水通道蛋白綜述與展望.doc

水通道蛋白水通道 - 從原子結(jié)構(gòu)到臨床醫(yī)學(xué)生物膜的透水性在生理學(xué)上是一個(gè)長(zhǎng)期存在的問(wèn)題，但負(fù)責(zé)此類(lèi)蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)仍然未知，直到發(fā)現(xiàn)水通道蛋白1（AQP1）水通道蛋白。 AQP1由滲透梯度驅(qū)動(dòng)的水選擇性滲透。人類(lèi)AQP1的原子結(jié)構(gòu)最近被定義。四聚體的每個(gè)亞基含有允許水分子單文件通過(guò)但中斷氫鍵通過(guò)質(zhì)子所需的單獨(dú)水孔。已經(jīng)鑒定了至少10種哺乳動(dòng)物水通道蛋白，并且它們被水（水通道蛋白）或水加甘油（水甘油聚糖）選擇性滲透。表達(dá)位點(diǎn)與臨床表型密切相關(guān)，從先天性白內(nèi)障到腎源性尿崩癥。在植物，微生物，無(wú)脊椎動(dòng)物和脊椎動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)超過(guò)200個(gè)水通道蛋白家族成員，并且它們對(duì)這些生物體的生理學(xué)的重要性正在被揭開(kāi)。在20世紀(jì)20年代發(fā)現(xiàn)脂質(zhì)雙層提供了當(dāng)沐浴在較低或較高pH或含有毒性濃度的Ca2 +或其他溶質(zhì)的細(xì)胞外液中時(shí)細(xì)胞如何維持其最佳細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的解釋。 從1950年代開(kāi)始發(fā)現(xiàn)離子通道，交換劑和共轉(zhuǎn)運(yùn)體為溶質(zhì)的跨膜運(yùn)動(dòng)提供了分子解釋。 然而，長(zhǎng)期以來(lái)，假定水的輸送是由于通過(guò)脂質(zhì)雙層的簡(jiǎn)單擴(kuò)散。 來(lái)自具有高膜滲透性的多個(gè)實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)的觀察，例如兩棲膀胱和哺乳動(dòng)物紅細(xì)胞，表明通過(guò)脂質(zhì)雙層的擴(kuò)散不是水跨越膜的唯一途徑。 雖然提出了各種解釋?zhuān)钡?0年前發(fā)現(xiàn)AQP1才能知道分子水 - 特異性轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（Preston等，1999）?，F(xiàn)在人們普遍同意擴(kuò)散和通道介導(dǎo)的水分運(yùn)動(dòng)都存在。 通過(guò)所有生物膜以相對(duì)較低的速度發(fā)生擴(kuò)散。 水通道蛋白水通道發(fā)現(xiàn)于上皮細(xì)胞的一部分10至100倍的水滲透能力。 值得注意的是，水通道蛋白水通道的選擇性非常高，甚至質(zhì)子（H3O +）被排斥。 在大多數(shù)組織中，擴(kuò)散是雙向的，因?yàn)樗M(jìn)入細(xì)胞并從細(xì)胞釋放，而水通道蛋白介導(dǎo)的體內(nèi)水流則由滲透或液壓梯度引導(dǎo)。 擴(kuò)散的化學(xué)抑制劑是未知的，擴(kuò)散發(fā)生在高Ea（Arrhenius活化能）。 相比之下，大多數(shù)哺乳動(dòng)物水通道蛋白受汞的抑制，Ea等同于大量溶液中水的擴(kuò)散（5 kcal mol_1）。水通道蛋白的發(fā)現(xiàn)說(shuō)明了偶發(fā)性在生物學(xué)研究中的重要性，并且引起了上游流體運(yùn)輸過(guò)程中水如何穿過(guò)生物膜的范式的完全轉(zhuǎn)變。 這個(gè)話題對(duì)正常生理學(xué)以及影響人類(lèi)的多種臨床疾病的病理生理學(xué)非常重要。 水通道蛋白在幾乎每一種生物體中被鑒定出來(lái)，包括高等哺乳動(dòng)物，其他脊椎動(dòng)物，無(wú)脊椎動(dòng)物，植物，真細(xì)菌，原細(xì)菌和其他微生物，表明這種新認(rèn)可的蛋白質(zhì)家族參與了整個(gè)自然界的不同生物過(guò)程。一、發(fā)現(xiàn)AQP1紅細(xì)胞Rh血型抗原不知道參與水運(yùn)（HeitmanAgre，2000），但是Rh的研究導(dǎo)致了水通道蛋白的偶然發(fā)現(xiàn)。用于純化Rh多肽的生物化學(xué)技術(shù)產(chǎn)生污染的28kDa多肽（Agre等，1987）?；谙礈靹┲械?8kDa蛋白質(zhì)的相對(duì)不溶性，N-月桂酰肌氨酸，開(kāi)發(fā)了產(chǎn)生大量蛋白質(zhì)的簡(jiǎn)單純化系統(tǒng)。紅細(xì)胞和腎近端小管 - 具有最高已知水滲透性的組織中，28kDa蛋白質(zhì)顯示出非常豐富（Denker等，1988）。此外，28kDa蛋白質(zhì)表現(xiàn)為四聚體整合膜蛋白 - 通常是膜通道蛋白的特征（SmithAgre，1991）。使用28kDa多肽的N-末端序列克隆編碼來(lái)自紅細(xì)菌文庫(kù)的269個(gè)氨基酸多肽的cDNA（PrestonAgre，1991）。