乳腺癌基因治療的研究進展.ppt

乳腺癌基因治療研究進展Theresearchprogressofhumanbreastcancergenetherapy 曾趙軍中南大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院分子生物學(xué)系 2 乳腺癌是嚴重危害婦女健康的惡性腫瘤 據(jù)國際抗癌協(xié)會 IARC 公布的統(tǒng)計資料表明 乳腺癌在全世界大多數(shù)地區(qū)的發(fā)病率有逐年增高的趨勢 現(xiàn)已成為女性發(fā)病率最高的惡性腫瘤 第一節(jié)乳腺癌基因治療研究背景 3 乳腺癌的危險因素 1 與發(fā)育 激素水平有關(guān) 2 與營養(yǎng)膳食有關(guān) 3 與家族史和基因改變遺傳因素有關(guān)a 抑癌基因失活b 癌基因異常 4 其它危險因素 4 乳腺癌腫瘤治療模式 手術(shù) 放療 化療 激素治療是腫瘤治療的常規(guī)模式 這些治療方法常難徹底消滅腫瘤細胞又易傷及正常組織 特別是傷害機體的免疫系統(tǒng) 目前腫瘤的基因治療日益受到人們的重視 顯示出良好的應(yīng)用前景 5 乳腺癌發(fā)病的分子機理主要有兩個方面 第一 基因表達異常 最常見的基因表達異常是cyclinD1 neu和ras c myc或Wnt 1原癌基因過表達 第二 基因結(jié)構(gòu)改變 包括染色體缺失與基因擴增 第二節(jié)乳腺癌自殺基因治療的概念 內(nèi)容與特點 6 Breastcancergenetherapyusingtumoursuppressorgenes Clinicaltrialsofp53genereplacementhavehadlimitedsuccess PTENexpressionaltersmetastaticpotentialandreducesneovascularization 7 Prospects TheabilitytoinducegrowtharrestandapoptosisDownstreamtargetsofp53andRbisnecessaryClinicaltrialsofsecond generationoncolyticvirusesCombinationsoftumoursuppressorgenes 8 乳腺癌抗體治療 單克隆抗體Herceptin 賀賽汀 針對HER 2 neu原癌基因的人 鼠嵌合單抗 與細胞表面的erb B2受體結(jié)合 抑制乳腺癌細胞的生長 產(chǎn)生抗體依賴細胞介導(dǎo)的細胞毒作用 免疫基因治療 指在基因水平 通過誘發(fā)或加強機體內(nèi)針對腫瘤細胞表面的腫瘤相關(guān)抗原 TAAs 的特異性免疫反應(yīng) 調(diào)動宿主的免疫系統(tǒng)來識別并破壞癌細胞 乳腺癌組織表達多種TAAs 包括HER 2 neu c er 2 MACG 1和MUC 1等 機體針對這些TAAs產(chǎn)生一定的特異性體液和細胞免疫反應(yīng) 將編碼促進免疫反應(yīng)的細胞因子的基因直接在體內(nèi)轉(zhuǎn)染到腫瘤細胞內(nèi) 或在體外將這些基因轉(zhuǎn)染到腫瘤細胞內(nèi) 在腫瘤細胞經(jīng)放射線照射滅活后 自身移植于體內(nèi) 以增強免疫反應(yīng) 包括IL 2 IL 12 干擾素 粒細胞 巨噬細胞集落刺激因子 GM CSF 等 10 采用特異的靶抗原作為疫苗對腫瘤的免疫反應(yīng)更有效 目前用于乳腺癌免疫治療的特異抗原包括HER 2 CEA MAGE 1 MUC 1等 采用基因工程將編碼這些抗原的基因修飾后 克隆到逆病毒載體 轉(zhuǎn)入體內(nèi) 或在體外采用基因工程 將這些抗原的不同抗原簇克隆 產(chǎn)生不同抗體 篩選出能抑制腫瘤細胞生長的抗體 赫賽汀 Herceptin 就是針對c er 2細胞外區(qū)域不同抗原簇的人單克隆抗體 它可有效抑制c er 2的下游信號傳導(dǎo) 從而抑制乳腺癌細胞的生長 特異性靶抗原的免疫治療 腫瘤抑癌基因治療 野生型p53基因具有通過調(diào)控視網(wǎng)膜母細胞瘤基因控制細胞凋亡 抑制細胞增殖的作用 但是 由于乳腺癌細胞中p53易突變而失活 影響了p53基因治療乳腺癌應(yīng)用 在乳腺癌家族中發(fā)現(xiàn)抑癌基因BRCA1常存在突變而表達過低 在乳腺癌動物模型中采用裝有BRCA1的逆病毒載體 直接注射入瘤內(nèi) 可抑制晚期乳腺癌胸壁轉(zhuǎn)移瘤的生長 化學(xué)基因治療 將耐藥基因 