【畢業(yè)學位論文】（Word原稿）瓜枝孢弱毒菌株誘導黃瓜抗病性與致弱機理研究植物病理學碩士論文

密級： 論文編號： 中國農(nóng)業(yè)科學院 碩士學位論文 瓜枝孢弱毒菌株誘導黃瓜抗病性 與致弱 機理研究 on of on of on of on of I 摘 要 本論文對瓜枝孢（ 毒菌株的弱致病性、誘導抗病性及其遺傳穩(wěn)定性進行了較系統(tǒng)的研究，從瓜枝孢弱毒菌株形態(tài)特征變化、細胞壁降解酶活性變化、可溶性蛋白變化等方面初步闡明了瓜枝孢弱毒菌株的致弱機理。 1、瓜枝孢弱毒菌株可以誘導黃瓜產(chǎn)生對黑星病的抗病性，并且這些特性可以穩(wěn)定遺傳。 在一致的溫度、濕度環(huán)境條件下，誘導接種濃度、挑戰(zhàn)接種濃度以及誘導遲滯期對黃瓜誘導抗病性作用均有影響：在相同挑戰(zhàn)接種濃度和表達時期時，誘抗效果隨著弱毒菌株誘導濃度的提高而明顯增強；在相同誘導接種濃度和表達時期時，誘抗效果隨著挑戰(zhàn)接種 濃度的提高而迅速遞減；在相同誘導接種濃度和挑戰(zhàn)接種濃度時，抗病性表達有遲滯期，在誘導后 48h 抗病效果最高。 通過繼代培養(yǎng)證實，瓜枝孢弱毒菌株的弱致病性、誘導抗病性都能夠連續(xù) 9代穩(wěn)定遺傳。 2、瓜枝孢弱毒菌株較強毒菌株相比，孢子形態(tài)變小，致病酶活性降低、可溶性蛋白帶明顯減少。 分析 瓜枝孢弱毒菌株 毒力減弱機 理 ，證明 瓜枝孢弱毒菌株 無論是離體外還是寄主 活 體內，細胞壁降解酶（ 活性都要明顯低于其母本 強毒菌株。 并且在各個時期內，弱毒菌株產(chǎn)生的酶活性變化幅度小，而強毒菌株在各個時期產(chǎn)生的酶活性差別 大，動態(tài)變化顯著。 從可溶性蛋白電泳圖譜分析看出，強毒菌株間蛋白帶有明顯的相似性，弱毒菌株的可溶性蛋白帶明顯減少，并在 缺少一條蛋白帶。 關鍵詞： 瓜枝孢弱毒菌株；誘導抗病性；致弱機理 he is on of of of on of of of 1 of be by In or of in of of If of of be to h 2. to By of x) of in in in in in of f in in 錄 第一章 緒 論 . 1 1誘導抗病性現(xiàn)象 . 1 導抗病性 . 1 導抗病性影響因子 . 2 抗劑的獲得 . 2 2誘導抗病性機理 . 3 織病理學機理 . 3 理生化機制 . 4 子生物學機理 . 4 3本論文研究目的和意義 . 6 第二章 瓜枝孢弱毒菌株誘導黃瓜抗病性研究 . 7 1瓜枝孢弱毒菌株弱致病性研究 . 7 料與方法 . 7 果與分析 . 9 結與討論 . 10 . 11 料與方法 . 11 果與分析 . 13 結與討論 . 15 . 17 料與方法 . 17 果與分析 . 19 結與討論 . 22 . 23 料與方法 . 23 果與分析 . 25 結與討論 . 27 第三章 瓜枝孢弱毒菌株致弱機理研究 . 28 . 28 料與方法 . 28 果與分析 . 29 結與討論 . 31 . 32 料與方法 . 