遺傳數(shù)據(jù)庫(kù)的分析顯示了多種物種的同源物，包括微生物和植物，但其分子功能是未知的。 “CHIP28”暫時(shí)用于描述這種蛋白質(zhì)為“28kDa的通道樣整合蛋白”。窗體頂端窗體底端二、AQP1的結(jié)構(gòu)AQP1的結(jié)構(gòu)非常有力，因?yàn)樗哂歇?dú)特的滲透特性。推導(dǎo)的序列揭示了以前未描述的拓?fù)?，兩個(gè)串聯(lián)重復(fù)每個(gè)由具有兩個(gè)高度保守的環(huán)（B和E）的跨膜結(jié)構(gòu)域形成，包含簽名基序，天冬酰胺 - 脯氨酸 - 丙氨酸（NPA）。奇怪的是，重復(fù)序列被預(yù)測(cè)為相對(duì)于彼此以180度取向（圖2，頂部）。通過(guò)在非洲爪蟾卵母細(xì)胞中表達(dá)AQP1的位點(diǎn)定向插入突變體來(lái)證實(shí)這種獨(dú)特的對(duì)稱(chēng)性（Preston等人，19994a）。在環(huán)路E中，在接近NPA基序的Cys-189處證明了汞抑制的位點(diǎn)。用較大分子量的殘基替換NPA側(cè)翼殘基的突變體沒(méi)有表現(xiàn)出水滲透性，表明環(huán)E形成水孔的一部分（Preston等，1993）。當(dāng)環(huán)B（Ala-73）中的NPA基序之前的相應(yīng)位置被半胱氨酸取代時(shí)，水分滲透性也受到汞的抑制。當(dāng)NPA基序側(cè)翼的殘基被更大的殘基取代時(shí)，觀察到該環(huán)B也表現(xiàn)為似乎形成水孔的一部分。這些研究一起導(dǎo)致了AQP1亞基各自含有部分由“沙漏”形成的內(nèi)部水孔（圖2，底部）的建議，其由從相反的雙層折疊成雙層的環(huán)B和E產(chǎn)生的結(jié)構(gòu)膜的兩側(cè)在雙層傳單之間的中間接觸（Jung et al。，1994b）。1992年，瑞士巴塞爾大學(xué)Biozentrum的Andreas Engel和同事們開(kāi)始了長(zhǎng)期合作，隨后與日本京都大學(xué)的Yoshinori Fujiyoshi及其同事一起解決了AQP1蛋白的結(jié)構(gòu)。使用通過(guò)用N-月桂酰肌氨酸預(yù)萃取膜囊泡的純化方法，可以將高達(dá)5mg的AQP1純化成來(lái)自一品脫人血液的同質(zhì)性（SmithAgre，1991）。當(dāng)通過(guò)透析將高濃度的蛋白質(zhì)小心地重構(gòu)成脂質(zhì)雙層體時(shí)，形成均勻的晶格（“膜晶體”），其中蛋白質(zhì)保留其100的水輸送活性（Walz等人1994b）。蛋白質(zhì)的四聚體組織在低分辨率下明確確定，并且其通過(guò)3D電子顯微鏡測(cè)定其在膜中的組織（Walz等人，1994a）。用高達(dá)60度的傾斜研磨的精細(xì)膜晶體，由我們?cè)诰┒嫉耐麻_(kāi)發(fā)的技術(shù)先進(jìn)的電子顯微鏡，以3.8分辨率產(chǎn)生電子密度圖。使用由重組體研究建立的約束，使用AQP1的主序列進(jìn)行建模產(chǎn)生了AQP1結(jié)構(gòu)的第一個(gè)原子模型（Murata等人，2000）。另外一種基于電子顯微鏡的模型以不同的主鏈方向以相同的螺旋排列出版（Ren et al.2001）。與其中四個(gè)亞基圍繞中心孔的離子通道不同，AQP1作為每個(gè)亞單位的四聚體存在含有自己的孔。 在雙層傳單之間的中間孔的孔徑變窄至約3埃。 在這一點(diǎn)上，由跨膜結(jié)構(gòu)域TM1,2,4和5形成的壁是疏水的，而NPA圖案中的兩個(gè)高度保守的Asn-76和Asn-192被并置，如在沙漏模型中預(yù)測(cè)的那樣，提供極性 用于氫鍵的殘基（圖3）。 此外，成孔環(huán)B和E的末端部分均含有短的-螺旋，其在膜的中心產(chǎn)生部分正電荷。這種結(jié)構(gòu)剛好在由殘基Phe-56，His-180，Cys-189（汞抑制位點(diǎn)）和Arg-195所包圍的2.8A的縮合物之下，Arg-195在精制的AQP1結(jié)構(gòu)中是公認(rèn)的（de Groot等人2001）。 Arg-195在大水通道蛋白基因家族的所有成員中幾乎完全保守，并且在通道的最窄部分提供功能上重要的正電荷。 His-180在中性pH下不帶電，但在較低的pH下變質(zhì)子化，提供第二個(gè)正電荷。 Arg-195，His-180和來(lái)自孔螺旋的正偶極子在水滲透期間提供抵抗質(zhì)子（水合氫離子）通過(guò)的強(qiáng)排斥電荷。AQP1的這些結(jié)構(gòu)特征很好地解釋了排除較大或帶電溶質(zhì)的最小抗?jié)B透能力。特別地，阻斷質(zhì)子傳遞的能力澄清了腎臟如何每天從腎小球?yàn)V液中重吸收數(shù)百升的水，同時(shí)排泄酸。重要的是，分辨率為2.2的大腸桿菌同源物GlpF的三維晶體的X射線衍射分析（Fu等人2000）允許對(duì)AQP1結(jié)構(gòu)進(jìn)行改進(jìn)（de Groot等人，2001），其實(shí)質(zhì)上與模型由2.2 A分辨率的牛AQP1的三維晶體確定（Sui et al。