核酸純化的問題解答.doc

本來只打算將舊有的一些東西簡單整理一下貼上，現(xiàn)在看來，還是重新寫一些吧。舊的東西只適合使用人員，現(xiàn)在在許多論壇可以找到；這次寫的，涉及一些基礎(chǔ)一些的東西，產(chǎn)品開發(fā)人員也可以參考。下面是我肯定會講到的大的方面，發(fā)貼先后次序可能顛倒；如果大家對沒有涉及的方面感興趣，可以提出來，我會盡可能補充的。1：吸附柱技術(shù)簡介2：核酸抽提技術(shù)的比較3：常用總 RNA 抽提技術(shù)的評價4：常用基因組 DNA 抽提技術(shù)的評價5：常用片段純化技術(shù)的評價6：常用質(zhì)粒抽提技術(shù)的評價7：科研用核酸抽提技術(shù)的可能發(fā)展從 Ambion 公司的 RiboPure Kit 談起最近 Ambion 推出了一個產(chǎn)品：使用 TRI Reagent 裂解樣品的柱式總 RNA 抽提試劑盒。該產(chǎn)品被 Ambion 推薦為抽提 Microarray 用總 RNA 的首選。如果你知道 Ambion 已經(jīng)提供有 TRI Reagent 和不使用苯酚的柱式總 RNA 抽提試劑盒產(chǎn)品，會有什么想法？從 Ambion 勞民傷財?shù)靥峁┻@樣一個或傷財或既勞民又傷財?shù)漠a(chǎn)品，可以看出經(jīng)典類的 TRI Reagent 抽提和不使用苯酚的柱式抽提方法，都是有一些不足的：經(jīng)典的 TRI Reagent 方法，長于去除蛋白質(zhì)，短于去除了蛋白質(zhì)以后的純化；不使用苯酚的柱式方法，長于去除了蛋白質(zhì)以后的操作，卻短于去除蛋白質(zhì)。經(jīng)典方法和柱式方法各自的不足，不僅僅存在于 RNA 抽提，也不是不可克服的。實際上，絕大部分使用人員都可以使用過去的方法獲得比較滿意的結(jié)果。以后我要展開的，可以成為順利者自我表揚和不順者自我檢討的素材。天助自助者！附：TRIzol 操作解析1：樣品的裂解 - 根據(jù)你的樣品，選擇一個使用方法。A： 組織的裂解 方法 a：加入 TRIzol，用玻璃勻漿器 (少量的可以使用 Pellet Pestle) 將組織徹底勻漿。將勻漿液移入離心管中。方法 b：液氮冷凍條件下將組織搗碎成粉末。在液氮完全揮發(fā)前，將搗碎的組織移入已經(jīng)加入了 TRIzol 的離心管中，立即用移液器吹打混勻。B： 細胞的裂解a：( 懸浮培養(yǎng)細胞 ) 300 x g 離心 5 分鐘后徹底棄上清。加入 TRIzol，立即用移液器吹打以徹底混勻。b：( 貼壁培養(yǎng)細胞 ) 將培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)液徹底棄干凈。將 TRIzol 直接加在培養(yǎng)皿中的細胞上。立即用移液器吹打使細胞脫壁后，將裂解液移入離心管中。C： 人血液的裂解先低速離心或者使用其它方法獲得白細胞，再按照懸浮培養(yǎng)細胞操作。 下面是 1 ml TRIzol 可以裂解的樣品最大量。你可以根據(jù)你的具體樣品量增加或者減少 TRIzol 的用量，但 TRIzol 的最小用量建議不低于 0.8 ml：動物組織的裂解：最大起始量 30 - 100 mg。(高核酶/核酸含量的、高脂肪含量的動物組織；最大起始量 30 - 50 mg，其它的動物組織，最大起始量 50 - 100 mg。)懸浮培養(yǎng)細胞的裂解：最大起始量 5 - 10 x 106。貼壁培養(yǎng)細胞的裂解：如果是直接在培養(yǎng)器皿中裂解，不管細胞數(shù)量是多少，最大起始量為 10 cm2。如果使用機械或者酶消化使細胞脫壁收集后再裂解，則按懸浮培養(yǎng)細胞對待。使用 TRIzol LS Reagent 更經(jīng)濟、可靠。人全血的裂解：先獲得白細胞，再按照懸浮培養(yǎng)細胞操作。