32 果與分析 . 34 結與討論 . 36 . 38 料與方法 . 38 果與分析 . 40 結與討論 . 41 第四章 全文結論 . 42 . 42 . 42 望 . 43 參考文獻 . 44 致 謝 . 47 作 者 簡 歷 . 48 V 英文縮略表 英文縮寫 英文全稱 中文名稱 烯酰胺 ,N,N 丙烯酰胺 ,N,N,N 叉 雙丙烯酰胺 瓜枝孢菌 羧甲基纖維素鈉 細胞壁降解酶 甲基纖維素酶 ,5,5磷酸鹽緩沖液 聚甲基半乳糖醛酸酶 膠甲基反式消除酶 二烷基 磺 酸鈉 十二烷基 磺 酸鈉 烯酰胺凝膠電泳 ,N,N,N N,N,N,N- 四 甲 基 二 乙胺 三羥甲基氨基甲烷 中國農(nóng)業(yè)科學院碩士學位論文 第一章 緒論 1 第一章 緒 論 目前，植物誘導抗病性已成為植物病理學、微生物學、植物生理學乃至生物化學領域最活躍的研究分支之一。植物病理學家發(fā)現(xiàn)植物具有可激活的抗病免疫機制，現(xiàn)在已經(jīng)得到了有關專家的肯定，這也揭開了植物誘導抗病性研究的新篇章。這種抗病免疫性可以通過在植株局部接種，使整個植株獲得系統(tǒng)性抗病性，從而保護植株在整個生長期內免受病害的侵襲。用弱毒菌系誘導抗性是改變寄主 、弱毒菌系都具有與植物發(fā)生前期互作的能力，但前者能把互作繼續(xù)發(fā)展為建立寄生關系并使其發(fā) 病，后者在給予寄主刺激后就停止互作向抗寄生關系方面發(fā)展，而這個刺激可以誘導植物的抗性。其基本思想是：把同種或近緣的弱毒菌系接種于寄主，使被保護的植物獲得對強毒菌系的抗性，又稱獲得性免疫。 早在 1901 年， 報道了可以用銹菌的弱毒小種感染小麥來抵抗銹菌的再次侵染。 1929） 首先在植物病毒病害上也發(fā)現(xiàn)了這種現(xiàn)象。 10 年后 1939）在真菌病害中也發(fā)現(xiàn)這種現(xiàn)象后，引起了植物病理學家的高度重視，誘導抗病性實現(xiàn)了植物不同部分的溝通，用生物的手段控制植物體內的防衛(wèi)反應，而且可誘導植 物產(chǎn)生普遍的抗性。隨著研究的進展， 20 世紀 60 年代初 現(xiàn)用病毒誘導煙草、蠶豆、豇豆后，產(chǎn)生了抵抗病菌侵入的能力。 20 世紀 70 年代，科學家在瓜類作物的誘導抗病性中取得了很大進展，用真菌、細菌或病毒局部侵染瓜類作物（即免疫化處理），可免遭多種真菌、細菌和病毒的危害。 8090 年代，人們又開始對誘導抗性的機制和應用進行了較為深入的研究。有些成果已經(jīng)在生產(chǎn)上開始推廣應用，在日本用弱毒菌株 到的產(chǎn)品 護番茄免受病毒病的危害，瑞士生產(chǎn)的 防治植物的卷葉病等，為植物病害的防治開辟了一條新途徑。近些年來，這個領域的研究取得了可喜的成績和進展，誘導免疫已成為控制植物病害的新策略。 1誘導抗病性現(xiàn)象 導抗病性 植物誘導抗病性的現(xiàn)象在二十世紀初就被發(fā)現(xiàn)，然而關于植物誘導抗病性的研究工作卻始于二十世紀 50 年代。