【畢業(yè)學(xué)位論文】（Word原稿）番茄與白粉菌互作的細(xì)胞學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析作物遺傳育種博士論文

密級： 論文編號： 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 學(xué)位論文 番茄與白粉菌互作的細(xì)胞學(xué) 和轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析 of he of I 摘 要 番茄白粉病 (是一個世界范圍內(nèi)傳播的真菌病害，對番茄 (的生產(chǎn)特別是溫室生產(chǎn)造成了很大的危害。 本論文在細(xì)胞和轉(zhuǎn)錄水平上分析了 顯性，隱性基因和主效 制的抗性機理。 研究采用了 方法，以非接種為對照分析了病菌誘導(dǎo)的感病，顯性單基因和多基因抗性遺傳材料的基因表達差異（第二章）。結(jié)果表明在番茄和白粉病菌親和互作中番茄的上調(diào)表達基因數(shù)是非親和互作中的 2 倍。抗性基因和 導(dǎo)的對白粉病菌的抗性反應(yīng)和感病反應(yīng)在很大程度上誘導(dǎo)了相同的基因，大約 40%的這些基因在抗性基因和 /或 導(dǎo)的抗性反應(yīng)中表達較早，而其它的基因表達表現(xiàn)相似的時序性。通過序列分析發(fā)現(xiàn)，抗性反應(yīng)特異性或者抗性反應(yīng)中表達較早的差異表達的 段 （ 要來自植物防御反應(yīng)和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因，而具有相似時序性的 而我們認(rèn)為抗病和感病反應(yīng)可能誘導(dǎo)了相似的基因，而這些基因表達的時序性差異對番茄和白粉病菌互作的最終結(jié)果至關(guān)重要。 為了更好地研究不同基因或 制的抗性反應(yīng)機理，在細(xì)胞和轉(zhuǎn)錄水平上分析了以感病材料（ 遺傳背景的含有顯性抗性基因 隱性抗性基因 和不同 合的近等基因系 (白粉病菌的抗性反應(yīng)（第三章和第五章）。顯微鏡分析結(jié)果顯示這些基因和 制的抗性反應(yīng)可以表現(xiàn)在白粉病菌和番茄互作的不同階段。 導(dǎo)的抗性反應(yīng)中起主導(dǎo)作用并且在 3 個 間表現(xiàn)加性，而穿透性乳突，小液泡和吸器基質(zhì)結(jié)構(gòu)異?；埠涂剐苑磻?yīng)相關(guān)但不具有加性效應(yīng)。含有不同的 現(xiàn)不同類型的壞死細(xì)胞。 聚合可以導(dǎo)致和 導(dǎo)的單基因控制抗 性相當(dāng)?shù)母呖顾剑疫@種效應(yīng)產(chǎn)生主要是因為壞死細(xì)胞比率的升高（第四章）。此外，含有相同的 妹 如，接種白粉病菌的含有 3 個 兩個姊妹 葉片上表現(xiàn)不同大小的壞死斑。小的壞死斑意味著快速的反應(yīng)和植物可以用比較小的代價完成抗病過程。因而，含有多個 且表現(xiàn)較小壞死斑的番茄植株應(yīng)該可以作為一個比較好的抗病親本應(yīng)用到抗病育種中。 含有隱性抗性基因 性 抗性基因 速 慢性 關(guān)。 析表明它們的基因表達譜不同。大部分的 導(dǎo)的抗性反應(yīng)中表達，在 導(dǎo)的抗性反應(yīng)中沒有或者比較晚表達。 析顯示 導(dǎo)的抗性反應(yīng)和已知的水楊酸（ , 茉莉酸（ 以及乙烯防御反應(yīng)途徑無關(guān)。因而，我們推測 白可能是一個番茄白粉病菌親和互作所必須的感病因子，或者 導(dǎo)的抗性反應(yīng)采用了另外一種新的防御反應(yīng)途徑。乙烯防御反應(yīng)途徑參與 導(dǎo)的抗性反應(yīng)，但是水楊酸和茉莉酸防御反應(yīng)途徑和 導(dǎo)的抗性反應(yīng)不相關(guān)。脂氧化酶（ 導(dǎo)的抗性反應(yīng)起重要作用，同時這種 脂氧化酶被證實不是 13 構(gòu)酶。另外， 導(dǎo)的抗性反應(yīng)和水楊酸和乙烯防御反應(yīng)途徑可能相關(guān)，但 需要進一步實驗驗證（第三章）。 根據(jù)以上的實驗結(jié)果，使用 78 個經(jīng)過挑選的引物組合對含有不同 合和 M 進行了進一步的 析。在顯示的大約 4000 個條帶中 204 個屬于差異表達。其中 72 個 與基因型有關(guān)和處理不相關(guān)， 132 個 處理相關(guān) 。在親和和非親和互作中表現(xiàn)相同上調(diào)時序性的 認(rèn)為來自于和基礎(chǔ)防御反應(yīng)或者親和反應(yīng)相關(guān)基因，這些基因的表達可能是被成功侵入的細(xì)胞反應(yīng)的體現(xiàn)。那些在非親和互作中表現(xiàn)較早表達時序性的基因被發(fā)現(xiàn)在感病植株中被系統(tǒng)性誘導(dǎo)。水楊酸和過氧化氫可能是這些單基因和多基因控制的番茄抗病材料的抗性反應(yīng)中的重要信號分子。一小部分的特異差異表達的和調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的基因可能負(fù)責(zé)著防御反應(yīng)途徑的精細(xì)調(diào)節(jié)。通過電子（ 圖確定了一個位于 區(qū)域的 者 候選基因。 通過綜合分析以上的結(jié)果并且和相關(guān)文獻資料比較，我們得到以下結(jié)論：番茄白粉病抗性可以表現(xiàn)在番茄和白粉病菌互作的不同階段。