植物組織的裂解：最大起始量 100 mg，使用方法 b 裂解。 如果同時要抽提多個樣品，為防止 RNA 降解，正確的操作是：一次取出一個樣品，徹底勻漿后，置于冰上；再取出一個樣品，同樣處理，直到所有樣品全部徹底勻漿。再同步進行下一步操作。 操作必須非?？焖伲拍艽_保 RNA 不被降解。另外，樣品量一定不要超過許可的范圍，否則將導(dǎo)致一系列問題。 如果同時要抽提 RNA 和 DNA，不能使用電動勻漿器勻漿。用注射器抽打裂解物能幫助裂解，提高得率。但如果同時要抽提長片段基因組 DNA，則不能使用注射器抽打。2：根據(jù)樣品，選擇使用方法 A 或者方法 B。如果不確定，則使用方法 B。A (細胞，血液，一般動物組織) - 室溫靜置 5 分鐘。再按照 1 ml TRIzol 使用 200 ul 的比例加入氯仿，用力顛倒離心管以混勻。室溫靜置 2 - 15 分鐘使之分層后，4OC 12,000 x g 離心 15 分鐘。B (植物，脂肪及肝臟等某些雜質(zhì)含量較高的樣品) - 室溫靜置 5 分鐘后，4OC 12,000 x g 離心 10 分鐘，將上清移入另外一個離心管中。再按照 1 ml TRIzol 使用 200 ul 的比例加入氯仿，用力顛倒離心管以混勻。室溫靜置 2 - 15 分鐘使之分層后，4OC 12,000 x g 離心 15 分鐘。 4C 離心對于降低基因組 DNA 的污染是很重要的。 雜質(zhì)含量高的樣品一定要使用 2-B 操作。2-B 操作不僅可以將大部分雜質(zhì)離心去除，也可以將大片段的基因組 DNA 離心去除，方便加入氯仿后的分層，所以沒有什么壞處。不過，如果想同時抽提總 RNA 和基因組 DNA，則還是要使用 2-A 操作。 加入氯仿后的混勻是非常重要的，否則會導(dǎo)致一系列的問題。不推薦振蕩混勻，而推薦直接用手混勻：將管底斜向朝上，手斜向快速搖動，使體系成粉色乳狀。3： 小心將上層水相移至另外一個離心管中，再加入等體積異丙醇，混勻。室溫放置 5 - 10 分鐘。中間層和紅色下層置于 4C 保存，以便接下去抽提基因組 DNA。 取上層水相時要特別小心，絕對不要吸入白色中間層及紅色下層。移取水相時要使用小體積移液器：200ul 移液器，Tip 的尖嘴要貼在管壁，并且盡可能接近液面，慢慢松手吸出液體。 如果是尖底離心管，可以用下面的方法獲得更多干凈的水相：將移液器小心深入離心管底，輕輕地將盡可能多的下層吸入。將離心管置于離心機中高速離心 5 分鐘后，再小心將水相吸出。 對于脂肪類組織，包括腦組織，在上清的最上層為脂肪，取上清時不要吸入。必要時用等體積氯仿對上清再抽提一次。 如果是雜質(zhì)含量高的樣品，強烈建議將此步操作改為：在上清中加入一半體積的異丙醇，混勻后，再加入一半 (指上清) 體積的 RNA 沉淀試劑 (1.2M NaCl，0.8M 檸檬酸鈉)。再混勻后，室溫放置 5 10 分鐘。4：4C 12,000 x g 離心 5 - 10 分鐘。小心地徹底棄上清。 如果離心后看不見沉淀，則置于 4oC 放置 10 30 分鐘后再離心。 改用 7,500 x g 離心 5 分鐘能改善質(zhì)量，但會少量降低產(chǎn)量。室溫離心對質(zhì)量不會有任何影響，相反，對雜質(zhì)含量高的樣品，室溫離心更有利于降低雜質(zhì)。 棄上清后，將離心管置于離心機中離心數(shù)秒，再用移液器將殘留液體小心吸出。這是最徹底的去除上清的方法，比倒掉上清后再將離心管倒扣在吸水紙上的方法可靠得多。如果是雜質(zhì)含量高的樣品，強烈建議增加此步操作。如果肉眼看不見沉淀，則不要用移液器吸。5：在離心管中按照 1 ml TRIzol 使用至少 1 ml 的比例加入室溫的 75 乙醇，來回顛倒離心管混勻并將沉淀懸浮起來。室溫 7,500 x g 離心 5 分鐘。小心地徹底棄上清。 務(wù)必使沉淀懸浮起來，以確保洗滌干凈。如果沉淀比較大，室溫靜置 5 分鐘再離心。 