最初人們把這種現(xiàn)象叫做獲得抗性（ 獲得性免疫（ 近幾年才正式使用誘導抗（病）性（ 概念。 中國農(nóng)業(yè)科學院碩士學位論文 第一章 緒論 2 誘導抗性是指利用物理的、化 學的以及生物的方法處理植物以改變病害反應，使原來感病的植物產(chǎn)生局部的或系統(tǒng)的抗性。它分為局部誘導抗性和系統(tǒng)誘導抗性。局部抗性（ 只在誘導部位周圍產(chǎn)生的抗性，其典型例子如過敏性壞死反應（ 是通過侵染點周圍細胞的壞死而阻止病菌擴展的現(xiàn)象。系統(tǒng)抗性（ 指誘導植物局部后植物全身都表現(xiàn)出抗病性。植物系統(tǒng)獲得抗病性是植物抵抗病原物侵染的一種主要特性，指植物經(jīng)病原菌或其弱毒株系誘導或接種 后、某些化學物質處理，幾天內被接種的植物產(chǎn)生新的、廣譜的系統(tǒng)抗性，從而對病原物再次侵染以及其他病菌的侵染均具有很強的抑制性，該抗病性可擴展到整個植株。 導抗病性影響因子 導濃度（壓力或強度） 誘導濃度和誘導免疫作用的效果之間有著直接的相關性，一般情況隨著誘導濃度的逐漸增加，免疫效果也逐漸提高，但達到一定濃度后，誘導效應不再增強，趨于穩(wěn)定。如在番茄枯萎病誘導抗性研究中，番茄尖孢鐮刀菌（ 為誘導菌，當它與挑戰(zhàn)菌同時接種時，它的接種量需要占絕對優(yōu)勢，才能產(chǎn)生理想的誘導效果。 導遲滯期 誘導抗性的產(chǎn)生需要在誘導處理和挑戰(zhàn)接種之間有一個時間間隔 遲滯期，它是植物對誘導刺激發(fā)生“免疫應答”到防衛(wèi)基因表達和產(chǎn)物積累所需要的時間，在此遲滯期前進行挑戰(zhàn)接種，植株將不表現(xiàn)或只表現(xiàn)較弱的誘導抗性。不同的誘導因子 病原物之間有不同的誘導遲滯期，即使同一系統(tǒng)中，表現(xiàn)局部誘導抗性或系統(tǒng)誘導抗性所需的遲滯期也不一定相同。董漢松（ 1993）用煙草赤星病菌弱毒株 導煙草抗赤星病研究表明誘導抗性在誘導處理 6 天后開始表現(xiàn)。蔡新忠等（ 1999）用番茄葉霉菌小種（番茄 系的非 致病小種）誘導處理研究表明誘導局部抗性其遲滯期為 3d，而系統(tǒng)抗性大于 3d。不同誘導因子誘導不同植物所需的誘導時間差別很大。如黃瓜幼苗經(jīng)短暫熱激后 3 小時即開始表現(xiàn)出對 抗性， 12h 后誘導的抗性水平達到最高限度。而用 誘導接種，則經(jīng)過 48始表現(xiàn)誘導抗性作用。 抗劑的獲得 誘抗劑（ 指能誘導植物產(chǎn)生抗病反應的物質和因素。大量研究證明，能起到誘導抗病作用的誘導劑種類很多，包括生 物性的和非生物性的，生物誘抗劑主要有病原物的非親和小種（株系）、病原物的弱毒株系、病原物的近似種、中國農(nóng)業(yè)科學院碩士學位論文 第一章 緒論 3 病原物、病原物的處理物、生物性激發(fā)子、異種病原菌、無毒菌株、植物提取物、根際細菌（ 等。 