【畢業(yè)學(xué)位論文】(Word原稿)青枯雷爾氏菌(Ralstonia solanacearum)致病力分化的研究-應(yīng)用微生物學(xué)

分類號： 單位代碼： 10389 密 級： 學(xué) 號： 建農(nóng)林大學(xué)碩士學(xué)位論文 青枯雷爾氏菌 (致病力分化的研究 學(xué) 科 門 類：理學(xué) 一級學(xué)科名稱：生物學(xué) 二級學(xué)科名稱：微生物學(xué) 研 究 方 向：應(yīng)用微生物 研 究 生： 指 導(dǎo) 教 師： 研究員 完 成 時 間：二 O 一 O 年四月 he on of 2010 獨(dú)創(chuàng)性聲明 本人聲明，所呈交的學(xué)位（畢業(yè)）論文，是本人在指導(dǎo)教師的指導(dǎo)下獨(dú)立完成的研究成果，并且是自己撰寫的。盡我所知，除了文中作了標(biāo)注和致謝中已作了答謝的地方外，論文中不包含其他人發(fā)表或撰寫過的研究成果。與 我一同對本研究做出貢獻(xiàn)的同志，都在論文中作了明確的說明并表示了謝意，如被查有侵犯他人知識產(chǎn)權(quán)的行為，由本人承擔(dān)應(yīng)有的責(zé)任。 學(xué)位（畢業(yè)）論文作者親筆簽名： 日期： 論文使用授權(quán)的說明 本人完全了解福建農(nóng)林大學(xué)有關(guān)保留、使用學(xué)位（畢業(yè)）論文的規(guī)定，即學(xué)校有權(quán)送交論文的復(fù)印件，允許論文被查閱和借閱 ; 學(xué)?？梢怨颊撐牡娜炕虿糠謨?nèi)容，可以采用影印、縮印或其他復(fù)制手段保存論文。 保密，在 年后解密可適用本授權(quán)書。 不保密，本論文屬 于不保密。 學(xué)位（畢業(yè)）論文作者親筆簽名： 日期： 指導(dǎo)教師親筆簽名： 日期： i 目 錄 中文摘要 . 一章 緒論 . 1 1 關(guān)于作物 青枯病 . 1 枯病的發(fā)生與危害 . 1 枯病的防治 . 1 2 青枯雷爾氏菌及其致病機(jī)理 . 2 枯雷爾氏菌 . 2 枯雷爾氏菌的致病機(jī)理 . 2 3 青枯雷爾氏菌種下分化 . 3 4 青枯雷爾氏菌致病力分化的分子機(jī)理 . 4 合成相關(guān)基因 . 4 外蛋白及 分泌系統(tǒng)和 分泌系統(tǒng)的相關(guān)基因 . 4 絡(luò)狀調(diào)節(jié)系統(tǒng)相關(guān)基因 . 5 5 研究目的及創(chuàng)新性 . 6 第二章 不同作物中的青枯雷爾氏菌致病力分化 . 7 1 前言 . 7 2 材料與方法 . 7 料 . 7 法 . 7 計 . 8 3 結(jié)果與分析 . 8 枯雷爾氏菌的鑒定 . 8 枯雷爾氏菌致病力的測定 . 9 茄植株中青枯雷爾氏菌分布及致病力分化 . 11 生植株中青枯雷爾氏菌分布及致病力分化 . 12 姜植株中青枯雷爾氏菌分布及致病力分化 . 12 4 討論 . 13 第三章 生防菌作用下青枯雷爾氏菌致病力分化的研究 . 15 1 前言 . 15 2 材料與方法 . 15 料 . 15 法 . 16 計 . 16 3 結(jié)果與分析 . 17 防菌作用下青枯雷爾氏菌致病力分化 . 17 防菌持續(xù)作用下青枯雷爾氏菌 致病力分化 . 18 枯雷爾氏菌 繼代培養(yǎng)過程的致病力分化 . 19 4 討論 . 20 第四章 青枯雷爾氏菌致病力分化的分子機(jī)理 . 22 1 前言 . 22 材料和方法 . 