如多藥耐藥基因 MDR 轉(zhuǎn)入造血干細胞 然后自體回輸以增加化療藥物劑量 增強療效 也不影響機體的造血系統(tǒng) Cowan等將4例乳腺癌病人的造血細胞提取后 體外轉(zhuǎn)染MDR基因 并且在體外應(yīng)用大劑量化學(xué)藥物殺死可能污染的腫瘤細胞后 將轉(zhuǎn)染了MDR的造血細胞自身移植 給予大劑量的化學(xué)藥物治療后 3例病人移植細胞中仍可檢測到MDR的表達 轉(zhuǎn)染MDR的細胞存活率與骨髓抑制成反比 無嚴重毒副作用發(fā)生 藥物前體激活基因治療 GPAT 可以利用正常和腫瘤細胞之間的某一基因轉(zhuǎn)錄差異 選擇性驅(qū)動表達導(dǎo)入腫瘤細胞內(nèi)的無活性化療藥物前體轉(zhuǎn)化為有活性的代謝產(chǎn)物 特異性殺傷腫瘤細胞 氟脲類藥物對乳腺癌有殺傷作用 但5 氟胞嘧啶核苷酸 5 FC 作為藥物前體 對細胞無殺傷作用 而它在嘧啶脫氨酶的轉(zhuǎn)化下 可代謝為有活性的5 FU 5 氟尿嘧啶 而具有殺傷腫瘤細胞的能力 化合物中篩選出一種名為維生素B17的化合物 維生素B17可以通過競爭性結(jié)合ATP 不可逆地抑制c er 2活性 而不影響其蛋白表達 動物實驗表明 維生素B17可使c er 2過度表達的乳腺癌腫瘤縮小 顯性基因敲除治療 敲除顯性的癌基因 削弱腫瘤的生長和浸潤能力 研究表明 一種myc反義核酸對雌激素依賴型和非依賴型乳腺癌細胞均有抑制作用 轉(zhuǎn)化生長因子 TNF 的反義信使RNA能夠抑制雌激素誘導(dǎo)的雌激素反應(yīng)性乳腺癌細胞的增殖 抗血管生成基因治療 抗血管生成基因的因子包括內(nèi)皮抑素 血管抑素和干擾素 基于腫瘤和正常內(nèi)皮細胞之間基因表達的差異 選擇性抑制腫瘤內(nèi)皮細胞中異?；虻谋磉_ 抑制腫瘤血管生成 從而達到治療腫瘤的目的 最強的血管生成細胞因子是VEGF 反義核酸 可溶性VEGFR 核糖酶 抗VECF單克隆抗體和受體酪氨酸激酶 RTK 抑制劑已被用于抗腫瘤血管生成的基因治療 18 自殺基因治療乳腺癌的作用機理 病毒載體 病毒蛋白 自殺基因 藥物前體 毒性代謝物 乳腺癌細胞 直接殺傷癌細胞 通過旁觀者效應(yīng)殺傷癌細胞 19 自殺基因HSVtk編碼胸腺嘧啶激酶 在細胞內(nèi) 自殺基因HSVtk能將核苷類似物GCV磷酸化 使其進一步代謝為三磷酸GCV 抑制細胞DNA聚合酶 影響DNA合成 導(dǎo)致細胞死亡 達到清除腫瘤的目的 20 存在的問題 目的基因的表達不受控制 存在過度表達或不適當(dāng)表達 特別是當(dāng)插入基因是一些毒性的基因或?qū)C體有影響時 不僅對疾病的治療不利 甚至?xí)?dǎo)致致命的副作用 21 特異性的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件使治療基因準(zhǔn)確 有效地表達于腫瘤細胞 使治療基因的表達受體外因素的調(diào)控 提高基因治療的有效性和可控性 是基因治療領(lǐng)域的一個重要問題 第三節(jié)乳腺癌自殺基因調(diào)控治療 22 乳腺癌基因治療的調(diào)控元件 1 乳腺癌相關(guān)基因 erbB 2 Muc 1 p53 BRCA1 BRCA2 nm23 p16等 2 組織特異性基因 雌激素反應(yīng)元件 ERE 人 乳白蛋白基因 hALA 羊乳球蛋白基因 oBLG 等 3 缺氧反應(yīng)元件 HRE 等 23 Tet基因表達調(diào)控系統(tǒng) Tet系統(tǒng)利用大腸桿菌抗四環(huán)素操縱子的阻遏與去阻遏作用來調(diào)控基因表達 使基因表達受四環(huán)素的精確調(diào)控 Tet激活系統(tǒng) Tet On 是突變的tet阻遏蛋白與VP16的激活域融合表達rtTA 強力霉素存在時 rtTA與tetOp結(jié)合 激活靶向轉(zhuǎn)錄 24 Tet On調(diào)節(jié)乳腺癌細胞株HSVtk表達及體外調(diào)控性治療作用的實驗研究 25 重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pRevTRE tk的構(gòu)建 PCR擴增獲得HSVtk基因DNA片段 設(shè)計引物時 在引物TK1的5 加上BamH 酶切位點 引物TK2的5 加上Hind 酶切位點 定向克隆到pRevTRE質(zhì)粒上 得到pRevTRE tk質(zhì)粒 26 重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pRevTRE