非 生 物 誘 抗 劑 主 要 是 與 誘 導 抗 病 有 關 的 信 號 分 子 水 楊 酸（ 茉莉酸（ 乙烯等以及它們的結構類似物和衍生物（徐建明， 2001；于讓才， 1996）， 另 外 還 有 寡 糖 類 誘 抗 劑 （ , 1984）、 硅 （ R,1995）等。 獲得誘抗劑的方法主要是從自然界篩選和人工改造，人工改造包括誘變， 熱處理，遺傳工程等方法。但是這些相關的研究大多還只局限于植物本身的反應，而對于誘導劑特別是生物源誘導劑如何作用于植物而使其對病原菌產(chǎn)生免疫力的機制還沒有一個明確的認識。 石 破 知 加 子 等 （ 1981） 用 從 葫 蘆 科 根 系 上 分 離 出 對 黃 瓜 幼 苗 不 致 病 的 理黃瓜下胚軸切口端，可誘導黃瓜真葉對炭疽病的抗性。 1965）將熱殺死的煙草野火病菌引進煙葉葉片的間隔， 誘導了對隨后接種的野火病菌的抗性。高壓滅菌殺死的 孢子預處理咖啡葉，能誘導對病菌侵染的抗性（ ， 1997）。 1985 年日本專家后藤等從患病番茄上分離了具有減輕病癥效果的 星 其導入 病株上成功地獲得了弱毒株系。吳營昌等利用從黃瓜枯萎病病株上分離到的尖孢鐮刀茵的弱毒菌接種西瓜，用于誘導西瓜對枯萎病的抗性 （ 吳營昌， 1991） 。國際水稻所植病系遺傳室用紫外光誘變稻瘟病菌而得到的淺黃色素突變體是非致病菌株，對水稻抗稻瘟病有誘導抗病現(xiàn)象（ 沈瑛 ,1992）。王彰明等從小麥紋枯病病株上分離的小麥紋枯病菌 ( 帶菌小木段葉鞘嵌入法接種小麥，獲得較好的誘導抗病效果（王彰明， 2003）。 2誘導抗病性機理 使用非（弱）毒菌作為誘抗劑來處理植株可產(chǎn)生對病害的抗性是無可置疑的，但這種誘導抗性的機制還一直處在研究當中。目前，對誘導抗性機理的認識不斷深入，總體上認為，免疫的機制是復雜的，并不是單一的。 織病理學機理 誘導抗性包含從植物細胞壁到細胞內部的一系列結構抗性反應，使寄主形成阻止或抑制病菌侵染 或擴散的結構 ,包括胼胝質，凝膠，侵填體以及與細胞壁修飾有關的結構特征。細胞壁修飾是指植物細胞受脅迫后細胞壁發(fā)生變化，包括產(chǎn)生乳突、細胞木質化、積累富含羥脯氨酸的糖蛋白（ 外源凝集素等。細胞木質化是被普遍接受的一種機制 , 研究證明，黃瓜植株中誘導的系統(tǒng)抗性與受侵染后寄主植物木質化能力迅速增強有關（ A,1987）。細胞壁蛋白是普中國農(nóng)業(yè)科學院碩士學位論文 第一章 緒論 4 遍存在植物細胞出生壁中的一類結構蛋白，迄今已發(fā)現(xiàn) 4 種：富含羥脯氨酸蛋白（ 又稱伸展蛋白；富含甘氨酸蛋白（ 富含蘇氨酸和羥脯氨酸的糖 蛋白（ ；富含組氨酸和羥脯氨酸的糖蛋白（ 目前， 多的一類細胞蛋白。 充在纖維素構成的細胞壁骨架中，不能被細菌分泌的纖維素酶、半纖維素酶和蛋白酶分解，起到了抵抗病菌侵染的屏障作用。 具有凝集作用，阻止病原菌侵入或在細胞間擴散。 理生化機制 植物在受誘導后所發(fā)生的生理生化反應有：可溶性碳水化合物和酚類物質含量增加，植物保衛(wèi)素（ 稱植保素）產(chǎn)生和積累以及多種酶活性的變化、病程相關蛋白（ 產(chǎn)生等。 時葉片中酚類物質沉積作用增強（ ，1994）。