22 料 . 22 法 . 22 計 . 23 3 結(jié)果與分析 . 24 枯雷爾氏菌的轉(zhuǎn)化 . 24 枯雷爾氏菌 變株 因的驗證 . 24 枯雷爾氏菌 變株的遺傳穩(wěn)定性 . 25 枯雷爾氏菌突變株致病力測定 . 26 枯雷爾氏菌無致病力突變株插入位點 . 28 4 討論 . 29 第五章 青枯雷爾氏菌無致病力突變株與原始菌株的生物學(xué)異質(zhì)性研究 . 31 1 前言 . 31 2 材料和方法 . 31 料 . 31 法 . 31 計 . 33 3 結(jié)果與分析 . 33 始 對無致病力突變株生長的影響 . 33 養(yǎng)溫度對無致病力突變株生長的影響 . 34 致病力突變株生長曲線異質(zhì)性 . 34 致病力突變株胞外多糖含量異質(zhì)性 . 35 致病力突變株 體培養(yǎng)基分光光度計吸收峰分析 . 36 4 討論 . 37 第六章 結(jié)論與展望 . 39 參考文獻(xiàn) . 41 附錄 . 46 個人簡歷 . 49 致 謝 . 50 I 中文摘要 通過對青枯病不同發(fā)病時期不同部位的番茄、花生和生姜植株的青枯雷爾氏菌進(jìn)行分離，從番茄青枯病發(fā)病初期的病株根部和青枯病發(fā)病后期的病株莖中部分離到的青枯菌中除了強(qiáng)致病力的菌株外，還分離到少量無致病力的菌株，從生姜病株的莖上分離到的青枯菌 均為 無致病力的菌株。 通過 生防菌 青枯雷爾氏菌 1： 1 共培養(yǎng)試驗，表明生防菌 是對不同菌株的抑制率有所差異，生 防菌對 株的抑制率僅為 對 抵制率較高， 對其他菌株的抑制率介于 間。對強(qiáng)致病力青枯雷爾氏菌 續(xù) 5 代的繼代培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn) 出現(xiàn)致病力分化，而第五代時 出現(xiàn)致病力分化。生防菌 續(xù)處理 3 代后，未出現(xiàn)致病力分化，對 一次處理后即出現(xiàn)無致病力菌株的分化。 通過 座子隨機(jī)插入青枯雷爾氏菌 （ 獲得 1004 株轉(zhuǎn)座子隨機(jī)插入突變株，經(jīng)過在 板上的形態(tài)特征篩選 ,其中有 13 株突變株具有無致病力青枯雷爾氏菌的形態(tài)特征。對其中 5 株無致病力突變株進(jìn)行反向 序和序列比對，分析鑒定出這些年株青枯雷爾氏菌突變株的插入位點在 因和因上，經(jīng)番茄盆栽苗致病力檢測 ,確定為無致病力菌株。比較了這 5 株突變株與原始菌株的生理生化特性，這 5 株突變株的生長速率和相對胞外多糖含量顯著低于 最適 和最適溫度未發(fā)生變化。 5 株突變株 體培養(yǎng)基上清液在紫外 00長上吸收峰的掃描結(jié)果，通過聚類分析發(fā)現(xiàn)這 5 株突變 株與原始菌株 別聚為不同的三類，即 第I 類， 因突變株為第 ， 因突變株為第 。 關(guān)鍵字： 青枯雷爾氏菌，致病力，分化， 座子，突變 of in of in of in of of in of of of in It . of no of in it in it to no on of it s at 1004 n5 3 TC of of in by of of pH of 00 of of it be I II 青枯雷爾氏菌 (病力分化的研究 1 第一章 緒論 1 關(guān)于作物 青枯病 枯病的發(fā)生與危害 細(xì)菌性青枯?。?