液相色譜儀常見問題及處理方法

液相色譜常見問題及處理方法 HPLC靈敏度不夠的主要原因及解決辦法 1、樣品量不足，解決辦法為增加樣品量 2、樣品未從柱子中流出。可根據(jù)樣品的化學(xué)性質(zhì)改變流動(dòng)相或柱子 3、樣品與檢測器不匹配。根據(jù)樣品化學(xué)性質(zhì)調(diào)整波長或改換檢測器 4、檢測器衰減太多。調(diào)整衰減即可。 5、檢測器時(shí)間常數(shù)太大。解決辦法為降低時(shí)間參數(shù) 6、檢測器池窗污染。解決辦法為清洗池窗。 7、檢測池中有氣泡。解決辦法為排氣。 8、流動(dòng)相流量不合適。調(diào)整流速即可。 為什么HPLC柱柱壓過高 柱壓過高是HPLC柱用戶最常碰到的問題。其原因有多方面，而且常常并不是柱子本身的問題，您可按下面步驟檢查問題的起因。 1、拆去保護(hù)預(yù)柱，看柱壓是否還高，否則是保護(hù)柱的問題，若柱壓仍高，再檢查（在安裝了保護(hù)預(yù)柱的情況下）； 2、把色譜柱從儀器上取下，看壓力是否下降，若壓力仍高則是管路堵塞，需清洗，若壓力下降，再檢查； 3、將柱子的進(jìn)出口反過來接在儀器上，用10倍柱體積的流動(dòng)相沖洗柱子，（此時(shí)不要連接檢測器，以防固體顆粒進(jìn)入流動(dòng)池）。這時(shí)，如果柱壓仍不下降，再檢查； 4、更換柱子入口篩板，若柱壓下降，說明您的溶劑或樣品含有顆粒雜質(zhì)，正是這些雜質(zhì)將篩板堵塞引起壓力上升。若柱壓還高，請與廠商聯(lián)系。 液相色譜中峰出現(xiàn)拖尾或出現(xiàn)雙峰的原因是什么？ 1、篩板堵塞或柱失效，解決辦法是反向沖洗柱子，替換篩板或更換柱子。 2、存在干擾峰，解決辦法為使用較長的柱子，改換流動(dòng)相或更換選擇性好的柱子 如何解決HPLC進(jìn)行分析時(shí)保留時(shí)間發(fā)生漂移或急速變化 漂移現(xiàn)象 1、溫度控制不好，解決方法是采用恒溫裝置，保持柱溫恒定 2、流動(dòng)相發(fā)生變化，解決辦法是防止流動(dòng)相發(fā)生蒸發(fā)、反應(yīng)等 3、柱子未平衡好，需對柱子進(jìn)行更長時(shí)間的平衡 快速變化現(xiàn)象 1. 流速發(fā)生變化，解決辦法是重新設(shè)定流速，使之保持穩(wěn)定 2、泵中有氣泡，可通過排氣等操作將氣泡趕出。 3、流動(dòng)相不合適，解決辦法為改換流動(dòng)相或使流動(dòng)相在控制室內(nèi)進(jìn)行適當(dāng)混合 HPLC 儀器問題 1、 我的HPLC泵壓明顯的偏高，請問可能的原因？ 答：流速設(shè)定過高；流動(dòng)相或進(jìn)樣中有機(jī)械雜質(zhì)，造成保護(hù)柱、柱前篩板或在線過濾器阻塞；流動(dòng)相粘度過大；柱溫過低；緩沖鹽結(jié)晶；壓力傳感器故障。 2、 基線不穩(wěn)，上下波動(dòng)或漂移的原因是什么，如何解決？ 答：a.流動(dòng)相有溶解氣體；用超聲波脫氣15-30分鐘或用充氦氣脫氣 b.單向閥堵塞；取下單向閥，用超聲波在純水中超20分鐘左右，去處堵塞物 c.泵密封損壞，造成壓力波動(dòng)；更換泵密封 d.系統(tǒng)存在漏液點(diǎn)；確定漏液位置并維修 f.柱后產(chǎn)生氣泡；流通池出液口加負(fù)壓調(diào)整器 g.檢測器沒有設(shè)定在最大吸收波長處；將波長調(diào)整至最大吸收波長處 h.柱平衡慢，特別是流動(dòng)相發(fā)生變化時(shí)；用中等強(qiáng)度的溶劑進(jìn)行沖洗，更改流動(dòng)相時(shí)，在分析前用10-20倍體積的新流動(dòng)相對柱子進(jìn)行沖洗。 3、 接頭處為何經(jīng)常漏液，如何處理？ 