RNA提取及反轉(zhuǎn)錄合成cDNA具體實(shí)驗(yàn)步驟.doc

RNA提取及反轉(zhuǎn)錄合成cDNA具體實(shí)驗(yàn)步驟由 楊盛 于 2011/6/8 12:56 創(chuàng)建 一、RNA提取前的準(zhǔn)備RNA制備的關(guān)鍵是要抑制細(xì)胞中的RNA分解和防止所用器具及試劑中的RNA分解酶的污染。因此，在實(shí)驗(yàn)中必須采取以下措施：1、戴一次性手套；2、使用RNA操作專用實(shí)驗(yàn)臺(tái)；3、在操作過程中避免講話等。通過以上辦法可以防止實(shí)驗(yàn)者的汗液、唾液中的RNA分解酶的污染。二、使用器具盡量使用一次性塑料器皿，若用玻璃器皿，應(yīng)在使用前按下列方法進(jìn)行處理：1、用0.1%DEPC水溶液在37下處理12小時(shí)，2、然后在120下高溫滅菌30min以除去殘留的DEPC，（ RNA實(shí)驗(yàn)用的器具建議專門使用，不要用于其他實(shí)驗(yàn)。）三、 試劑配制用于RNA實(shí)驗(yàn)的試劑，須使用干熱滅菌（180，60min）或使用上述方法進(jìn)行DEPC水處理滅菌后的玻璃容器盛裝（也可以使用RNA實(shí)驗(yàn)用的一次性塑料容器），使用的無菌水需用0.1%的DEPC處理后再進(jìn)行高溫高壓滅菌。RNA實(shí)驗(yàn)用的試劑和無菌水都應(yīng)專用，避免混用后交叉污染。四、實(shí)驗(yàn)操作在研磨樣品前，先把所要用到的試劑和槍頭、研缽（未拆開報(bào)紙）放在超凈工作臺(tái)上，打開紫外燈照射20-30min殺菌。1. 50-100mg的普通組織樣品：RNAiso Plus 1ml2. 試驗(yàn)樣品的研磨和勻漿（1）將超低溫凍結(jié)的RNA提取樣品稱量后迅速轉(zhuǎn)移至用液氮預(yù)冷的研缽中，用研缽研磨組織，其間不斷加入液氮，直至研磨成粉末狀（無明顯的課件顆粒，如果沒有研磨徹底會(huì)影響RNA的收率和質(zhì)量）。（研磨好的樣品立即加入 RNAiso Plus）（2）對(duì)于普通的RNA提取樣品，可以向研缽中加入適量的RNAiso Plus，將研磨成粉末狀的樣品完全覆蓋，然后室溫靜置，直至樣品完全融化，再用研杵繼續(xù)研磨至裂解液呈透明狀。（3）將勻漿液轉(zhuǎn)移至離心管中，室溫靜置5min。（4）12000g 4離心5min。（5）小心吸取上清液，移入新的離心管中（切勿吸取沉淀）。3.Total RNA 的提取（加入RNAiso Plus 后，靜置5min，離心轉(zhuǎn)移上清，避免未破碎的雜蛋白污染）（1）向上述步驟2的勻漿裂解液中加入氯仿（RNAiso Plus 的1/5體積量），蓋緊離心管蓋，用手劇烈振蕩15s（氯仿沸點(diǎn)低，易揮發(fā)，振蕩時(shí)應(yīng)小心離心管突然彈開）。待溶液充分乳化（無分相現(xiàn)象）后，再室溫靜置5min。（2）12000 g 4 離心15min。（3）從離心機(jī)中小心取出離心管，此時(shí)勻漿液分為三層：無色的上清液、中間的白色蛋白層及帶顏色的下層有機(jī)相。吸取上清液轉(zhuǎn)移至另一新的離心管中（切忌吸出白色中間層）。（4）向上清中加入等體積的異丙醇，上下顛倒離心管充分混勻后，在15-30下靜置10min。（5）12000g 4 離心10min。一般在離心后，試管底部會(huì)出現(xiàn)沉淀。4.RNA沉淀的清洗小心棄去上清，緩慢的沿離心管壁加入75%的乙醇（用DEPC-Water配制）1ml（切勿觸及沉淀），輕輕上下顛倒洗滌離心管壁，12000g 4離心5min后小心棄去乙醇（為了更好的控制RNA中的鹽離子含量，應(yīng)盡量除凈乙醇）。5.RNA的溶解室溫干燥沉淀2-5min（不可以離心或加熱干燥，否則RNA將會(huì)很難溶解，有關(guān)RNA溶解可以參考Troubleshooting中的相關(guān)說明），加入適量的Rnase-free水溶解沉淀，必要時(shí)可以用移液搶輕輕吹打沉淀，待RNA沉淀完全溶解后于-80保存。（提取的RNA立即進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，確保RNA不降解，剩余的RNA標(biāo)記好放到旁邊-80冰箱保存。）PCR擴(kuò)增1.反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)(1)在Microtube管中配制下列混合液Dntp Mixture(10Mm each)1ulOligo Dt Primer (2.5uM)1ulTotal RNA5ulRnase Free dH2OUp to 10 ul(2) 在PCR儀上進(jìn)行變性、退火反應(yīng)。655min4（說明：變性、退火操作有利于模板RNA的變性以及反轉(zhuǎn)錄引物和模板的特異性退火，可提高反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)效率）(3) 離心數(shù)秒鐘使模板RNA/引物等的混合液聚集于Microtube管底中。(4) 在上述Microtube管中配制下列反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液上述變性、退火后的反應(yīng)液10ul5PrimeScript TM Buffer4ulRnase Inhibitor (40U/ul)0.5ulPrimeScript TM Rtase (for 2 Step)0