由其病原菌青枯雷爾氏菌（ 起的一種毀滅性的土傳病害，它廣泛分部于熱帶、亞熱帶和溫帶地區(qū)，在我國南方各省發(fā)病嚴(yán)重。由于溫室效應(yīng)，氣溫升高，其分布范圍向更高緯度的地區(qū)擴(kuò)展 1,2,3。青枯雷爾氏菌可以適應(yīng)不同的環(huán)境，使得被侵染的寄主中有木本植物和草本植物，有一年生植物和多年生植物，有種子植物和被子植物，有雙子葉植物和單子葉植物等，給青枯病的防治帶來很大的困難 4。它所危害的宿主植物超過 50 個科，包括番茄、茄子、辣椒、煙草、馬鈴署、花生等重要農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)作物 5及桉樹、木麻黃、桑樹等樹木 6，造成較嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)缺失。 枯病的防治 青枯病的防治 在國內(nèi)外均有廣泛的報道，主要通過農(nóng)業(yè)措施、化學(xué)藥劑、先育高抗品種和生物制劑等進(jìn)行防治，其中生物防治得到最廣泛的關(guān)注。 由于我國耕地有限，輪作等 7農(nóng)業(yè)措施受到很大的限制。利用化學(xué)農(nóng)藥 如：康地蕾得、青萎散、青枯靈、硫酸鏈霉素等 對青枯病進(jìn)行防治面臨環(huán)境污染， 而且存在 青枯雷爾氏菌對化學(xué)農(nóng)藥產(chǎn)生抗藥性，防效不高等諸 多問題 8,9。而選育作物抗病新品種，雖然已篩選獲得部分 抗原材料和 高抗品種 10但是 由于對抗病性能高的抗源材料的獲得較難，且由于青枯雷爾氏菌的高度種下分化，使抗病品種無法大面積推廣及抗病性能的退化的原因，制約了選育抗病新品種的發(fā)展。因此，研究采用無毒，環(huán)保的微生物（細(xì)菌、真菌和放射線菌）農(nóng)藥防治青枯病越來越受到關(guān)注。它們主要是從土壤中分離、從內(nèi)生菌中篩選及構(gòu)建基因工程菌等方法獲得。朱育菁等（ 2004）研制的 劑對連作重病區(qū)的茄子青枯病具有良好的防治效果 ， 同時對茄子植株具有顯著促長作 用 16。徐玲等（ 2006）利用從番茄根際分離到的一株多粘類芽孢桿菌防治青枯病，獲得很好的效果 17。朱紅惠等（ 2004）測定了 菌對青枯菌的抑制作用，結(jié)果表明，在接種青枯菌前 4 天接種 菌，可以明顯降低青枯菌在番茄根面和木質(zhì)部的數(shù)量 18。潘文道等（ 2008）測定了放線菌 番茄青枯病的防效，結(jié)果表明在先接種放線菌 再接種青枯菌，其防治效果達(dá)到 19。 對于利用無致病力青枯雷爾氏菌菌株防治青枯病國內(nèi)外做了大量的研究，并有廣泛報道，為防治青枯病提供了新的研究思 路。肖田等 (2008)初步研究了青枯雷爾氏菌無致病力菌株對煙草青枯病的控病作用，取得較好的控病效果，兩株無致病力青枯雷爾氏菌 20 天后的相對防效分別達(dá)到 97%20。 無致病力青枯雷爾氏菌可通過物理誘變、自發(fā)突變和基因工程等手段獲得。 et (1994)， 福建農(nóng)林大學(xué)碩士學(xué)位論文 2 楊宇紅等 (2008)利用基因工程法獲得了無致病力的 21,22， et 1990)、康耀衛(wèi)等 (1995)利用 入突變法獲得青枯雷爾氏菌胞外蛋白分泌缺失的突變株 23,24、羅寬等 (1983)、陳慶河等 (2003)利用 射和紫外光誘變 25,26、王羽等（ 2004）利用分離自發(fā)突變株 27等方法獲得了許多無致病力青枯突變株。