、填空 1DNA的物理圖譜是DNA分子的（限制性?xún)?nèi)切酶酶解）片段的排列順序。 2RNA酶的剪切分為（自體催化）、（異體催化）兩種類(lèi)型。 3原核生物中有三種起始因子分別是（IF-1）、（IF-2）和（IF-3）。 4蛋白質(zhì)的跨膜需要（信號(hào)肽）的引導(dǎo)，蛋白伴侶的作用是（輔助肽鏈折疊成天然構(gòu)象的蛋白質(zhì)）。 5啟動(dòng)子中的元件通?？梢苑譃閮煞N：（核心啟動(dòng)子元件）和（上游啟動(dòng)子元件）。 6分子生物學(xué)的研究?jī)?nèi)容主要包含（結(jié)構(gòu)分子生物學(xué)）、（基因表達(dá)與調(diào)控）、（DNA重組技術(shù)）三部分。 7證明DNA是遺傳物質(zhì)的兩個(gè)關(guān)鍵性實(shí)驗(yàn)是（肺炎球菌感染小鼠）、（T2噬菌體感染大腸桿菌）這兩個(gè)實(shí)驗(yàn)中主要的論點(diǎn)證據(jù)是：（生物體吸收的外源DNA改變了其遺傳潛能）。 8hnRNA與mRNA之間的差別主要有兩點(diǎn)：（hnRNA在轉(zhuǎn)變?yōu)閙RNA的過(guò)程中經(jīng)過(guò)剪接，）、 （mRNA的5末端被加上一個(gè)m7pGppp帽子，在mRNA3末端多了一個(gè)多聚腺苷酸(polyA)尾巴）。 9蛋白質(zhì)多亞基形式的優(yōu)點(diǎn)是（亞基對(duì)DNA的利用來(lái)說(shuō)是一種經(jīng)濟(jì)的方法）、（可以減少蛋白質(zhì)合成過(guò)程中隨機(jī)的錯(cuò)誤對(duì)蛋白質(zhì)活性的影響）、（活性能夠非常有效和迅速地被打開(kāi)和被關(guān)閉）。 2006-3-19 08:11 回復(fù) 10蛋白質(zhì)折疊機(jī)制首先成核理論的主要內(nèi)容包括（成核）、（結(jié)構(gòu)充實(shí)）、（最后重排）。 11半乳糖對(duì)細(xì)菌有雙重作用；一方面（可以作為碳源供細(xì)胞生長(zhǎng)）；另一方面（它又是細(xì)胞壁的成分）。所以需要一個(gè)不依賴(lài)于cAMPCRP的啟動(dòng)子S2進(jìn)行本底水平的永久型合成；同時(shí)需要一個(gè)依賴(lài)于cAMPCRP的啟動(dòng)子S1對(duì)高水平合成進(jìn)行調(diào)節(jié)。有G時(shí)轉(zhuǎn)錄從（S2）開(kāi)始，無(wú)G時(shí)轉(zhuǎn)錄從（S1）開(kāi)始。 12DNA重組技術(shù)也稱(chēng)為（基因克隆）或（分子克?。?。最終目的是（把一個(gè)生物體中的遺傳信息DNA轉(zhuǎn)入另一個(gè)生物體）。典型的DNA重組實(shí)驗(yàn)通常包含以下幾個(gè)步驟： 提取供體生物的目的基因（或稱(chēng)外源基因），酶接連接到另一DNA分子上（克隆載體），形成一個(gè)新的重組DNA分子。 將這個(gè)重組DNA分子轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞并在受體細(xì)胞中復(fù)制保存，這個(gè)過(guò)程稱(chēng)為轉(zhuǎn)化。 對(duì)那些吸收了重組DNA的受體細(xì)胞進(jìn)行篩選和鑒定。 對(duì)含有重組DNA的細(xì)胞進(jìn)行大量培養(yǎng)，檢測(cè)外援基因是否表達(dá)。 13、質(zhì)粒的復(fù)制類(lèi)型有兩種：受到宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)合成的嚴(yán)格控制的稱(chēng)為（嚴(yán)緊型質(zhì)粒），不受宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)合成的嚴(yán)格控制稱(chēng)為（松弛型質(zhì)粒）。 14PCR的反應(yīng)體系要具有以下條件： a、被分離的目的基因兩條鏈各一端序列相互補(bǔ)的DNA引物（約20個(gè)堿基左右）。 b、具有熱穩(wěn)定性的酶如：TagDNA聚合酶。 c、dNTP d、作為模板的目的DNA序列 15PCR的基本反應(yīng)過(guò)程包括：（變性）、（退火）、（延伸）三個(gè)階段。 16、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的基本過(guò)程通常包括： 將克隆的外源基因?qū)氲揭粋€(gè)受精卵或胚胎干細(xì)胞的細(xì)胞核中； 接種后的受精卵或胚胎干細(xì)胞移植到雌性的子宮； 完成胚胎發(fā)育，生長(zhǎng)為后代并帶有外源基因； 利用這些能產(chǎn)生外源蛋白的動(dòng)物作為種畜，培育新的純合系。 