改用洗滌兩次，對改善質(zhì)量大有幫助，尤其是當(dāng)沉淀比較大時。 強烈建議最后一次洗滌棄上清后，將離心管置于離心機中離心數(shù)秒，再用移液器將殘留液體小心吸出。既可縮短干燥時間，還有助于改善質(zhì)量。如果肉眼看不見沉淀，則不要用移液器吸。6：室溫靜置 5 -15 分鐘使 RNA 沉淀恰好干燥。溶解后，70C 保存。下面的內(nèi)容，可以在其它地方看到；數(shù)年來有了一些補充，不過沒有再以集中的方式發(fā)布。今天發(fā)布的，也只是沒有詳細點評的版本，只怕會給人一種 RNA 抽提是非常困難的印象。在看下面的東西之前，請牢記一點：實際的操作比我描述的要/或者說可以簡化許多。但化繁為簡的成功與否，則取決于你對“繁”的把握程度了。有空時我會補充一些點評，那將是一些我們實際使用的操作手法，估計大家會更感興趣。RNA 抽提之應(yīng)知應(yīng)會 背景介紹 對大部分實驗人員來說，RNA 抽提比基因組 DNA 抽提要困難得多。事實上，現(xiàn)有的 RNA 抽提方法/試劑，如果用于從培養(yǎng)細胞中抽提 RNA，比抽提基因組 DNA 更方便，成功率也更高。那為什么同樣的方法用于組織 RNA 的抽提，總會碰到問題呢？ 組織 RNA 抽提失敗的兩大現(xiàn)象是：RNA 降解和組織內(nèi)雜質(zhì)的殘留。關(guān)于降解問題，首先看一下為什么從培養(yǎng)細胞中抽提 RNA 不容易降解?，F(xiàn)有的 RNA 抽提試劑，都含有快速抑制 Rnase 的成分。在培養(yǎng)細胞中加入裂解液，簡單的混勻，即可使所有的細胞與裂解液充分混勻，細胞被徹底裂解。細胞被裂解后，裂解液中的有效成分立即抑制住細胞內(nèi)的 Rnase，所以 RNA 得以保持完整。也就是說，培養(yǎng)細胞由于很容易迅速與裂解液充分接觸，所以其 RNA 不容易被降解；反過來講，組織中的 RNA 之所以容易被降解，是因為組織中的細胞不容易迅速與裂解液充分接觸所致。因此，假定有一種辦法，在抑制 RNA 活性的同時能使組織變成單個細胞，降解問題也就可以徹底解決了。液氮碾磨就是最有效的這樣一種辦法。但是，液氮碾磨方法非常麻煩，如果碰到樣品數(shù)比較多的時候更加會有此感覺。這樣就產(chǎn)生了退而求其次的方法：勻漿器。勻漿器方法沒有考慮細胞與裂解液接觸前如何抑制 Rnase 活性這個問題，而是祈禱破碎組織的速度比細胞內(nèi)的 Rnase 降解 RNA 的速度快。電動勻漿器效果較好，玻璃勻漿器效果較差，但總的來說，勻漿器方法是不能杜絕降解現(xiàn)象的。因此，如果抽提出現(xiàn)降解，原來用電動勻漿器的，改用液氮碾磨；原來用玻璃勻漿器的，改用電動勻漿器或者直接用液氮碾磨，問題幾乎 100% 能獲得解決。影響后續(xù)實驗的雜質(zhì)殘留問題，其原因比降解更多樣，解決方法相應(yīng)也不同?？傊?，如果出現(xiàn)降解現(xiàn)象或者組織內(nèi)雜質(zhì)殘留現(xiàn)象，則必須對具體實驗材料的抽提方法/試劑進行優(yōu)化。優(yōu)化大可不必使用你的寶貴樣品：可以從市場上購買一些魚/雞之類的小動物，取相應(yīng)部分的材料用于 RNA 抽提，其它部分用于抽提蛋白質(zhì) - 用嘴碾磨，腸胃抽提。 究竟怎樣才能確保 RNA 抽提的成功率呢？實驗前選擇合適的方法/試劑，這是最重要的一步；好的方法/試劑在確保成功的同時，操作方便，經(jīng)濟實用。當(dāng)然，你的選擇可能仍然有問題，這就需要能正確分析實驗失敗的原因，以便改進。實驗前方法/試劑的選擇 0：抽提 RNA 的目的 RNA 用于不同的后續(xù)實驗，其質(zhì)量要求不盡相同。cDNA 文庫構(gòu)建要求 RNA 完整而無酶反應(yīng)抑制物殘留；Northern 對 RNA 完整性要求較高，對酶反應(yīng)抑制物殘留要求較低；RT-PCR 對 RNA 完整性要求不太高，但對酶反應(yīng)抑制物殘留要求嚴格。