關(guān)于無致病力青枯雷爾氏菌在防治青枯病方面的機(jī)理研究主要集中在無致病力誘導(dǎo)宿主植物產(chǎn)生抗性和無致病力青枯雷爾氏菌所產(chǎn)細(xì)菌素的抑菌作用兩方面。何禮遠(yuǎn)等 (1990)研究了通過無致病力青枯雷爾氏菌誘導(dǎo)花生植株產(chǎn)生抗病性，結(jié)果表明經(jīng)花生莖部毛細(xì)管滴注接種 ,可誘導(dǎo)花生莖部產(chǎn)生抗病性 ,并可維持 10天以上 ,且具有一定傳導(dǎo)性，而花生種子接種無致病力青枯雷爾氏菌菌株后不能誘導(dǎo)花生地上部分的抗病性 ,但可以有效地防止土壤中青枯菌對花生根部的浸染 ,種植42 天后的青枯病防治效果仍可達(dá)到 28；董春等 (1999)利用產(chǎn)細(xì)菌素的無致病力青枯雷爾氏菌株防治番茄青枯病，并認(rèn)為細(xì)菌素的抑菌作用和無致病力菌株誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生抗性這兩方面都對防治青枯病上起作用 29。張賽群等（ 2008）研究表明在接種無致病力青枯雷爾氏菌以后，植物抗病反應(yīng)中的關(guān)鍵物質(zhì)（ 酶類（ 有顯著上升，而分解 性處于被抑制狀態(tài)，并推測接種后抗病蛋白產(chǎn)量也相應(yīng)增加 30。 2 青枯雷爾 氏菌及其致病機(jī)理 枯雷爾氏菌 青枯雷爾氏菌的菌體呈短桿狀，革蘭氏染色陰性，具有極生鞭毛，有運(yùn)動性，不形成莢膜和芽孢，菌體 大小為 落在 養(yǎng)基上有兩種形態(tài)特征：一種為菌落流動性強(qiáng)，白邊較寬，中心呈淺紅色，這是強(qiáng)致病性的野生型菌株；另一種為菌落干燥，扁平，白邊很窄，中心呈暗紅色，這是致病性弱或喪失致病性的變異型菌株 3。 枯雷爾氏菌的致病機(jī)理 目前世界上對青枯雷爾氏菌的致病機(jī)理已進(jìn)行了廣泛的研究，青枯雷爾氏菌經(jīng)過植物根部的受損部位和根冠部位侵染植 物，隨后由維管組織擴(kuò)散進(jìn)入莖部31。青枯雷爾氏菌的致病性是多方面的且復(fù)雜的現(xiàn)象。青枯雷爾氏菌的產(chǎn)生多種致病因子包括胞外多糖（ ），多聚半乳糖醛酸酶 32和內(nèi)切葡聚糖酶 33等植物細(xì)胞壁降解酶類及生長素、細(xì)胞分裂素和乙烯 34等植物激素。對其致病機(jī)理的研究主要集中在它的胞外多糖，果膠酶和纖維素酶上。 1958）首次報道了青枯雷爾氏菌發(fā)酵液離心后的上清液能夠使番茄枝條萎蔫，而缺乏 35。因此認(rèn)為植物體內(nèi)的青枯雷爾氏菌分泌的胞外多 糖，堵塞導(dǎo)管，阻礙植物的水分運(yùn)輸，從而表現(xiàn)出萎蔫的癥狀。另外 ， 而使寄主植物的免疫系統(tǒng)無法識別和攻擊青枯雷爾氏菌 36遺傳學(xué)研究也已證明 是青枯雷爾氏菌關(guān)鍵的致病因子 40。 青枯雷爾氏菌 (病力分化的研究 3 3 青枯雷爾氏菌種下分化 青枯雷爾氏菌是一個非常復(fù)雜的類群，呈現(xiàn)出高度的種下分化的多態(tài)性。 41根據(jù)青枯雷爾氏菌對不同寄主致病性的表現(xiàn)進(jìn)行劃分為稱為生理小種（ 至 60 年代，已命名了 4 個生理小種（見表 1）。何禮遠(yuǎn)等 42將不同于國 外報道的部分桑青枯雷爾氏菌菌株命名為 5 號生理小種。 表 1 青枯雷爾氏菌生理小種（盧同， 1998） 43 . 