17雜交瘤細(xì)胞系的產(chǎn)生是由（脾B）細(xì)胞與（骨髓瘤）細(xì)胞雜交產(chǎn)生的，由于（脾細(xì)胞）可以利用次黃嘌呤，（骨細(xì)胞）提供細(xì)胞分裂功能，所以能在HAT培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。 18隨著研究的深入第一代抗體稱(chēng)為（多克隆抗體）、第二代（單克隆抗體）、第三代（基因工程抗體）。 19目前對(duì)昆蟲(chóng)病毒的基因工程改造主要集中于桿狀病毒，表現(xiàn)在引入（外源毒蛋白基因）；（擾亂昆蟲(chóng)正常生活周期的基因）；（對(duì)病毒基因進(jìn)行修飾）。 20哺乳類(lèi)RNA聚合酶啟動(dòng)子中常見(jiàn)的元件TATA、GC、CAAT所對(duì)應(yīng)的反式作用蛋白因子分別是（TFIID）、（SP-1）和（CTF/NF1）。 21RNA聚合酶的基本轉(zhuǎn)錄因子有、TF-A、TF-B、TFII-D、TF-E他們的結(jié)合順序是：（D、A、B、E）。其中TFII-D的功能是（與TATA盒結(jié)合）。 22與DNA結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子大多以二聚體形式起作用，轉(zhuǎn)錄因子與DNA結(jié)合的功能域常見(jiàn)有以下幾種（螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋）、（鋅指模體）、（堿性-亮氨酸拉鏈模體）。 23限制性?xún)?nèi)切酶的切割方式有三種類(lèi)型分別是（在對(duì)稱(chēng)軸5側(cè)切割產(chǎn)生5粘端）、（在對(duì)稱(chēng)軸3側(cè)切割產(chǎn)生3粘端（在對(duì)稱(chēng)軸處切割產(chǎn)生平段）。 24質(zhì)粒DNA具有三種不同的構(gòu)型分別是：（SC構(gòu)型）、（oc構(gòu)型）、（L構(gòu)型）。在電泳中最前面的是（SC構(gòu)型）。 25外源基因表達(dá)系統(tǒng)，主要有（大腸桿菌）、（酵母）、（昆蟲(chóng)）和（哺乳類(lèi)細(xì)胞表）。 26轉(zhuǎn)基因動(dòng)物常用的方法有：（逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法）、（DNA顯微注射法）、（胚胎干細(xì)胞法）。 三、簡(jiǎn)答 1分別說(shuō)出5種以上RNA的功能？ 轉(zhuǎn)運(yùn)RNAtRNA轉(zhuǎn)運(yùn)氨基酸 核蛋白體RNArRNA核蛋白體組成成 信使RNAmRNA蛋白質(zhì)合成模板 不均一核RNAhnRNA成熟mRNA的前體 小核RNAsnRNA參與hnRNA的剪接 小胞漿RNAscRNA/7SL-RNA蛋白質(zhì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位合成的信號(hào)識(shí)別體的組成成分 反義RNAanRNA/micRNA對(duì)基因的表達(dá)起調(diào)節(jié)作用 核酶RibozymeRNA有酶活性的RNA 2原核生物與真核生物啟動(dòng)子的主要差別？ 原核生物 TTGACA-TATAAT-起始位點(diǎn) -35-10 真核生物 增強(qiáng)子-GC-CAAT-TATAA5mGpp起始位點(diǎn) -110-70-25 3對(duì)天然質(zhì)粒的人工構(gòu)建主要表現(xiàn)在哪些方面？ 天然質(zhì)粒往往存在著缺陷，因而不適合用作基因工程的載體，必須對(duì)之進(jìn)行改造構(gòu)建： a、加入合適的選擇標(biāo)記基因，如兩個(gè)以上，易于用作選擇,通常是抗生素基因。 b、增加或減少合適的酶切位點(diǎn)，便于重組。 c、縮短長(zhǎng)度，切去不必要的片段，提高導(dǎo)入效率，增加裝載量。 d、改變復(fù)制子，變嚴(yán)緊為松弛，變少拷貝為多拷貝。 e、根據(jù)基因工程的特殊要求加裝特殊的基因元件 4舉例說(shuō)明差示篩選組織特異cDNA的方法？ 制備兩種細(xì)胞群體，目的基因在其中一種細(xì)胞中表達(dá)或高表達(dá)，在另一種細(xì)胞中不表達(dá)或低表達(dá)，然后通過(guò)雜交對(duì)比找到目的基因。 例如：在腫瘤發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中，腫瘤細(xì)胞會(huì)呈現(xiàn)與正常細(xì)胞表達(dá)水平不同的mRNA，因此，可以通過(guò)差示雜交篩選出與腫瘤相關(guān)的基因。也可利用誘導(dǎo)的方法，篩選出誘導(dǎo)表達(dá)的基因。 5雜交瘤細(xì)胞系的產(chǎn)生與篩選？ 