tk的鑒定 M12 圖1重組質(zhì)粒pRevTRE tk的酶切鑒定結(jié)果M DNA Hind DNAMarkerlane1 pRevTRE HSVtk BamHI Hind lane2 pRevTRE HSVtkplasmidDNA 圖2重組質(zhì)粒pRevTRE tk的PCR鑒定結(jié)果M 100bpDNAladderMarker lane1 PCRproductwithprimerTK1andTK2 lane2 PCRproductwithprimerTK3andTK4 27 MCF 7細胞轉(zhuǎn)染實驗 MCF TRE tk Tet On 28 Tet On基因調(diào)控系統(tǒng)中 其發(fā)揮作用所需的兩個組成元件 TRE元件和rtTA元件 分別克隆于兩個載體系統(tǒng)中 使用時先將含有TRE元件和目的基因轉(zhuǎn)染入宿主細胞 然后再以含有rtTA的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染該細胞 經(jīng)過兩次轉(zhuǎn)染而構(gòu)建出細胞株 29 MCF TRE tk Tet On細胞HSVtk基因的表達 圖3Dox調(diào)節(jié)MCF TRE tk Tet On細胞中HSVtk基因的表達M 100bpDNAMarker Lane1 6代表Dox濃度為0 0 1 1 10 100 1000 g ml時細胞HSVtk基因的表達 30 MTT法檢測分析MCF TRE tk Tet On細胞存活率 圖4在Dox濃度為1 g ml時 MTT法檢測GCV不同濃度時MCF TRE tk Tet On細胞存活率的變化 31 Dox濃度對MCF TRE tk Tet On細胞生長的影響 圖5GCV濃度為1 g ml時 不同濃度Dox對MCF TRE tk Tet On細胞存活數(shù)的影響 32 旁觀者效應(yīng) 表1MCF TRE tk Tet On細胞旁觀者效應(yīng)的克隆記數(shù) 33 可調(diào)控性自殺基因乳腺癌動物模型的建立 以表達HSVtk基因及調(diào)控系統(tǒng)Tet On的乳腺癌細胞MCF TRE tk Tet On直接接種SCID小鼠成功建立了可調(diào)控性自殺基因乳腺癌動物模型 為探討自殺基因體外調(diào)控機制的研究奠定了基礎(chǔ) 34 SCID小鼠體內(nèi)成瘤及治療前后腫瘤大小的變化 圖6乳腺癌細胞MCF TRE tk Tet On接種SCID小鼠后 NS組 GCV組 GCV Dox組SCID小鼠腫瘤體積的變化 35 SCID小鼠腫瘤組織病理學(xué)觀察 圖7三組 NS組 GCV組 GCV Dox組 SCID乳腺癌小鼠經(jīng)治療15天后腫瘤組織病理學(xué)觀察H E染色 250 NS對照組 GCV治療組 Dox GCV治療組 36 RT PCR檢測SCID小鼠腫瘤組織HSVtk的表達 M123 圖8RT PCR檢測各組SCID小鼠腫瘤治療15天后HSVtk的表達M 100bpMarker 1 GCV治療組 2 Dox GCV治療組 3 NS對照組 37 研究背景 逆轉(zhuǎn)錄病毒載體用于exvivo基因治療 實際感染效率低 原因 一 感染正在分裂的細胞 二 獲得病毒滴度低 三 病毒半衰期短 移動距離有限 在一個半衰期內(nèi)大多數(shù)病毒不能到達靶細胞 重組逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的HSVtk基因表達及提高逆病毒滴度的初步研究 38 逆轉(zhuǎn)錄病毒的純化 將初步濃縮的病毒液經(jīng)冷凍干燥去除更多的水分 以小體積的緩沖液 DMEM 復(fù)溶后 70 凍存得到濃縮病毒液 39 產(chǎn)毒PA317陽性細胞克隆篩選培養(yǎng) 圖14微乒乓感染pRevTRE HSVtk pRevTet On pRevTRE載體的PA317細胞經(jīng)潮霉素B G418篩選2周后形成的抗性克隆 100 40 不同培養(yǎng)時間與重組病毒滴度的關(guān)系 圖9不同培養(yǎng)時間對克隆PA317細胞產(chǎn)生重組病毒滴度的測定 41 不同丁酸鈉濃度和重組病毒滴度的關(guān)系 05101520 圖10不同丁酸鈉濃度下對克隆PA317細胞培養(yǎng)30h產(chǎn)生重組病毒滴度的測定 42 SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測有無病毒蛋白表達 