投入決定產(chǎn)出；每次都以獲得最高純度的 RNA 為目的，勞民傷財。 1：樣品的收集/保存 - 影響降解的因素 樣品離開活體/或者原來的生長環(huán)境后，樣品中的內(nèi)源酶即會開始降解 RNA，降解速度與內(nèi)源酶含量及溫度有關(guān)。傳統(tǒng)上，只有兩個辦法可以徹底抑制內(nèi)源酶活性：1 - 立即加入裂解液并且徹底而迅速地勻漿；2 - 切成小塊后立即投入液氮冷凍。后者適合所有的樣品，而前者只適合細胞及內(nèi)源酶含量較低的并且較容易勻漿的組織。象植物組織，肝臟，胸腺，胰腺，脾臟，腦，脂肪，肌肉組織等，不是內(nèi)源酶含量高，就是不容易勻漿，所以最好都先用液氮冷凍起來，再往下做。樣品冷凍保存的正確處理方法為：將樣品從活體上取下，迅速切割小后，立即放入液氮中速凍。再移入 -70C 冰箱或者直接放在液氮罐保存。樣品不經(jīng)過液氮冷凍而直接放入 -70C 冰箱保存，RNA 有被降解的風(fēng)險。經(jīng)過裂解液徹底勻漿的樣品，可以在 -20C 冰箱中保存一個月左右。(我們的實驗顯示，這樣保存的樣品，完整性沒有任何問題，但得率似乎下降了一些。)液氮保存及立即勻漿都有各自的缺陷：立即勻漿的問題：樣品不適合直接勻漿，采集樣品的場所不允許做實驗。液氮保存的問題：沒有液氮，不能將液氮帶入采集樣品的場所，液氮保存樣品的抽提操作很麻煩等。2：樣品的破碎及勻漿 - 影響降解和得率的因素 樣品的粉碎是為了徹底勻漿，勻漿是為了使 RNA 徹底完整地釋放出來。一般講來，細胞無須粉碎即可直接勻漿，組織需要破碎后才能勻漿，酵母菌和細菌需要先用相應(yīng)的酶破壁后才能勻漿。內(nèi)源酶含量較低并且較容易勻漿的組織可以在裂解液中通過勻漿器一次完成破碎和勻漿過程；植物組織，肝臟，胸腺，胰腺，脾臟，腦，脂肪，肌肉組織等樣品，它們不是內(nèi)源酶含量高，就是不容易勻漿，所以必須將組織的粉碎和勻漿分開操作。最可靠而且得率最高的破碎方法是使用液氮的碾磨，最可靠的勻漿方法是使用電動勻漿器。使用液氮碾磨要特別注意一點：在整個碾磨過程中，樣品不得融化，因為冷凍過的樣品內(nèi)必定形成冰晶，破壞了細胞內(nèi)部的結(jié)構(gòu)，使其內(nèi)源酶更容易起作用。現(xiàn)有的 RNA 抽提試劑，都含有快速抑制 Rnase 的成分。在培養(yǎng)細胞中加入裂解液，簡單的混勻，即可使所有的細胞與裂解液充分混勻，細胞被徹底裂解。細胞被裂解的同時，裂解液中的有效成分立即抑制住細胞內(nèi)的 Rnase，所以 RNA 得以保持完整。也就是說，培養(yǎng)細胞由于很容易迅速與裂解液充分接觸，所以其 RNA 不容易被降解；反過來講，組織中的 RNA 之所以容易被降解，是因為組織中的細胞不容易迅速與裂解液充分接觸所致。因此，假定有一種辦法，在抑制 RNase 活性的同時能使組織變成單個細胞，降解問題也就可以徹底解決了。液氮碾磨就是最有效的這樣一種辦法。但是，液氮碾磨方法非常麻煩，如果碰到樣品數(shù)比較多的時候更加會有此感覺。這樣就產(chǎn)生了退而求其次的方法：勻漿器。勻漿器方法沒有考慮細胞與裂解液接觸前如何抑制 Rnase 活性這個問題，而是祈禱粉碎組織的速度比細胞內(nèi)的 RNase 降解 RNA 的速度快。電動勻漿器效果較好，玻璃勻漿器效果較差，但總的來說，勻漿器方法是不能徹底杜絕降解現(xiàn)象的。因此，如果抽提出現(xiàn)降解，原來用電動勻漿器的，改用液氮碾磨；原來用玻璃勻漿器的，改用電動勻漿器或者直接用液氮碾磨，問題幾乎 100% 能獲得解決。帶針頭的一次性注射器是一個非常有用的工具。與玻璃允漿器相比，它有三大優(yōu)點：非常方便；允漿更徹底；可以更好地打斷基因組 DNA，從而降低裂解液黏度。強烈建議在抽提 RNA 前準備一些一次性注射器，以便在實驗過程中，一旦發(fā)現(xiàn)裂解液體系較為粘稠，可以及時解決。