施用誘導菌可誘導植物在侵染點產(chǎn)生植保素如萜烯類和其它抑菌物質。許多研究證明，過氧化物酶（ 多酚氧化酶（ 苯丙氨酸解氨酶（ 脂氧合酶（ 超氧化物歧化酶（ 查爾酮合成酶 (抗病酶在誘導后其活性和水平顯著增加，同工酶譜帶增多。在眾多的 白中，以水解酶類如 葡聚糖酶和幾丁質酶研究的最為詳盡。 植保素是 植物受病原微生物或非病原微生物以及其它因素刺激，而在受感染或受刺激的部位及其周圍產(chǎn)生和積累的具有抗菌活性的低分子量化合物，是植物受病原菌侵染后防衛(wèi)反應在生化上的重要表現(xiàn)。由于植保素具有侵染可誘導性和體外抗菌活性 , 它的合成和累積被認為是植物的一種重要抗病機制。真菌、病毒、細菌以及它們的代謝物、細胞壁多糖、糖蛋白、脂肪酸、寡聚糖以及一些非生物誘導劑如紫外線、重金屬、硅（ R， 1995）、代謝抑制劑等均能誘導寄主產(chǎn)生植保素（ ,2003）。酚類物質是植保素、木質素合成的前體，而其 本身和它的氧化產(chǎn)物醌都對病原菌都有很強的毒性，所以植物體內酚類物質的增加，不但自身的抗菌作用增強，而且也使病源物侵染處木質化程度增強，因此使植物抗病能力增強。 子生物學機理 隨著現(xiàn)代分子生物學技術和分子植物病理學的不斷發(fā)展，植物誘導抗性機理也深入到分子水平。 物防衛(wèi)反應 植株受到微生物誘導后，誘導抗性反應中與末端產(chǎn)物積累有關的編碼基因并不是抗病基因，其中大多數(shù)屬于致病相關蛋白質（ 編碼基因，而其中大多數(shù)的蛋白質能夠抑制病原微 生物的生長與繁殖，如幾丁中國農(nóng)業(yè)科學院碩士學位論文 第一章 緒論 5 質酶、 1,3 葡聚糖酶等。同時在被侵染的部位還會有不同類型的植物防衛(wèi)相關蛋白質（ 合成，它們同樣具有重要的抗病作用。楊依軍等（ 1997）利用層析、離子交換以及特異免疫化學分析的方法對誘導性蛋白酶進行分離純化及鑒定分析，結果從非親和性稻瘟菌侵染的稻葉中純化了脂氧合酶（ 兩種同工酶 鑒定了其血清學關系。 病基因與無毒基因 早在 1941 年， 人在有關亞麻（ ） 與亞麻柵銹菌（ 互關系的研究中就已發(fā)現(xiàn)，亞麻的 R 基因是顯性的，而控制亞麻柵銹菌產(chǎn)生抗 R 基因突變小種的基因是隱性的。據(jù)此他提出了植物與病原體之間相互關系的“基因對基因”假說（“ 假說認為，對病原體表現(xiàn)抗性（或不相容性）的植株必定存在著一種 R 基因，而在病原體中也必定存在著與之對應的 因；這兩種基因中的任何一種的缺失或功能的喪失，寄主植株與病原體之間就不能發(fā)生相 互作用，抗病反應就不會被激活，結果導致寄主植株染病。以后的大量研究證明，微生物與植物的相互作用，都遵循這“基因對基因”的關系。 植物的抗病基因與病原微生物的無毒基因，在植物與病原微生物的相互適應過程中失協(xié)同進化的。病原微生物可以通過 缺失或突變來避開植物“基因對基因”的抗病防衛(wèi)反應系統(tǒng)，是自身得以生存，另一方面在進化的過程中，植物又必須產(chǎn)生處新的抗病基因，用以抵抗病原體的侵染。 