1998） 小種 侵染作物 煙草過敏反應(yīng) 小種 1 煙草及多種茄科植物 產(chǎn)生壞死枯斑 產(chǎn)生大量黑色素 小種 2 只侵染香蕉與海里康 產(chǎn)生過敏反應(yīng) 不產(chǎn)生黑色素 小種 3 能侵染馬鈴薯和番茄 產(chǎn)生黃化斑 產(chǎn)生少量黑色素 小種 4 能侵染馬鈴薯和茄子 產(chǎn)生過敏反應(yīng) 對酪氨酸酶活性中等 1964）根據(jù)青枯雷爾氏菌對 3 種雙糖（乳糖、麥芽糖和纖維二糖）和 3 種醇（甘露醇、甜醇和山梨醇）的氧化能力，將青枯雷爾氏菌分為 4 個生化型 (生化型 I、 4。我國的何禮遠(yuǎn)（ 1983）認(rèn)為部分桑青枯菌不屬于上述 4 種生化型，應(yīng)屬于新的生化型 V45（見表 2）。生理小種和生化型之間沒有絕對的相關(guān)性，但是研究表明 3 號生理小種均屬于生化型 表 2 青枯雷爾氏菌生化型鑒定（根據(jù) 1964 和何禮遠(yuǎn)， 1983） . 1964 1983） 生化型 乳糖 麥芽糖 纖維二糖 甘露醇 甜醇 山梨醇 生化型 I - - - - - - 生化型 + + - - - 生化型 + + + + + 生化型 - - + + + 生化型 V + + + + - - 除了上述兩種青枯雷爾氏菌的種下分化的分類方法以外，還有血清型、溶原型、致病型和菌系等方法對青枯雷爾氏菌致病力分化進(jìn)行研究 43。其中青枯雷爾氏菌的致病型和菌系的分化是根 據(jù)青枯雷爾氏菌對鑒別品種的反應(yīng)性進(jìn)行劃分的。姚革等（ 1990）分析了四川省青枯雷爾氏菌的菌系及其分布后，發(fā)現(xiàn)在青枯雷爾氏菌生理小種 I 型中存在著互不侵染的現(xiàn)象 46。帥正彬等（ 1997）對成都地區(qū)番茄青枯雷爾氏菌的生理小種進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)，同屬一個生理小種的青枯雷爾氏菌接種番茄品種的結(jié)果表現(xiàn)出不同的致病力，研究結(jié)果表明在同一生理小種中的菌株，存在不同致病力分化 47。 另外，前人的研究表明，青枯雷爾氏菌存在著不同致病力的分化即強(qiáng)致病力菌株和無致病力菌株，前者侵入寄主植物，可導(dǎo)致寄主的發(fā)??；后者可以侵染寄 福建農(nóng)林大學(xué)碩士學(xué)位論文 4 主植 物，但不引起寄主發(fā)病 48。有研究表明，在特定條件下，強(qiáng)致病力菌株，會散失致病性，弱化形成無致病力菌株； et 2003)營養(yǎng)條件和極端氣候引起的病原菌基因突變等原因可使強(qiáng)致病力菌株產(chǎn)生弱化 49；但在自然條件下，青枯雷爾氏菌的強(qiáng)致病力菌株具有保持致病性相對穩(wěn)定的機(jī)制，抵抗外界條件，侵染寄主植物，引起植物病害 50。 4 青枯雷爾氏菌致病力分化的分子機(jī)理 青枯雷爾氏菌致病過程中的某些基因的突變，都會影響到青枯雷爾氏菌對寄主植物的侵染和致病力。其中包括調(diào)控和編碼 的基因，編碼胞外蛋白的基因及 分泌系統(tǒng)和 分泌系統(tǒng)的相關(guān)基因，以及形成網(wǎng)絡(luò)狀結(jié)構(gòu)的調(diào)節(jié)系統(tǒng)等。 合成相關(guān)基因 是青枯雷爾氏菌的主要致病因子。 生物合成途徑的大部分蛋白質(zhì)是由大小為 16 縱子調(diào)控和編碼的。該操縱子由 12 個以上的基因構(gòu)成，它的轉(zhuǎn)錄由一個啟動子控制，且需要有 10 個調(diào)節(jié)基因的產(chǎn)物和 3 種以上的信號相互作用才能被完全的激活， 縱子上的任何一個基因的突變都會阻礙 的產(chǎn)生 51,52。 