3：裂解液的選擇 - 影響操作方便程度，內(nèi)源雜質(zhì)殘留的因素 常用的裂解液幾乎都能抑制 Rnase 活性，因此，選擇裂解液的重點是要結(jié)合純化方法一起考慮。只有一個例外：高內(nèi)源酶含量的樣品建議使用含苯酚的裂解液，以增加滅活內(nèi)源酶的能力。 4：純化方法的選擇 - 影響內(nèi)源雜質(zhì)殘留，抽提速度的因素 對于干凈的樣品，如細胞，手邊的幾乎任何純化方法都可以獲得滿意的結(jié)果。但對于許多其它樣品，尤其是植物，肝臟，細菌等雜質(zhì)含量很高的樣品，選擇合適的純化方法是至關(guān)重要的。柱離心式純化方法抽提速度快，能有效去除影響 RNA 后續(xù)酶反應(yīng)的雜質(zhì)，但價格較貴；使用經(jīng)濟而經(jīng)典的純化方法，如 LiCl 沉淀等，也可以獲得滿意的結(jié)果，但操作時間長。 RNA 質(zhì)量的判斷1: 完整性的判斷通常，使用電泳判斷 RNA 的完整性。理論上，完整的 RNA 擁有 28S:18S = 2.6:1 左右的比例 (即分子量之比)，而大部分資料則強調(diào) 28S:18S = 2:1 的比例。事實是，除了細胞外，從其它樣品中抽提的 RNA 幾乎很難得到 2:1 的比例，原因是大分子 rRNA 的二級及三級結(jié)構(gòu)程度更高，所以較之小分子 rRNA 更容易降解；當(dāng) 28S 有相當(dāng)程度的降解時， 18S (包括 mRNA) 卻相當(dāng)完整。(此結(jié)論是 Ambion 公司使用 Agilent Bioanalyzer 獲得)。使用電泳準確評估 28S:18S 比例并不容易，因為 RNA 的電泳結(jié)果受許多因素的影響，包括二級結(jié)構(gòu)，電泳條件，上樣量，被 EB 飽和的程度等。另外，即使來自不同器官的組織，在確定其 mRNA 沒有降解的前提下，其比例也有區(qū)別 （如肝/肺的比例較低）。可以說，2:1 是高質(zhì)量的標(biāo)準，但低于 2:1 并不就是質(zhì)量低。非變性電泳能用于檢測，但問題是：RNA 的二級結(jié)構(gòu)改變了泳動方式，使之不按真實大小泳動；同時，條帶不夠緊密，甚至出現(xiàn)多條帶。變性電泳能解決這些問題，但作為一般的檢測方法有些煩瑣。使用非變性電泳檢測 RNA，當(dāng)用 1.0 - 1.2% 的進口品牌 Agarose 電泳，以 DNA Marker 做對照，28S 和 18S 條帶分別在 2kb 和 0.9kb 左右；更簡單地，直接使用含溴酚藍和二甲苯青指示劑的上樣液，28S 和 18S 條帶正好處于兩種指示劑之間。如果 28S 和 18S 條帶清晰，且 28S:18S 1，該完整性可以滿足絕大部分后續(xù)實驗要求了。2: 純度的判斷通常，使用 A260/A280 判斷 RNA 的純度。A260/A280 是一個給大家?guī)碓S多困惑的指標(biāo)。首先要明確該指標(biāo)用于核酸的原始含義是：純的 RNA，其 A260/A280 = 2.0 左右。純 RNA 是因，A260/A280 = 2 是果。現(xiàn)在大家卻在拿 A260/A280 當(dāng)因用，認為“如果 A260/A280 = 2，所以 RNA 是純的”，自然會產(chǎn)生困惑。有興趣的話，可以在你的 RNA 樣品中加入一點抽提中經(jīng)常使用的試劑，如苯酚，異硫氰酸胍，PEG 等，再測 A260/A280 比值?，F(xiàn)實是，許多抽提 RNA 時使用的試劑，以及樣品中的許多雜質(zhì)都在 A260 和 A280 處附近有吸收，對 A260/A280 產(chǎn)生影響。目前最具有指導(dǎo)性的做法是：對 RNA 樣品在 200-300 nm 范圍掃描。純 RNA 的曲線具有如下特點：曲線平滑，A230 和 A260 是兩個拐點，A300 接近 0，A260/A280 = 2 左右，A260/A230 = 2 左右，A260/A215 = 1 左右。