2001）。實(shí)時(shí)分子動(dòng)力學(xué)模擬表明，在通過(guò)NPA圖案的并置Asn-76和Asn-192（de GrootGrubmuller，2001）期間，水的旋轉(zhuǎn)發(fā)生。分子動(dòng)力學(xué)研究也由其他研究者進(jìn)行（KongMa，2001; Tajkhorshid et al.2002）。結(jié)構(gòu)研究和分子動(dòng)力學(xué)模擬對(duì)膜水輸送過(guò)程帶來(lái)了非常高的原子認(rèn)知水平。生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域的調(diào)查人員現(xiàn)在認(rèn)識(shí)到，水通道蛋白提供了水通過(guò)生物膜快速和選擇性運(yùn)動(dòng)的機(jī)制。三、AQP1的分布 1991年11月，丹麥奧胡斯大學(xué)的Soren Nielsen及其團(tuán)隊(duì)長(zhǎng)期合作。 我們的目標(biāo)是使用光學(xué)顯微鏡和免疫電子顯微鏡在細(xì)胞和亞細(xì)胞水平的腎臟和其他組織中定位AQP1（和隨后的其他水通道蛋白）。 這些研究為AQP1的生理和病理作用提供了明確的證據(jù)，并且在其他部位牢固地預(yù)測(cè)了同源蛋白的存在。自20世紀(jì)30年代荷馬史密斯早期的職業(yè)生涯以來(lái)，腎臟比其他器官吸引了運(yùn)輸生理學(xué)家的興趣。使用對(duì)AQP1蛋白的C末端特異性的親和純化抗體和N末端的第二抗體，將AQP1的位置精確地定位在近端小管的頂端刷邊界和基底外側(cè)膜（圖4）和下降薄來(lái)自大鼠腎臟的Henle四肢（Nielsen等，1993c）和人（Maunsbach等，1997）。此外，蛋白質(zhì)在下垂血管直腸中被鑒定（Pallone等人，1997），其定義了將大量水從管腔轉(zhuǎn)移到間質(zhì)，然后進(jìn)入血管空間的途徑。 AQP1蛋白質(zhì)清楚顯示僅存在于這些部位的質(zhì)膜中，而不存在于細(xì)胞內(nèi)部位。因此，建立了這樣的范例，即通過(guò)AQP1在頂端和基底外側(cè)血漿膜中將水輸送穿過(guò)近端小管上皮和下肢細(xì)胞，其驅(qū)動(dòng)力由通過(guò)特異性轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的溶質(zhì)的矢量運(yùn)動(dòng)產(chǎn)生的小立場(chǎng)滲透梯度提供在這些膜（NielsenAgre，1995）.在其他組織中也證實(shí)了AQP1蛋白，其中包括脈絡(luò)叢（腦脊髓液），前房室內(nèi)的非色素上皮（房水），膽管細(xì)胞（膽汁）和毛細(xì)血管內(nèi)皮等重要分泌作用，包括肺支氣管循環(huán) （Nielsen等，1993b）。 重要的是發(fā)現(xiàn)腎臟收集管道完全缺乏AQP1，可以很好的預(yù)測(cè)多種水通道蛋白質(zhì)的需要。 同樣，唾液腺上皮缺乏AQP1蛋白，預(yù)測(cè)其他同源物的存在。四、AQP1空人 鑒定完全缺乏AQP1蛋白質(zhì)的人們證明了這種蛋白質(zhì)對(duì)人體生理學(xué)的重要性。 通過(guò)熒光原位雜交將AQP1基因座定位于人染色體7p14（Moon等，1993）。 Colton（Co）血型抗原以前已經(jīng)連接到人類(lèi)7號(hào)染色體的短臂（Zelinski等，1990）。 來(lái)自具有確定的Co血型的個(gè)體的DNA的抗Co免疫沉淀研究和測(cè)序表明，Co抗原是連接第一和第二雙層跨越結(jié)構(gòu)域的環(huán)A的胞外位點(diǎn)的AQP1的多態(tài)性的結(jié)果 - Coa具有Ala -45，而較不常見(jiàn)的科巴Val-45（史密斯等人，1999）。據(jù)了解，缺乏Coa和Cob的人非常罕見(jiàn)，因?yàn)橛?guó)布里斯托爾的國(guó)際血型登記處只列出了6名親屬。 Co陰性的先證者是在懷孕期間變得敏感的婦女，導(dǎo)致它們具有循環(huán)的抗Co抗體。這些抗體使得這些患者不可能接受異源輸血，因此每個(gè)Co無(wú)效個(gè)體都有在本地血庫(kù)冷藏保存的血液?jiǎn)挝弧Ｎ覀儚娜齻€(gè)不同親屬的Co無(wú)效個(gè)體獲得血液，尿液和DNA，發(fā)現(xiàn)紅細(xì)胞和尿沉渣中缺乏AQP1蛋白。發(fā)現(xiàn)每個(gè)親屬中的先證者對(duì)于AQP1基因（因此“AQP1 null”）的不同破壞 - 外顯子1的缺失，外顯子1中的位移或第一跨膜結(jié)構(gòu)域末端的不穩(wěn)定突變都是純合的Preston等人1994b）。令人驚訝的是，AQP1無(wú)效個(gè)體導(dǎo)致正常生活，完全不知道任何身體上的限制。進(jìn)行AQP1無(wú)效個(gè)體的仔細(xì)臨床分析，以鑒定腎臟濃度和毛細(xì)血管通透性的可能的生理異常。 