道了青枯雷爾氏菌缺乏 的自 發(fā)突變株的發(fā)酵液離心后的上清液不能使番茄枝條萎蔫 35。 外蛋白及 分泌系統(tǒng)和 分泌系統(tǒng)的相關(guān)基因 青枯雷爾氏菌的胞外蛋白主要有 10 種，且都能較容易地從發(fā)酵液的上清液中檢測出來 53。其中包括果膠溶解酶類和纖維素水解酶類等。果膠溶解酶類由果膠甲基脂酶和三種多聚半乳糖醛酸酶構(gòu)成，三種多聚半乳糖醛酸由 因分別編碼，研究表明 缺失突變株僅少量的降低青枯雷爾氏菌致病力，而 因的突變株的可使青枯病發(fā)病時間比野生型菌株推遲 1 倍 47,54。青枯雷爾氏 菌能夠產(chǎn)生 2 種胞外葡聚糖酶， 夠水解可溶性的纖維素， 55,56,失突變的青枯雷爾氏菌使寄主植物發(fā)病的時間也有所延遲。 與其他許多病原菌一樣，青枯雷爾氏菌也存在 2 種分泌系統(tǒng)。由 因編碼的 分泌系統(tǒng)，能夠分泌包括細(xì)胞壁裂解在內(nèi)的大部分的重要胞外蛋白 57,58。由 誘導(dǎo)宿主細(xì)胞產(chǎn)生各種生理效應(yīng)，如超敏反應(yīng)等 59研究表明， 可能橫跨了細(xì)胞膜的內(nèi)膜和外膜，并將各種各樣 的致病因子及非致病性的蛋白運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞外，抑制植物的免疫反應(yīng) 63。 因簇包含了 20 多個基因 ,可能位于病原性基因島內(nèi)，其中任何一個基因的失活，似乎都會使青枯雷爾氏菌完全失去對寄主植物的致病力和在植物體內(nèi)增殖的能力，以及在抗性品種植物體中引起過敏反應(yīng)的能力64,65。 青枯雷爾氏菌 (病力分化的研究 5 絡(luò)狀調(diào)節(jié)系統(tǒng)相關(guān)基因 前人研究發(fā)現(xiàn)由于青枯雷爾氏菌適應(yīng)植物體外的生存環(huán)境，它需要一個精細(xì)的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)來控制 其他致病因子（植物細(xì)胞壁降解酶類）等的表達(dá) 51。因此青枯雷爾氏菌對 分子調(diào)控是嚴(yán)格且復(fù)雜的過程。根 據(jù) 66對分子調(diào)控機(jī)制的綜述，整個調(diào)控網(wǎng)絡(luò)至少包括了 3 個明顯的信號傳導(dǎo)機(jī)制 ,每個傳導(dǎo)機(jī)制都具有獨(dú)一無二的雙組分系統(tǒng)即 個系統(tǒng)包含一個與膜結(jié)合的傳感器激酶和一個特異感應(yīng)調(diào)控因子。傳感器激酶 過對其相應(yīng)的特異感應(yīng)調(diào)節(jié)因子 酸化從而對某一環(huán)境信號作出響應(yīng)，進(jìn)而激活或抑制致病基因的表達(dá)。 因最大量的轉(zhuǎn)錄需要激活整個網(wǎng)絡(luò)的所有組分。 圖 1 青枯雷爾氏菌控制 其他基因表達(dá)的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)（ 1998） of . 其中，青枯雷爾氏菌的表現(xiàn)型轉(zhuǎn)換系統(tǒng)基因（ 調(diào)節(jié)青枯雷爾氏菌致病力的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的核心