答：接頭沒有擰緊；擰松后再緊，手緊接頭以手勁為限，不要使用工具，不銹鋼接頭先用手?jǐn)Q緊，再用專用扳手緊1/4-1/2圈，注意接頭中的管路一定要通到底，否則會(huì)留下死體積。接頭被污染或磨損；建議更換接頭。接頭不匹配，建議使用同一品牌的配件。 4、 進(jìn)樣閥漏液是如何造成的？ 答：a.轉(zhuǎn)子密封損壞；更換轉(zhuǎn)子密封 b.定量環(huán)阻塞；清洗或更換定量環(huán) c.進(jìn)樣口密封松動(dòng)；調(diào)整松緊度 d.進(jìn)樣針頭尺寸不合適，一般是過短；使用恰當(dāng)?shù)倪M(jìn)樣針（注意針頭形狀） e.廢液管中產(chǎn)生虹吸；清空廢液管 譜圖問題 1、 問：造成峰拖尾的原因是什么，如何消除？ 答：a.篩板阻塞；反沖色譜柱、更換進(jìn)口篩板 b.色譜柱塌陷；填充色譜柱 c.有干擾物質(zhì)的存在；使用更長的色譜柱、改變流動(dòng)相或更換色譜柱 e.流動(dòng)相PH值不合適；調(diào)整PH值，對于堿性化合物，低PH值更有利于得到對稱峰 f.樣品與填料表面的溶化點(diǎn)發(fā)生反應(yīng)；加入離子對試劑或堿性揮發(fā)性修飾劑或更改色譜柱 2、 問：造成峰分叉的原因是什么，如何消除？ 答：保護(hù)柱或分析柱污染；取下保護(hù)柱再進(jìn)行分析。如果必要更換保護(hù)柱。如果分析柱阻塞，拆下來清洗。如果問題仍然存在，可能是柱子被強(qiáng)保留物質(zhì)污染，運(yùn)用適當(dāng)?shù)脑偕胧?。如果問題仍然存在，入口可能被阻塞，更換篩板或更換色譜柱。樣品溶劑不溶于流動(dòng)相；改變樣品溶劑，如果可能采取流動(dòng)相作為樣品溶劑。 3、 問：K值增加時(shí)，拖尾更嚴(yán)重，這是為什么？ 答：反相模式，二級保留效應(yīng)； a.加入三乙胺（或堿性樣品） b.加入乙酸（或酸性樣品） c.加入鹽或緩沖劑（或離子化樣品） d.更換一支柱子 4、 問：保留時(shí)間的波動(dòng)有幾種可能的原因？ 答：溫控不當(dāng)；調(diào)節(jié)好柱溫。流動(dòng)相組分變化；防止流動(dòng)相蒸發(fā)、反應(yīng)等，做梯度時(shí)尤其要注意流動(dòng)相混合的均勻。色譜柱沒有平衡；在每一次運(yùn)行之前給予足夠的時(shí)間平衡色譜柱。 液相色譜常用符號與術(shù)語表 ACN 乙腈 Acetonitrile AUFS 滿量程的吸光度單位 Absorbance units, full scale As 峰不對稱因子 B 二元流動(dòng)相中的強(qiáng)溶劑；例如：反相HPLC的甲醇/水混合液中的甲醇 BSA 牛血清白蛋白（一種蛋白質(zhì)） Bovine serum albumin CAF 咖啡因（中性溶質(zhì)） Caffeine CRF 色譜響應(yīng)因子 Chromatographic response function；色譜圖總分離度的定量指標(biāo) dc 色譜柱內(nèi)徑（cm） DMOA 二甲基辛胺 Dimethyloctylamine DNB 2,4-二硝基甲酰（基） 2，4-Dinitrobenzoyl dp 色譜柱填料的粒度（cm） DRYLAB 液相資源公司（LC Resources INC.)的計(jì)算機(jī)模擬軟件。