在第一項(xiàng)研究中，兩名不相關(guān)的AQP1無(wú)效個(gè)體在約翰霍普金斯醫(yī)院進(jìn)行了詳細(xì)分析，在經(jīng)過(guò)認(rèn)可的方案之前和之后，在具有確定的終點(diǎn)和安全機(jī)制的情況下進(jìn)行了水剝奪。 基線研究是完全正常的。 當(dāng)口渴達(dá)24小時(shí)時(shí)，兩名受試者均表現(xiàn)出正常的血清滲透壓和正常的血清升壓素水平，如預(yù)期大約6小時(shí)的渴望后升高。 主要的驚喜是，即使在24小時(shí)口渴之后，AQP1無(wú)效個(gè)體也不能將尿濃縮至450mosmol以上。 此外，即使在輸注加壓素或3NaCl后，患者也不能將尿濃縮至450 mosmol kg_1以上，以最大限度地刺激尿濃度（King等，2001）。與AQP1無(wú)效個(gè)體相比，正常人全部通過(guò)將尿濃縮至約1000 mosmol kg_1來(lái)響應(yīng)過(guò)夜口渴。AQP1無(wú)效對(duì)象不是多尿的，它們沒(méi)有表現(xiàn)出腎小球?yàn)V過(guò)率，自由水清除率或鋰清除率（近端小管功能指標(biāo)）的異常。濃縮缺陷被認(rèn)為是由降低的薄肢體上的水輸送減少和減少水輸送進(jìn)入和排除直腸的結(jié)合而產(chǎn)生的。因此，AQP1無(wú)效個(gè)體部分喪失了通過(guò)逆流機(jī)制產(chǎn)生有效濃縮所需的髓質(zhì)高滲透壓的能力。雖然這并不影響正常的日常生活，但是由于另一種疾病或環(huán)境原因，如果它們變得脫水，Co無(wú)效個(gè)體將面臨危及生命的臨床問(wèn)題。毛細(xì)血管內(nèi)皮的腔內(nèi)和外膜中AQP1的表達(dá)表明，蛋白質(zhì)可能在空間和間質(zhì)之間的水運(yùn)動(dòng)中起重要作用（Nielsen等，1993b，c）。此外，AQP1在毛細(xì)血管內(nèi)皮中的表達(dá)似乎在體內(nèi)受到各種刺激的積極調(diào)節(jié)。例如，大鼠肺毛細(xì)血管內(nèi)皮中AQP1的表達(dá)由皮質(zhì)類(lèi)固醇增加至10倍，大鼠肺中的表達(dá)也在出生時(shí)精確出現(xiàn)（King等，1996,1997）。培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞中的AQP1被泛素 - 蛋白酶體途徑迅速降解（Leitch等，2001）。認(rèn)為這些過(guò)程很可能發(fā)現(xiàn)在人類(lèi)生理學(xué)中發(fā)生。通過(guò)第二批準(zhǔn)的臨床研究方案評(píng)估人類(lèi)AQP1無(wú)效個(gè)體因血管內(nèi)皮缺乏AQP1蛋白而出現(xiàn)生理異常的可能性。 AQP1無(wú)效個(gè)體通過(guò)高分辨率計(jì)算機(jī)斷層掃描檢查快速輸注3 h的溫?zé)嵘睇}水之前和之后的肺（King et al。2002）。五個(gè)正常人和兩個(gè)AQP1無(wú)效個(gè)體中的每一個(gè)在流體輸注后持續(xù)肺血管充血（橫截面積增加20）。五個(gè)正常個(gè)體中的每一個(gè)表現(xiàn)出與早期的靜脈周?chē)[形成一致的細(xì)支氣管壁厚度（壁面積增加高達(dá)40）的顯著增加。每個(gè)正常人都知道在以下時(shí)間內(nèi)消失的中度肺充血（初期肺水腫）。令人驚訝的是，兩個(gè)AQP1無(wú)效個(gè)體都沒(méi)有發(fā)現(xiàn)增加細(xì)支氣管壁厚度，也沒(méi)有抱怨任何肺充血癥狀。這些發(fā)現(xiàn)矛盾地表明缺乏AQP1可以防止急性肺水腫。 然而，在諸如充血性心力衰竭的設(shè)置中，肺水腫在幾小時(shí)或幾天內(nèi)出現(xiàn)。 由于AQP1也是流體再攝入血管床的途徑，所以這些研究預(yù)測(cè)，如果AQP1無(wú)效個(gè)體經(jīng)歷亞急性或慢性流體超載，則會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重缺陷。 因此，預(yù)計(jì)AQP1無(wú)效個(gè)體不能通過(guò)將流體返回到血管空間而迅速消散水腫。 雖然未經(jīng)證實(shí)，在AQP1無(wú)效對(duì)象中，從肺部快速清除水可能無(wú)法完全運(yùn)行，因此可能會(huì)解釋為什么AQP1無(wú)效受試者非常罕見(jiàn)。 此外，AQP1在早產(chǎn)兒肺中的表達(dá)降低可能對(duì)新生兒重癥監(jiān)護(hù)病房常見(jiàn)的嚴(yán)重呼吸系統(tǒng)疾病有很大的幫助。1、多水通道蛋白在AQP1發(fā)現(xiàn)之后，歐洲，日本和美國(guó)的研究小組加入了分離編碼水通道蛋白的cDNA，從而將水分運(yùn)輸已知高度評(píng)估（由Agre等1998）。高度保守的序列的存在已經(jīng)使得使用聚合酶鏈擴(kuò)增降低嚴(yán)格性成為可能。從這些研究中，已經(jīng)鑒定了10種哺乳動(dòng)物水通道蛋白（圖5）。已經(jīng)出版了第十一同系物（AQP10）的序列，但仍缺乏蛋白質(zhì)表達(dá)的確認(rèn)（Hatakeyama等，2001）。