如果沒有掃描數(shù)據(jù)，除了測定 A260/A280 比值外，也一定要測定 A260/A230 比值，因為該比值對所有影響酶反應(yīng)的雜質(zhì)的殘留更敏感。另外，要考慮設(shè)備的線形范圍 (如 A260 要處于 0.1 - 0.5 之間)，超出線形范圍的讀數(shù)沒有太大參考價值的。另外有兩個有趣的現(xiàn)象：在水中測定 A260/A280，比值將變低 0.3 左右；而在 10mM EDTA 中測定的比值比在 1mM EDTA 中測定的高 0.2 左右。3: 小結(jié)28S:18S 1 的完整性是能滿足絕大部分實驗要求的，而且對絕大部分實驗來說，純度比完整性更重要，因為絕大部分的后續(xù)實驗是酶反應(yīng)。殘留的有機物，金屬離子，酶等將對后續(xù)酶反應(yīng)產(chǎn)生巨大的影響。下面的實驗是非常簡單實用的：RNA 樣品 37oC 溫浴 2 小時后，與未溫浴的 RNA 同時電泳。如果溫浴后 RNA 降解超過 20%，樣品則可能不適合后續(xù)的酶反應(yīng)。總之，高完整性，低雜質(zhì)含量的 RNA 稱為高質(zhì)量的 RNA。在實際工作中，根據(jù) RNA 用于不同的后續(xù)實驗，其質(zhì)量要求也不盡相同。cDNA 文庫構(gòu)建要求 RNA 完整而無酶反應(yīng)抑制物殘留；Northern 對 RNA 完整性要求較高，對酶反應(yīng)抑制物殘留要求較低；RT-PCR 對 RNA 完整性要求不太高，即使有相當(dāng)程度的降解也可以接受，但對酶反應(yīng)抑制物殘留要求嚴格。因此，根據(jù)你的后續(xù)實驗要求選擇合適的抽提方法和試劑，將注意力集中于控制影響你后續(xù)實驗的因素上，自然能獲得事半功倍的效果。特殊組織的抽提 纖維組織：心臟/骨骼肌等纖維組織抽提 RNA 關(guān)鍵在徹底破碎組織。這些組織細胞密度低，故單位重量的組織 RNA 的含量就少，最好用盡可能多的起始量。一定要在冷凍條件下將組織徹底磨碎。 蛋白/脂肪含量高的組織：腦/植物脂肪含量高，PCI 抽提后，上清含白色絮狀物。必須用氯仿再次對上清進行抽提。 核酸/核酶含量高的組織：脾/胸腺等核酸和核酶含量很高。在冷凍條件下碾磨組織，再快速勻漿，能有效滅活核酶。但如果裂解液太粘稠 (因為核酸含量高的緣故)，PCI 抽提不能有效分層；加入更多裂解液可以解決此問題。多次PCI抽提可以去除更多殘留的 DNA。如果加入醇后馬上有白色沉淀形成提示有 DNA 污染。溶解后用酸性 PCI 再次抽提，可以去除 DNA 污染。 植物組織：植物組織比動物組織更為復(fù)雜。一般，大家都是在液氮條件下對植物進行碾磨的，所以內(nèi)源酶作用使 RNA 降解的現(xiàn)象不常見。如果降解問題不能解決，幾乎可以肯定是樣品中的內(nèi)含雜質(zhì)導(dǎo)致。許多植物的內(nèi)含雜質(zhì)都會導(dǎo)致殘留，之所以殘留，往往是因為這些雜質(zhì)與 RNA 有一些相似性：你沉淀我沉淀，你吸附我吸附。這些特點決定了它們是非常強的酶抑制劑。目前，商品化的 RNA 抽提試劑經(jīng)過小量調(diào)整，可以適合幾乎所有的動物組織，但卻沒有一種商品化的 RNA 抽提試劑，可以適合大部分植物組織。RNA 抽提的“三大紀律八項注意” 紀律一：杜絕外源酶的污染。 注意一：嚴格戴好口罩，手套。 注意二：實驗所涉及的離心管，Tip 頭，移液器桿，電泳槽，實驗臺面等要徹底處理。 注意三：實驗所涉及的試劑/溶液，尤其是水，必須確保 RNase-Free。 紀律二：阻止內(nèi)源酶的活性 注意四：選擇合適的勻漿方法。 注意五：選擇合適的裂解液。 注意六：控制好樣品的起始量。 紀律三：明確自己的抽提目的 注意七：任何裂解液系統(tǒng)在接近樣品最大起始量時，抽提成功率急劇下降。 