脾B細(xì)胞+骨髓瘤細(xì)胞，加聚乙二醇（PEG）促進(jìn)細(xì)胞融合，HAT培養(yǎng)基中培養(yǎng)（內(nèi)含次黃嘌呤、氨基蝶呤、T）生長(zhǎng)出來(lái)的脾B-骨髓瘤融合細(xì)胞繼續(xù)擴(kuò)大培養(yǎng)。 細(xì)胞融合物中包含： 脾-脾融合細(xì)胞：不能生長(zhǎng)，脾細(xì)胞不能體外培養(yǎng)。 骨-骨融合細(xì)胞：不能利用次黃嘌呤，但可通過(guò)第二途徑利用葉酸還原酶合成嘌呤。氨基蝶呤對(duì)葉酸還原酶有抑制作用，因此不能生長(zhǎng)。 骨-脾融合細(xì)胞：在HAT中能生長(zhǎng)，脾細(xì)胞可以利用次黃嘌呤，骨細(xì)胞提供細(xì)胞分裂功能。 6、利用雙脫氧末端終止法（Sanger法）測(cè)定DNA一級(jí)結(jié)構(gòu)的原理與方法？ 原理是采用核苷酸鏈終止劑2，3，-雙脫氧核苷酸終止DNA的延長(zhǎng)。由于它缺少形成3/5/磷酸二脂鍵所需要的3-OH，一旦參入到DNA鏈中，此DNA鏈就不能進(jìn)一步延長(zhǎng)。根據(jù)堿基配對(duì)原則，每當(dāng)DNA聚合酶需要dNMP參入到正常延長(zhǎng)的DNA鏈中時(shí)，就有兩種可能性，一是參入ddNTP,結(jié)果導(dǎo)致脫氧核苷酸鏈延長(zhǎng)的終止；二是參入dNTP,使DNA鏈仍可繼續(xù)延長(zhǎng)，直至參入下一個(gè)ddNTP。根據(jù)這一方法，就可得到一組以ddNTP結(jié)尾的長(zhǎng)短不一的DNA片段。 方法是分成四組分別為ddAMP、ddGMP、ddCMP、ddTMP反應(yīng)后，聚丙烯酰胺凝膠電泳按泳帶可讀出DNA序列。 7、激活蛋白（CAP）對(duì)轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控作用？ 環(huán)腺苷酸（cAMP）受體蛋白CRP（cAMPreceptorprotein），cAMP與CRP結(jié)合后所形成的復(fù)合物稱(chēng)激活蛋白CAP（cAMPactivatedprotein）。當(dāng)大腸桿菌生長(zhǎng)在缺乏葡萄糖的培養(yǎng)基中時(shí)，CAP合成量增加，CAP具有激活乳糖（Lac）等啟動(dòng)子的功能。一些依賴(lài)于CRP的啟動(dòng)子缺乏一般啟動(dòng)子所具有的典型的-35區(qū)序列特征（TTGACA）。因此RNA聚合酶難以與其結(jié)合。 CAP的存在（功能）：能顯著提高酶與啟動(dòng)子結(jié)合常數(shù)。主要表現(xiàn)以下二方面： CAP通過(guò)改變啟動(dòng)子的構(gòu)象以及與酶的相互作用幫助酶分子正確定向,以便與-10區(qū)結(jié)合，起到取代-35區(qū)功能的作用。 CAP還能抑制RNA聚合酶與DNA中其它位點(diǎn)的結(jié)合，從而提高與其特定啟動(dòng)子結(jié)合的概率。 8、典型的DNA重組實(shí)驗(yàn)通常包括哪些步驟？ a、提取供體生物的目的基因（或稱(chēng)外源基因），酶接連接到另一DNA分子上（克隆載體），形成一個(gè)新的重組DNA分子。 b、將這個(gè)重組DNA分子轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞并在受體細(xì)胞中復(fù)制保存，這個(gè)過(guò)程稱(chēng)為轉(zhuǎn)化。 c、對(duì)那些吸收了重組DNA的受體細(xì)胞進(jìn)行篩選和鑒定。 d、對(duì)含有重組DNA的細(xì)胞進(jìn)行大量培養(yǎng)，檢測(cè)外援基因是否表達(dá)。 9、基因文庫(kù)的構(gòu)建對(duì)重組子的篩選舉出3種方法并簡(jiǎn)述過(guò)程。 抗生素抗性篩選、抗性的插入失活、蘭-白斑篩選或PCR篩選、差式篩選、DNA探針 多數(shù)克隆載體均帶有抗生素抗性基因（抗氨芐青霉素、四環(huán)素）。當(dāng)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌中后，該菌便獲得抗性，沒(méi)有轉(zhuǎn)入的不具有抗性。但不能區(qū)分是否已重組。 在含有兩個(gè)抗性基因的載體中，如果外源DNA片段插入其中一個(gè)基因并導(dǎo)致該基因失活，就可用兩個(gè)分別含不同藥物的平板對(duì)照篩選陽(yáng)性重組子。如pUC質(zhì)粒含LacZ基因（編碼半乳糖苷酶）該酶能分解生色底物X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖苷)產(chǎn)生藍(lán)色，從而使菌株變藍(lán)。當(dāng)外源DNA插入后，Lac