已經(jīng)對(duì)人類(lèi)和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行了研究。有目標(biāo)基因的小鼠還產(chǎn)生了破壞（由Agre，1998年; Verkman，2000年審查）。許多研究的結(jié)果強(qiáng)調(diào)了這些蛋白質(zhì)對(duì)基本生理學(xué)以及幾種疾病狀態(tài)的病理生理學(xué)的重要性。此外，遺傳學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)中已經(jīng)出現(xiàn)了來(lái)自不同物種的200多種不同水通道蛋白序列，其中表明水通道蛋白在自然界中的重要性。2、AQP2加壓素調(diào)節(jié)腎通道的水通道 AQP1的鑒定吸引了腎臟生理學(xué)家的直接興趣。 此外，AQP1在收集管道主體細(xì)胞中的缺乏預(yù)示著長(zhǎng)期以來(lái)已知加壓素調(diào)節(jié)水輸送的位點(diǎn)存在同源蛋白質(zhì)。 使用由AQP1的高度保守的NPA基序設(shè)計(jì)的寡核苷酸引物，從收集管中分離出cDNA（Fushimi等，1993）。 現(xiàn)在稱(chēng)為AQP2的這種收集管同源物被證明在非洲爪蟾卵母細(xì)胞中表達(dá)時(shí)賦予增加的透水性，并被汞的抑制。 AQP2定位在收集管主體細(xì)胞中，長(zhǎng)期口渴大鼠的研究表明AQP2表達(dá)增強(qiáng)（Nielsen等，1993）。AQP2的功能和分布通過(guò)收集管的分析明確定義（Nielsen等人，1999）。在不加血管加壓素的情況下，在分離的灌注大鼠收集管中，加入100pM血管加壓素后，以及在除去藥劑后測(cè)量水輸送。收集導(dǎo)管固定，AQP2蛋白通過(guò)免疫金電子顯微鏡定位（圖6）。通過(guò)這種方法，顯示AQP2在很大程度上局限于基礎(chǔ)狀態(tài)的細(xì)胞內(nèi)囊泡，但是加壓素誘導(dǎo)重新分配到頂膜，伴隨著透水性增加五倍。當(dāng)加壓素被去除時(shí)，AQP2被重新外化，水滲透率恢復(fù)到基線。隨后顯示AQP2通過(guò)受體激活的腺苷酸環(huán)化酶 - 蛋白激酶A的蛋白質(zhì)的C末端胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域中的Ser-256磷酸化被胞吐所影響（Katsura等，1995; Christensen等，2000）。隨后，AQP3顯示存在于主細(xì)胞的基底外側(cè)膜（Ecelbarger等，1995）。頂端膜中的AQP2和基底外側(cè)膜中的AQP3一起提供了透過(guò)細(xì)胞的途徑，使水從內(nèi)腔通過(guò)收集管移動(dòng)到間質(zhì)中。這些研究表明AQP2可能參與某些類(lèi)型的腎源性尿崩癥（NDI）。 以前已顯示這種重要的臨床疾病是由X連鎖NDI中加壓素的V2受體編碼基因的突變引起的（Bichet，1998）。 荷蘭奈梅亨大學(xué)的調(diào)查人員以前已經(jīng)確定了在編碼V2的基因中沒(méi)有突變的隱性遺傳性NDI患者。 通過(guò)對(duì)結(jié)構(gòu)AQP2基因進(jìn)行測(cè)序，他們鑒定了AQP2的跨膜和孔形成結(jié)構(gòu)域的突變（Deen等，1994）。 這些突變導(dǎo)致保留在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的AQP2蛋白錯(cuò)誤折疊。 隨后，確定了具有顯著遺傳的NDI的家族，并且發(fā)現(xiàn)突變位點(diǎn)位于遠(yuǎn)離PKA磷酸化位點(diǎn)的兩個(gè)殘基（Mulders等人，1998）。 有趣的是，突變蛋白與野生型AQP2低聚，復(fù)合物保留在高爾基體中。重要和經(jīng)常遇到的水分平衡障礙的動(dòng)物模型已經(jīng)被多個(gè)研究組顯示出來(lái)，包括AQP2蛋白的異常表達(dá)（參見(jiàn)Schrier等，1998; YamamotoSasaki，1998; Kwon等，2001）。發(fā)現(xiàn)AQP2在具有多尿癥，包括經(jīng)典尿崩癥（血管加壓素簡(jiǎn)單缺乏），鋰療法（通常用于治療雙相情感障礙），阻塞后（經(jīng)常經(jīng)尿道前列腺切除術(shù)），低鉀血癥（后果）的抗高血壓藥物），甚至夜間遺尿。相比之下，AQP2被發(fā)現(xiàn)在流體保留狀態(tài)如充血性心力衰竭，ADH不適綜合征，肝硬化甚至懷孕中過(guò)度表達(dá)。因此，AQP2的繼發(fā)性疾病對(duì)臨床醫(yī)學(xué)的實(shí)踐至關(guān)重要。此外，這些研究預(yù)測(cè)，水通道蛋白家族的其他成員將被鑒定，并且這些水通道蛋白參與由表達(dá)蛋白質(zhì)的位點(diǎn)預(yù)測(cè)的其他重要的臨床疾病。3、腎臟收集管的AQP6門(mén)控離子通道 水通道蛋白的功能譜通過(guò)發(fā)現(xiàn)AQP6而擴(kuò)大。 