圖11克隆PA317細胞上清SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳M 蛋白質(zhì)分子標(biāo)準(zhǔn) Lane1 pRevTREDNA轉(zhuǎn)染PA31730h后細胞上清 Lane2 pRevTRE tkDNA轉(zhuǎn)染PA31730h后細胞上清 43 PCR檢測克隆的細胞上清有無HSVtk基因插入片段 圖12轉(zhuǎn)染PA317細胞上清PCR擴增HSVtk基因M 100bpDNA標(biāo)準(zhǔn)物 Lane1 pRevTRE tkDNA轉(zhuǎn)染PA31730h后細胞上清 Lane2 pRevTREDNA轉(zhuǎn)染PA31730h后細胞上清 44 RT PCR檢測被逆轉(zhuǎn)錄病毒濃縮液感染的MCF 7細胞中HSVtk基因的表達 actin420bp 圖13逆轉(zhuǎn)錄病毒濃縮液感染的MCF 7細胞中HSVtk基因的表達M 100bpDNA標(biāo)準(zhǔn)物 Lane1 MCF 7細胞 Lane2 被重組逆轉(zhuǎn)錄病毒液感染的MCF 7細胞 45 產(chǎn)毒性細胞系分泌重組病毒的PCR鑒定 圖15pRevTRE tk pRevTet On pRevTRE乒乓轉(zhuǎn)染的PA317細胞上清PCR擴增目的基因M 100bpladdermarker 1 轉(zhuǎn)染pRevTRE HSVtk質(zhì)粒載體的克隆PA317細胞上清 2 轉(zhuǎn)染pRevTet On質(zhì)粒載體的克隆PA317細胞上清 3 轉(zhuǎn)染pRevTRE質(zhì)粒載體的克PA317細胞上清 46 重組病毒感染MCF 7細胞及陽性克隆細胞株的篩選 圖16重組病毒感染MCF 7細胞后篩選的潮霉素B和G418抗性克隆 100 可調(diào)控性重組逆轉(zhuǎn)錄病毒在乳腺癌基因治療中的實驗研究 47 制備重組逆轉(zhuǎn)錄病毒RevTRE HSVtk和RevTet On 然后通過逆轉(zhuǎn)錄病毒感染靶細胞 將Tet On基因調(diào)控系統(tǒng)中的反應(yīng)元件TRE和rtTA調(diào)控元件共同整合到同一宿主細胞中 使目的基因?qū)氚屑毎?并處于Tet On基因的有效調(diào)控 同時也提高了外源目的基因的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率 48 病毒感染細胞基因組DNA的提取與酶切 圖17病毒感染細胞基因組DNA的提取與酶切圖M LambdaDNA EcoRI Hind DNAMarker 1 逆病毒RevTRE HSVtk和RevTet On感染MCF 7細胞基因組DNA 2 MCF 7細胞基因組DNA 3 MCF 7細胞基因組DNAEcoRI酶切 4 逆病毒RevTRE HSVtk RevTet On感染MCF 7細胞基因組DNAEcoRI酶切 49 逆病毒感染細胞Southern印跡雜交分析 M123 圖18細胞Southern印跡雜交分析圖M 100bpladdermarker 1 MCF 7細胞 2 逆病毒RevTRE HSVtk RevTet On一次感染的MCF 7細胞 3 逆病毒RevTRE HSVtk RevTet On重復(fù)感染的MCF 7細胞 50 利用微乒乓感染的方法將制備的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒RevTRE HSVtk和RevTet On導(dǎo)入乳腺癌細胞株MCF 7細胞 實驗中觀察到 HSVtk基因的表達受Dox的誘導(dǎo)調(diào)控 隨著Dox的濃度增高 GCV對乳腺癌細胞的殺傷能力加強 51 臺盼藍排斥試驗和細胞計數(shù)分析檢測細胞活力 圖19不同Dox濃度誘導(dǎo)下臺盼藍排斥試驗和細胞計數(shù) 52 MTT法檢測重組病毒感染的MCF 7細胞不同藥物濃度誘導(dǎo)24h的存活率 n 4 n 4 53 流式細胞分析 圖20流式細胞儀 FCM 檢測細胞凋亡圖1 MCF 7細胞 2 逆病毒RevTRE HSVtk RevTet On感染的MCF 7細胞 3 1 g mlDox 2 g mlGCV作用48h的逆轉(zhuǎn)錄病毒感染MCF 7細胞 54 流式細胞儀 FCM 檢測細胞周期 圖21流式細胞儀 FCM 檢測細胞周期圖1 MCF 7細胞 2 逆病毒RevTRE HSVtk RevTet On感染的MCF 7