注意八：RNA 抽提成功的唯一經(jīng)濟的標(biāo)準是后續(xù)實驗的一次成功，而不是得率。 RNase 污染的10大來源 1：手指頭 - 手指頭是外源酶的第一來源，所以必需戴手套并且頻繁更換。另外，口罩也必需戴，因為呼吸也是一個重要的酶來源。戴手套口罩的另外的好處是保護實驗人員。 2：槍頭，離心管，移液器 - 單純的滅菌是不能滅活 Rnase 的，所以槍頭和離心管要用 DEPC 處理，即使是標(biāo)明為 DEPC 處理過的。移液器最好是專用的，用前用 75% 的酒精棉球搽拭干凈，尤其是桿子；另外，一定不要使用褪頭器褪頭。 3：水/緩沖液 - 一定要確保無 Rnase 污染。 4：實驗臺面 - 最起碼要用 75% 的酒精棉球搽拭干凈。 5：內(nèi)源 Rnase - 所有組織均含內(nèi)源酶，故組織用液氮速凍是降低降解的最好辦法。液氮保存/碾磨方法的確不方便，但對有一些內(nèi)源酶含量很高的組織，卻是唯一的辦法。 6：RNA 樣品 - RNA 抽提產(chǎn)物可能都會含痕量的 Rnase 污染。 7：質(zhì)粒抽提 - 質(zhì)粒抽提往往用到 Rnase 降解 RNA，殘留的 Rnase 要用 Proteinase K 消化，PCI 抽提。 8：RNA 保存 - 即使低溫保存，痕量的 Rnase 亦會導(dǎo)致 RNA 降解。長期保存 RNA 的最好辦法是鹽/醇懸液，因為醇在低溫時抑制所有的酶活性。 9：陽離子 (Ca, Mg) - 在含這些離子時，80C 加熱 5 分鐘會導(dǎo)致 RNA 被剪切，故如果 RNA 需要被加熱，保存液需要含螯合劑 (1mM Sodium Citrate, pH 6.4)。 10：后續(xù)實驗所用的酶 - 酶均有可能被 Rnase 污染。 RNase 和 DEPC 處理 1：高壓滅菌是可以滅活部分 Rnase A 的。實驗證明：37 C 與 RNA 反應(yīng)，沒有滅菌的 PBS，活性點為 100 pg/ml；滅菌后，活性點為 100 ng/ml。當(dāng)然，滅菌后 Rnase 仍然不能認為沒有殘留。 2：DEPC 在水中半衰期為 30 分鐘。0.1% 的 DEPC 滅菌 15 分鐘可以認為徹底破壞了 DEPC。破壞后可以聞到一點氣味。 3：在1M Tris, 1M HEPES, 1M MOPS 中分別加入 1ug/ml Rnase A 和 0.1% 及 1% DEPC 實驗。結(jié)果提示，0.1% DEPC 只對 MOPS 有效，而 1% DEPC 對三種試劑都有效。 4：0.01% DEPC，0.1% DEPC，1% DEPC 有效去除 Rnase A的濃度分別為：100 ng/ml，500ng/ml，1 ug/ml。但要注意，DEPC 滅活后的副產(chǎn)品，對有些后續(xù)實驗是有影響的。 RNA 抽提的10大竅門 1：快速阻止 Rnase 活性 - 樣品收集后快速冷凍，裂解時快速操作滅活 Rnase。 2：選擇合適的抽提方法 - 高核酶含量的組織，脂肪組織最好用含苯酚的方法。 3：預(yù)判質(zhì)量要求 - Northern，cDNA 文庫構(gòu)建對完整性要求高，RT-PCR, RPA (Ribonuclease protection assay) 對完整性要求不是很高。RT-PCR 對純度 (酶抑制物殘留) 要求很高。 4：徹底勻漿是提高得率和降低降解的關(guān)鍵。 5：檢查 RNA 的完整性 - 電泳檢測，28S:18S =2:1 是完整的標(biāo)志，1:1 對大部分實驗也是可以接受的。 6：去除 DNA - 用于 RT-PCR, array analysis 最好用 Dnase I 去除 DNA。 7：降低外源酶的污染 - 不能從外面又導(dǎo)入酶。 8：低濃度的核酸濃縮時，要加入助沉淀試劑。但要防止助沉淀劑含酶及 DNA 污染。 9：徹底溶解 RNA，必要時可以 65C 加熱 5 分鐘。 