盡管AQP6可能存在于收集管外部的組織中，但是AQP6抗體的交叉反應(yīng)性已經(jīng)排除了對(duì)非腎組織的嚴(yán)格研究。 盡管如此，AQP6在酸性轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白被限制在細(xì)胞內(nèi)部位的腎收集管中已被明確鑒定（Yasui et al。，1999b）。 進(jìn)一步的分析表明，AQP6與細(xì)胞內(nèi)囊泡中H + -ATPase一起共定位，但在質(zhì)膜中不共定位（Yasui et al.1999a）。AQP6不是一個(gè)簡(jiǎn)單的水道。 當(dāng)在非洲爪蟾卵母細(xì)胞中表達(dá)時(shí)，AQP6位于卵母細(xì)胞質(zhì)膜中，其表現(xiàn)出最小的透水性。 盡管抑制水滲透性，預(yù)期的結(jié)果先前已被其他人報(bào)道，但用氯化汞處理AQP6卵母細(xì)胞未能降低透水性（Ma et al.1996）。 非常令人驚訝的是，我們發(fā)現(xiàn)低濃度的氯化汞增加了透水性并引起伴隨的膜電流（Yasui et al。，1999a）。 因此，雖然AQP6的主要序列最接近AQP2和AQP5（都被氯化汞抑制），但AQP6的結(jié)構(gòu)必須具有功能上的重要差異。AQP6在含有H + -ATPase的細(xì)胞內(nèi)囊泡中的位置（Yasui et al。，1999b）表明在酸的分泌中起作用。 重要的是，AQP6離子電流在低pH下迅速且可逆地活化，證實(shí)AQP6可能參與被插入細(xì)胞的酸分泌。 暴露于慢性酸中毒的大鼠的研究未見(jiàn)AQP6表達(dá)的變化，但慢性堿中毒和水分負(fù)荷導(dǎo)致AQP6表達(dá)顯著增加（Promeneur等，2000）。 AQP6攜帶的膜電流對(duì)于陰離子是相對(duì)選擇性的，單通道研究表明發(fā)生快速閃爍。 通過(guò)對(duì)編碼AQP6的基因進(jìn)行靶向破壞的小鼠的分析進(jìn)一步描述這些研究（M.Yasui，未發(fā)表的觀察）。 目前認(rèn)為，AQP6可能與某些形式的酸堿紊亂有關(guān)。4、AQP0-鏡片主要內(nèi)在蛋白（MIP）在AQP1的功能鑒定之前，在晶狀體纖維細(xì)胞中已經(jīng)鑒定了豐富的蛋白質(zhì)（Gorin等人，1984; Zampighi等人，1989），盡管其功能尚不清楚。 MIP最初被認(rèn)為是間隙連接蛋白，但發(fā)現(xiàn)與連接蛋白無(wú)關(guān)（Ebihara等，1989）。發(fā)現(xiàn)AQP1的功能后，MIP在卵母細(xì)胞中的表達(dá)顯示出誘導(dǎo)水分滲透性的增加不會(huì)受到汞的抑制 - 因此符號(hào)AQP0（Mulders等，1995）。與其他水通道蛋白不同，AQP0的電子和原子力顯微鏡研究已經(jīng)證明該蛋白質(zhì)可能具有作為細(xì)胞間粘附蛋白的結(jié)構(gòu)作用（Fotiadis等人，2000）。盡管AQP0的這一作用尚未建立，但是通過(guò)對(duì)泳道3（Van Dort等人2001）的研究已經(jīng)建立了運(yùn)輸?shù)鞍踪|(zhì)可能是細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)重要組成部分的范例。AQP0與人類(lèi)疾病的關(guān)系來(lái)自具有先天性白內(nèi)障的大型親緣遺傳連鎖研究。 來(lái)自英國(guó)的兩個(gè)這樣的家族與人染色體12q13相關(guān)，并且在一個(gè)家族中的每個(gè)Glu-134-Gly中鑒定了點(diǎn)突變，另一個(gè)家族中有Thr-138-Arg（Berry等人，2000）。 將人AQP0克隆并突變?yōu)镚ly-134或Arg-138，并將cRNA注入非洲爪蟾卵母細(xì)胞。 盡管突變體蛋白質(zhì)被表達(dá)，但對(duì)質(zhì)膜的運(yùn)輸受損（Francis等，2000）。白內(nèi)障的遺傳格局在每個(gè)家庭中顯然占主導(dǎo)地位。兩個(gè)家庭的失明在家庭成員中首次出現(xiàn)在小孩子身上，但白內(nèi)障的形態(tài)卻明顯不同。 Glu134-Gly患者遭受了與出生時(shí)鏡片大小相對(duì)應(yīng)的層狀不透明度。奇怪的是，這個(gè)觀察結(jié)果表明鏡片在新生兒期間以特殊的方式受到某種程度的壓力，但不是在出生之前或之后?；加蠺hr-138-Arg突變的患者在整個(gè)晶狀體中持續(xù)存在新出現(xiàn)的不透明度的終身問(wèn)題。發(fā)現(xiàn)這些突變的位點(diǎn)位于重要的結(jié)構(gòu)區(qū)域。 Glu-134在所有已知的水通道蛋白同源物中是保守的，并且AQP1的原子結(jié)構(gòu)表明該殘基位于高度保守的殘基Arg-187附近，并且可以限制六個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域內(nèi)環(huán)E的取向（de Groot等人2001 ; Sui et al.2001）。