近些年來，運用分子生物學技術，通過科學工作者的不懈努力，已經(jīng)從有關的植物中至少分離到了至少 20 種以上的不同的抗病基因，從細菌 中已經(jīng)至少分離到 40 個以上的無毒基因，從病毒中也分離到了數(shù)種無毒基因（包括煙草花葉病毒的外殼蛋白基因、復制酶基因和運動蛋白基因等），從真菌中分離到的無毒基因較少，現(xiàn)在僅分離得到番茄的葉霉病菌暗黃枝孢（ 的 番茄葉霉病原菌的無毒基因 乃虎， 1998）。 導抗病性信號傳導 誘抗菌誘發(fā)基因表達時一般能都涉及信號傳導問題。目前認為，傳導信號的分子可能是水楊酸（ 、乙烯、茉莉酮酸和茉莉酮酸甲酯（ 1992；1993） 。水楊酸作為系統(tǒng)獲得抗性必不可少的信號分子已得到證明。但水楊酸并非通常理解的可以通過輸導組織送到遠處組織的信號分子；在遠處組織建立系統(tǒng)抗性所需的水楊酸是由另外的可移動的因子或信號轉換成的。近年的研究表明，在細胞內的信號傳遞途徑中，誘導菌通過與特異受體結合，將信號跨膜傳遞到細胞質內，經(jīng)過一系列信號傳導，包括離子通道打開、活性氧爆發(fā)蛋白激酶的活化等，使細胞核內防衛(wèi)基因表達，產(chǎn)生防御物質以抵抗病原菌的侵染。信號傳遞不斷激起人們的重視，是誘導抗性研究的熱點領域。 中國農(nóng)業(yè)科學院碩士學位論文 第一章 緒論 6 3本論文研究目的和意義 本研究以黃瓜黃化 苗、瓜枝孢弱毒菌株及其對應強毒菌株為試驗材料，對瓜枝孢弱毒菌株誘導寄主抗病性、誘導寄主系統(tǒng)抗病性及其相關遺傳穩(wěn)定性進行了系統(tǒng)研究，并從菌體形態(tài)特征、細胞壁降解酶、可溶性蛋白等形態(tài)特征和生理生化方面顯著變化來對瓜枝孢弱毒菌株致弱機理進行了研究，最后，對瓜枝孢弱毒菌株的分子生物學機理進行了預測和展望。 植物誘導性抗病是植物適應外界環(huán)境的一種反應。通過本文的研究，以期能夠闡明弱毒菌株誘導植物抗病性的產(chǎn)生條件、表達規(guī)律、機制以及與植物正常生命活動的關系；并為克隆相關弱毒菌無病基因、寄主植物抗病基因和開發(fā)植物真菌疫苗 ，提供強有力的理論支持和科學依據(jù)，從而完善病原微生物和寄主植物之間的互作機制的研究，進一步豐富我國在誘導抗病機制領域的科研成果，推動農(nóng)作物病害綜合防治體系的建立。 中國農(nóng)業(yè)科學院碩士學位論文 第三章 瓜 枝 孢 弱 毒 菌 株 致 弱 機 理 研 究 7 第二章 瓜枝孢弱毒菌株誘導黃瓜抗病性研究 早在 1901 年， 報道了可以用銹菌的弱毒小種感染小麥來抵抗銹菌的再次侵染。 1939 年 在真菌病害中也發(fā)現(xiàn)了這種現(xiàn)象，這引起了植物病理學家的高度重視。 誘導抗病性是 通過在植株局部接種，使整個植株獲得系統(tǒng)性抗病性，從而保護植株在整個生長期內免受病害的侵襲。用弱毒菌系誘導植物抗病性 實現(xiàn)了植物不同部分的溝通， 改變了寄主 、弱毒菌系都具有與植物發(fā)生前期互作的能力，但前者能把互作繼續(xù)發(fā)展為建立寄生關系并使其發(fā)病，后者在給予寄主刺激后就停止互作向抗寄生關系方面發(fā)展，而這個刺激可以誘導植物的抗性。