10：合適的保存方法 - 短時間可以 -20C 保存，長期請保存于 -70C 以下2：核酸純化技術(shù)的比較目前在科研領(lǐng)域廣泛使用的核酸純化技術(shù)主要可以分為兩大類：使用介質(zhì)的和不使用介質(zhì)的。使用介質(zhì)的可以分為兩類：離子交換介質(zhì)和吸附介質(zhì)。不使用介質(zhì)的也分為兩類：使用苯酚/氯仿抽提的和不使用苯酚/氯仿抽提的。核酸抽提過程可以簡單看成兩步：樣品的裂解和核酸的純化。裂解相對是非常成熟的，無論后面采用什么純化技術(shù)，總能找到合適的裂解液。裂解完成后，液體體系中就包括了游離的核酸、蛋白質(zhì)及其它大分子雜質(zhì)、鹽：純化就是將核酸與其它游離成分分離的過程。純化過程，使用介質(zhì)的，一次就將核酸與其它所有雜質(zhì)分開；不使用介質(zhì)的，一定是首先將核酸和鹽與大分子雜質(zhì)分開 (請思考原因！)，再通過沉淀核酸使核酸與鹽分開 (PEG 沉淀和 LiCl 沉淀除外)。下面比較一下具體的純化技術(shù)：A：經(jīng)典的使用苯酚/氯仿抽提的純化技術(shù)使用苯酚/氯仿抽提去除蛋白質(zhì)。在去除了蛋白質(zhì)的上清中加入乙醇或者異丙醇，核酸將以沉淀狀態(tài)出現(xiàn)，而鹽仍然處于溶解狀態(tài)。離心后將上清倒掉，實現(xiàn)了核酸與鹽的分離。殘留的鹽使用 70-80% 乙醇洗滌去除，最后獲得的干凈的核酸用少量低鹽緩沖液溶解。該方法去除蛋白質(zhì)的能力非常強，但最終蛋白質(zhì)的殘留量取決于取上清的操作。去除鹽的能力也非常強，但能否去除干凈，同樣與操作大大有關(guān)。該方法的另外一大特點是：即使樣品裂解不足，也可以獲得高純度的核酸。B：經(jīng)典的不使用苯酚/氯仿抽提的純化技術(shù)該技術(shù)與使用苯酚/氯仿抽提的純化技術(shù)的區(qū)別，主要在去除蛋白質(zhì)方法上。該技術(shù)使用的一般是高鹽沉淀方法去除蛋白質(zhì)，操作簡單，但去除蛋白質(zhì)徹底程度不如苯酚/氯仿抽提。質(zhì)粒的 SDS 堿裂解法，詮釋了上面兩個經(jīng)典的核酸純化技術(shù)優(yōu)缺點的。菌體經(jīng)過裂解、中和后離心，蛋白質(zhì)被去除。上清中加入乙醇/異丙醇將質(zhì)粒沉淀下來后，經(jīng)過洗滌、干燥，最后用 TE 將質(zhì)粒溶解。這是用典型的不使用苯酚/氯仿抽提的純化技術(shù)純化的核酸，此時的質(zhì)?？梢杂糜诤罄m(xù)的酶切。但實際操作中發(fā)現(xiàn)，這樣抽提的質(zhì)粒并不能穩(wěn)定地用于酶切；在上清沉淀之前增加一步苯酚/氯仿抽提，大大提高了質(zhì)粒用于酶切的穩(wěn)定性。C：使用離子交換介質(zhì)的純化技術(shù)將裂解液過柱，核酸被聯(lián)結(jié)在離子交換介質(zhì)上；洗滌去除殘留的雜質(zhì)后，用高鹽緩沖液將核酸從介質(zhì)上洗脫下來。再經(jīng)過標(biāo)準的乙醇/異丙醇沉淀、乙醇洗滌、干燥等操作，獲得純的核酸，溶解于合適的緩沖液中。在這四種純化技術(shù)中，使用離子交換介質(zhì)的純化技術(shù)，去除大分子雜質(zhì)的能力最強，所以是獲得最高純度核酸的首選技術(shù)。其缺點是操作時間長，不太適合日常實驗要求。D：使用吸附介質(zhì)的純化技術(shù)將裂解液過柱，核酸被吸附介質(zhì)選擇性吸附；洗滌去除殘留的雜質(zhì)后，用水或者合適的低鹽緩沖液將核酸從介質(zhì)上洗脫下來，就可以直接用于后續(xù)實驗。在這四種純化技術(shù)中，使用吸附介質(zhì)的純化技術(shù)，去除大分子雜質(zhì)的能力不如 C (去除蛋白質(zhì)的能力甚至不如 A)，使用成本不如 A 和 B。但其最大的優(yōu)點 - 操作速度快、對操作技術(shù)要求低、重復(fù)性