當(dāng)Thr-138被大體積的Arg取代時(shí)，空間限制和競(jìng)爭(zhēng)性正電荷可能改變Glu-134的取向。與AQP0結(jié)構(gòu)中的主要缺陷相關(guān)的早發(fā)性白內(nèi)障的發(fā)生強(qiáng)烈地表明，在老年人常見(jiàn)的典型的晚發(fā)性白內(nèi)障或一些與糖尿病相關(guān)的白內(nèi)障患者中，一些患者將發(fā)現(xiàn)較不嚴(yán)重的缺陷或慢性紫外線照射。因此，正在追求在編碼AQP0的基因中搜索人突變。5、AQP4 - 腦中水通道蛋白編碼AQP4的cDNA從蛋白質(zhì)豐富的腦中獲得（Jung et al。，1994a）。 水通道蛋白家族的這一成員對(duì)汞抑制作用不敏感（Hasegawa等，1994），并且在循環(huán)E中缺乏NPA基序之前的半胱氨酸，已知其對(duì)AQP1具有汞敏感性（Preston等，1993）。 AQP4的組成型活性與AQP1類(lèi)似。也許在其他器官中，蛋白質(zhì)的位置比中樞神經(jīng)系統(tǒng)更重要。 AQP4在腦和視網(wǎng)膜中的表達(dá)通過(guò)免疫組織化學(xué)和免疫膠體電子顯微鏡（Nielsen等，1997b; Nagelhus等，1998）建立。 AQP4蛋白在星形膠質(zhì)細(xì)胞中最豐富，其中存在腦和液體界面 - 鄰近于蛛網(wǎng)膜下腔，鄰近毛細(xì)血管，以及在室壁內(nèi)部的室管膜細(xì)胞。與毛細(xì)血管基底膜相鄰的星形膠質(zhì)末端形成膠質(zhì)極限，當(dāng)通過(guò)電子顯微鏡分析冷凍斷裂復(fù)制品時(shí)，長(zhǎng)期以來(lái)已知其含有正方形陣列（也稱(chēng)為正交陣列）的結(jié)構(gòu)域。直接的抗AQP4免疫金標(biāo)記鑒定為AQP4的微晶組裝的方陣（Rash等，1998）。 AQP4蛋白在腦的滲透感區(qū)域也很豐富，包括視神經(jīng)核，其中存在于加壓素分泌神經(jīng)元周?chē)哪z質(zhì)細(xì)胞層中; AQP4在神經(jīng)元中尚未確定。因此，在膠質(zhì)細(xì)胞中，AQP4位于與已知谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白所在的膜相對(duì)的膜（圖7），并且AQP4在視網(wǎng)膜中與特定鉀通道Kir4.1（Nagelhus等人，1999）共定位。 AQP4也被證明存在于骨骼肌中快速抽搐纖維的肌膜內(nèi)（Frigeri等人，1999）。幾個(gè)線索提供了AQP4在膠質(zhì)細(xì)胞和快速抽搐骨骼肌纖維中的精確定位的分子機(jī)制的見(jiàn)解。 AQP4（-Ser-Ser-Val-COOH）的C末端符合結(jié)合PDZ結(jié)構(gòu)域的基序 - 蛋白質(zhì) - 蛋白質(zhì)關(guān)聯(lián)結(jié)構(gòu)域，命名為首次鑒定的蛋白質(zhì)，PSD-95，Discs Large和Z-Occludins（松陽(yáng)等，1997）。這表明AQP4的定位可能是由于與細(xì)胞骨架蛋白的結(jié)合引起的。在Duchenne肌營(yíng)養(yǎng)不良患者中發(fā)現(xiàn)編碼肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白的人基因中的突變，并且mdx小鼠是該重要疾病的動(dòng)物模型。當(dāng)在mdx小鼠中分析分布時(shí)，成熟動(dòng)物中AQP4表達(dá)嚴(yán)重異常，表明AQP4可能是與肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白相關(guān)蛋白復(fù)合物的一部分（Frigeri等人，2001）。選擇性免疫沉淀證明，肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白復(fù)合物中的-合成蛋白，PDZ結(jié)構(gòu)域蛋白與AQP4相關(guān)（Neely等人2001; Adams等人，2001）。 AQP4也在a-合成蛋白無(wú)效小鼠的星形膠質(zhì)細(xì)胞中靶向靶向。此外，當(dāng)通過(guò)轉(zhuǎn)染到培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)時(shí)，全長(zhǎng)AQP4的存活半衰期比缺少末端Ser-Ser-Val的AQP4長(zhǎng)三倍。已經(jīng)顯示AQP4在Duchenne肌營(yíng)養(yǎng)不良癥和某些Becker肌營(yíng)養(yǎng)不良病例（A.Frigeri，未發(fā)表的觀察）的骨骼肌中減少。AQP4蛋白的生理功能尚不清楚。與鉀通道的關(guān)聯(lián)表明，腦中AQP4的功能可能是為了促進(jìn)流體跨越細(xì)胞膜的轉(zhuǎn)移，以響應(yīng)在神經(jīng)刺激后發(fā)生的鉀虹吸（Nagelhus等人，1999）。