DRYLAB I用于等度預(yù)測，DRYLAB G用于梯度預(yù)測 F 流動(dòng)相的流速（ml/min） FC-113 1，1，2-三氟-1，2，2-三氯乙烷 GPC 凝膠滲透色譜法 Gel-permeation chromatography HA 酸性溶質(zhì)，能電離出A- Hex 己烷 Hexane hr 二相鄰譜帶之間的谷高 HVA 高香草酸 Homovanillic acid h 峰高 h1,h2 相鄰譜峰1和譜峰2的峰高 IEC 離子交換色譜法 Ion-exchange chromatography IP 離子對 Ion-pair IPC 離子對色譜法 Ion-pair chromatography J 色譜峰強(qiáng)度參數(shù) K 所給譜峰的容量因子，k=(tR-t0)/t0=tR/t0，tR=t0(1+k) k 梯度洗脫過程中，某溶質(zhì)的k的平均值或有效值 kw 以水做流動(dòng)相k的外推值 k1,k2 相鄰譜峰1和譜峰2的容量因子 L 色譜柱長度（cm） Lc 檢測器流動(dòng)池光路的長度（cm） M 溶質(zhì)的分子量 MC 二氯甲烷 Methylene chloride MDST 混合設(shè)計(jì)統(tǒng)計(jì)技術(shù) Mixture-design statistical technique；一種優(yōu)化流動(dòng)相的軟件 MeOH 甲醇 Methanol MTBE 甲基叔丁醚 Methyl-t-butyl ether MW 溶質(zhì)的分子量 N 色譜柱塔板數(shù) NAPA N-乙酰普魯卡因胺 N-Acetylprocainamide（堿性溶質(zhì)） N0 檢測器的基線噪音 ODS 十八烷基硅烷 Octadecylsilyl P 色譜柱的壓力降通常以巴（bar）表示，也用psi；另外，也用作柱極性參數(shù) PA 普魯卡因胺 Procainamide（堿性物質(zhì)） PAH 聚芳香烴 Polyaromatic Hydrocarbon PESOS 優(yōu)化流動(dòng)相的計(jì)算機(jī)軟件（美國Perkin-Elmer產(chǎn)品） pKa 溶質(zhì)酸性常數(shù)的負(fù)對數(shù)；當(dāng)pH=pKa時(shí)，溶質(zhì)中有一半是電離的 Rk 保留值范圍，Rk=（最末譜峰k）/（最初譜峰k） RRM 相對分離度圖（通常N=10000） Rs 相鄰二譜峰的分離度 S 當(dāng)流動(dòng)相中的%B改變時(shí)，測量溶質(zhì)保留值的變化速率的參數(shù) SAL 水楊酸 Salicylic Acid SEC 尺寸排阻色譜法 Size-exclusion chromatography S/N 信噪比 Signal to noise ratio t 分離時(shí)間（min）（樣品進(jìn)樣時(shí)t=0） tp 梯度系統(tǒng)的滯后時(shí)間（min） TBA 四丁基銨離子 Tetrabutylammonium ion TEA 三乙胺 Triethylamine THF 四氫呋喃 Tetrahydrofuran tk 在用于校正等度洗脫溶劑強(qiáng)度的流動(dòng)相離開梯度混合器時(shí)，梯度洗脫的時(shí)間 TLC 薄層色譜法 Thin-layer chromatography TMA 四甲基銨 Tetramethylammonium（鹽） TMS 三甲基硅烷 Trimethylsilyl 高效液相色譜儀操作步驟： 1)、過濾流動(dòng)相，根據(jù)需要選擇不同的濾膜。 2)、對抽濾后的流動(dòng)相進(jìn)行超聲脫氣10-20分鐘。 3)、打開HPLC工作站（包括計(jì)算機(jī)軟件和色譜儀），連接好流動(dòng)相管道，連接檢測系統(tǒng)。 4)、有一段時(shí)間沒用，或者換了新的流動(dòng)相，需要先沖洗泵和進(jìn)樣閥。沖洗泵，直接在泵的出水口，用針頭抽取。沖洗進(jìn)樣閥，沖洗時(shí)速度不要超過3 ml/min。 5)、調(diào)節(jié)流量，初次使用新的流動(dòng)相，可以先試一下壓力，流速越大，壓力越大，一般不要超過25MP。選用合適的流速