其基本思想是：把同種或近緣的弱毒菌系接種于寄主，使被保護的植物獲得對強毒菌系的抗性，又稱獲得性免疫。 本章以黃瓜黃化苗為供試菌株，選取課題組自主篩選的瓜枝孢弱毒菌株及其對應的強毒菌株，通過黃瓜黃化苗子葉噴霧接種法系統(tǒng)研究了瓜枝孢弱毒菌株弱致病性、誘導黃瓜抗病性及其遺傳穩(wěn)定性；通過 黃瓜黃化苗根部涂抹法和子葉涂抹法系統(tǒng)研究了誘導黃瓜系統(tǒng)抗病性及其遺傳穩(wěn)定性等內容，同時并詳細研究了相關影響因子對瓜枝孢弱毒菌株誘導黃瓜抗病性、誘導黃瓜系統(tǒng)抗病性的影響。這為下一章研究瓜枝孢弱毒菌致弱機理提供必要的理論依據(jù)和試驗基礎。 1 瓜枝孢弱毒菌株弱致病性研究 料與方法 料 試植株 “山東密刺”黃瓜黃化苗：參照李寶聚（ 1997）方法，將黃瓜種子經(jīng) 升汞表面消毒 5，在 20恒溫箱中催芽 24h，然后排放于高溫滅菌、底部鋪有雙層紗布的保濕塑料盒中， 20恒溫箱中黑暗培養(yǎng) 2d 待黃化苗種殼脫落后備用。試驗用黃化苗一直在 20恒溫箱中黑暗培養(yǎng)，以后略同。 試菌株 瓜枝孢弱毒菌株： 434322323323 瓜枝孢強毒菌株： 432323。 要儀器 中國農(nóng)業(yè)科學院碩士學位論文 第三章 瓜 枝 孢 弱 毒 菌 株 致 弱 機 理 研 究 8 超凈工作 臺 （ 北京市西城區(qū)半導體設備一廠 ）、 恒溫箱培養(yǎng)箱 （ 哈爾濱市東聯(lián)電子技術開發(fā)有限公司 ， ）、 滅菌鍋 （ O. ）、干燥 箱 （ 上海市實驗儀器總廠 ， 101 ）、 微波爐 （ ）、 光學顯微鏡 （ 相機（ 。 要試劑 汞溶液 法 株活化、培養(yǎng) 將瓜枝孢弱毒菌原始菌株（ 434322323323別在 板培養(yǎng)基上活化后培養(yǎng) 4d 備用。 霧接種 用無離子水將弱毒菌株 （ 434322323323別配制成濃度為 2 106 個 /孢子懸液，以噴霧法接種在黃瓜黃化苗子葉上， 23恒溫箱中繼續(xù)黑暗培養(yǎng)。每處理皆設 3 次重復，每個保濕盒（ 42 株黃瓜黃化苗）為一個重復，每重復噴霧法接種液體定量均為 15 立對照 以接種各自對應的強毒菌株 （ 432323）濃度為 2 106 個 /子懸液的黃瓜黃化苗 子葉 為對照。 情調查 噴霧法接種后第 3d、 5d 分別調查發(fā)病情況，并記錄。 害分級與數(shù)據(jù)處理 病害分級： 借鑒李寶聚（ 1997）對黃瓜黑星病菌侵染黃化子葉病情分級標準。 0 級：無癥狀； 1 級：子葉出現(xiàn)可見的紅褐色小點； 2 級：子葉出現(xiàn)少量的紅褐色小點； 3 級：子葉紅褐色病斑占葉面積 1/3 以內； 4 級：子葉紅褐色病斑占葉面積 1/3； 5 級：子葉紅褐色病斑占葉面積 2/3 以上。 數(shù)據(jù)處理： 病情指數(shù) （各級病葉數(shù) 相應級數(shù)）