據(jù)信AQP4可能允許水穿過(guò)分離實(shí)質(zhì)和血管空間的血腦屏障。雖然大多數(shù)證據(jù)表明AQP4是組成型活性的，但一組研究人員已經(jīng)提出，卵磷脂中的AQP4可能通過(guò)磷酸化作用而被關(guān)閉，從而響應(yīng)于佛波酯處理（Han et al。1998）。與此相一致，當(dāng)存在佛波酯二酯時(shí)，培養(yǎng)細(xì)胞中的AQP4表現(xiàn)出水滲透性的小變化（M.Zelenina和A.Aperia，未發(fā)表的觀察）。如果AQP4被門(mén)控，橫跨血腦屏障的流體通道可能不是組成性開(kāi)放的。對(duì)具有針對(duì)性破壞編碼AQP4基因的小鼠的分析顯示，當(dāng)用急性低鈉血癥應(yīng)激時(shí)，無(wú)效動(dòng)物的相對(duì)保留（Manley等，2000）。盡管研究人員建議抑制AQP4可能是有益的，但相反的情況可能很容易實(shí)現(xiàn)，因?yàn)槟X水腫的消散對(duì)于維持閉合性頭部損傷或腦血管意外的患者至關(guān)重要。因此，AQP4在人腦水腫中的重要性尚未確定。6、AQP5-分泌腺，肺和眼中的水通道 首先從頜下腺cDNA文庫(kù)（Raina等人，1995）克隆出來(lái)，AQP5已經(jīng)定位于多個(gè)分泌腺的頂膜，包括淚腺，唾液腺和氣道粘膜下腺（Nielsen等，1997）。 這些網(wǎng)站預(yù)測(cè)，AQP5可能是限制腺體液釋放的速率，正如已經(jīng)在編碼AQP5基因靶向破壞的小鼠的唾液腺和氣道中所證實(shí)的（Ma等，1999; SongVerkman，2001）。 AQP5存在于大鼠，小鼠和人類(lèi)的汗腺頂端膜中，并且在AQP5無(wú)效小鼠的爪子中汗液分泌顯著減少（Nejsum等人，2002）。 這一觀察的一般意義尚待確定，因?yàn)槠渌芯空咭呀?jīng)得出結(jié)論，AQP5不參與小鼠的汗液分泌（Song et al.2002）。AQP5對(duì)人類(lèi)疾病的重要性也可能包括肺和氣道的重要疾病。 AQP5已經(jīng)局限于在大鼠肺內(nèi)肺泡上的1型上皮細(xì)胞的頂端膜（Nielsen等，1997a）。 分布在小鼠肺中更廣泛，令人驚訝的是，AQP5無(wú)效小鼠被發(fā)現(xiàn)在膽堿能刺激響應(yīng)中表現(xiàn)出增加的支氣管痙攣（Krane等，2001）。 更廣泛的AQP5分布也在人肺中顯示（Kreda等人2001）。 一些形式的人類(lèi)哮喘已經(jīng)與染色體12q相連，該染色體靠近AQP5已被鑒定的位點(diǎn)（Lee等，1996），但AQP5在人類(lèi)哮喘中的作用尚未得到證實(shí)。AQP5對(duì)人眼的生理學(xué)很重要。 AQP5在眼睛表面的角膜上皮中表達(dá)（Hamann et al.1998），懷疑它有助于上皮水化和透明度，并可能參與角膜傷口愈合。 已經(jīng)在人眼淚腺中研究了AQP5（Gresz et al.2001）。 通過(guò)來(lái)自6例Sjgren綜合征患者的淚腺活組織檢查的免疫組織化學(xué)分析注意到細(xì)胞運(yùn)輸不良，但在4例非Sjgren干眼癥患者（Tsubota等，2001）中未見(jiàn)。 等待這一點(diǎn)的一般意義是因?yàn)锳QP5的缺陷販運(yùn)已被發(fā)現(xiàn)在一些Sjgren患者的唾液腺活檢（Steinfeld等人2001），而不是其他人（Beroukas等人2001）。7、AQP3,7和9-水分甘油三聚體AQP3（水和甘油滲透的同源物）的鑒定與水通道蛋白家族的所有成員僅被水滲透的原則相矛盾（Echevarria et al.1994; Ishibashi et al.1994; Ma et al。1994）。 AQP3分布于多個(gè)器官，包括腎臟（Ecelbarger et al.1995），氣道（Nielsen等，1997），皮膚（Nejsum等，2002）和眼（Hamann et al。1998）。甘油滲透已經(jīng)被仔細(xì)記錄（ZeuthenKlaerke，1999），但甘油滲透的生理意義仍然不明確（Yang et al。2001）。在脂肪組織中鑒定出AQP7，并顯示出被水加甘油滲透（Ishibashi等，1997; Kishida等，2000）。 AQP9在肝細(xì)胞中被鑒定，并被顯示為被水，甘油和各種其他小的不帶電荷的溶質(zhì)滲透（Tsukaguchi等1998）。 AQP7在脂肪細(xì)胞中的存在和肝細(xì)胞中的AQP9表明甘油滲透在空腹?fàn)顟B(tài)下可能是重要的。甘油三酸酯在脂肪細(xì)胞中降解，其中AQP7可以提供甘油的出口途徑，并且AQP9可以提供進(jìn)入糖異生發(fā)生的肝細(xì)胞。因此，水甘油聚糖作為甘油轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的生理作用在空腹或饑餓期間可能是重要的。 AQP7和AQP9的功能譜最近被亞砷酸鹽As（OH）3滲透的發(fā)現(xiàn)得到加強(qiáng)（Liu等，2002）。這一令人驚奇的發(fā)現(xiàn)與白細(xì)胞中AQP9的已