病菌誘導(dǎo)的番茄轉(zhuǎn)錄組變化在親和互作和慢性 起的非親和互作間具有保守性和數(shù)量性差異的特點。此外，快速 乳突形成（ 導(dǎo)的非親和互作中番茄轉(zhuǎn)錄組變化表現(xiàn)出質(zhì)的差異。 關(guān)鍵詞 番茄 白粉病 細(xì)胞學(xué)分析 轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析 單基因抗性 多基因抗性 is a of So or on We by of ). in O. as in as in in of TL in 0% of in to a of in of in to or in By of in ). we of of . in of to of ). A of or of ) of ). l . at of of R is s) of in to s). s) a in a of a of a of ). as we on 3Qa 3). A IV is a be in of R R to O. by of A of in in or up in of a of is A, JA we is a of . or is A A. An of 3 a in R) to be A ). We of . of a ,000 8 In 204 . 2 a on in or of of of in to a as 2O2 be in of of in a to a to by to We of of be a V of to -5 in to We . of of R (of . by R (by in 錄 第一章 緒論 1 第二章 番茄對白粉病菌的防御機制：感病反應(yīng)、單基因和多基因抗性反應(yīng)基因表達的差異主要表現(xiàn)為時序性的不同 11 第三章 番茄乳突形成、快速和慢性過敏反應(yīng)相關(guān)白粉病誘導(dǎo)抗性反應(yīng)的轉(zhuǎn)錄表達譜分析 24 第四章 番茄對白粉病的防御反應(yīng)：數(shù)量性抗性反應(yīng)主要和過敏反應(yīng)相關(guān) 39 第五章 白粉病誘導(dǎo)下的攜帶不同抗性 合番茄系的轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析 52 第六章 總 結(jié)論和 討 論 67 參考文獻 73 致謝 75 作者簡歷 77 文縮略表 英文縮寫 英文全稱 中文名稱 轉(zhuǎn)錄子來源片段 異表達轉(zhuǎn)錄子來源片段 增片段長度多態(tài)性 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 博士 學(xué)位論文 第一章 緒論 1 第一章 緒論 據(jù)推測，作物的產(chǎn)量需要增加兩倍多才能夠滿足人類的食物和家畜飼料的需求。培育高產(chǎn)作物之外的另外一個最重要的保證食物和飼料供應(yīng)的可持續(xù)方法就是使植物免受病蟲害的危害（ et 2004）。由于植物病害造成的作物生產(chǎn)上的世界性的損失已經(jīng)達到每年 12多（ 1993； et 2004）。因此，植物保護是全球食物安全的重要保證之一。植物和病原體的互作機理是植物保護研究的 一個熱點，可以為抗性育種提供理論依據(jù)。下面以植物和專性真菌的互作為例簡單介紹植病互作、本論文的植病體系、研究方法以及論文的鳥瞰結(jié)構(gòu)。 一、 植物與活體寄生真菌的互作 真菌病害的種類繁多，大約占在所有的植物病害 2/3（ 1998）。寄生真菌可以劃分為活體寄生和死物寄生真菌，前者必須在活體寄主上才能夠完成生命周期；而后者則是先殺死寄主從死組織中吸取營養(yǎng)。為了能夠從寄主上吸收營養(yǎng)，大部分活體寄生真菌都形成一個專門結(jié)構(gòu)，就是所謂的吸器（ 2003）。植物與活體寄生真菌的互作可以是親和（植物方面講是感病的）和非親和的（從植物方面將是抗病的）。非親和互作可以發(fā)生在病菌感染植物的不同階段并且往往和過敏反應(yīng)（ 切相關(guān)。相比之下，在親和互作中 活體寄生真菌能夠在活的植物細(xì)胞中形成吸器吸收營養(yǎng)，并且改變了寄主細(xì)胞的代謝使其有利于自己生長，不導(dǎo)致過敏反應(yīng)（ 2002）。很長一段時間，對于植物與活體寄生真菌互作的研究集中在植物對病原體的抗性上。相反，對感病性的研究非常少。 針 對于抗性來說，非寄主抗性的研究雖然沒有突破性的進展，仍被認(rèn)為是一種理想的持久抗性類型（ 2004）。寄主抗性是植物保護研究中的一個熱點，包括單基因（顯隱性）和多基因抗性。以下對感病性和抗病性、單基因和多基因抗性、以及顯性和隱性抗性進行了比較和描述。 感病性和抗病性 活體寄生真菌對植物的侵染可以劃分為以下幾個時期：孢子附著、孢子萌發(fā)、形成芽管、尋找氣孔、氣孔識別、形成附著胞、穿透氣孔 /穿透細(xì)胞壁、形成吸器、發(fā)病和形成分生孢子（ 2002）。 然而，以上所描述的侵染時期涉及到許多植物和活體寄生真菌的互作。針對某一種真菌，也許只是包括其中的某幾個階段。例如，白粉病菌的侵染并不包括氣孔識別?？瓷先?，植物可以在任何侵染階段抵制病原真菌的侵染，然而，至今育種和科研中涉及的抗性主要包括以下幾個侵染階段：穿透細(xì)胞壁和吸器形成后的浸染階段。在吸器形成前的階段，植物以形成乳突來抑制真菌的浸染；在吸器形成后階段，真菌往往誘導(dǎo)植物形成過敏反應(yīng)（ 大麥 因介導(dǎo)白粉病抗性反應(yīng)和番茄 因介導(dǎo)的白粉病抗性反應(yīng) 是的 乳突形成相關(guān)抗性的典型例子（ et 1999； et 2005）。然而，更經(jīng)常性的抗性反應(yīng)是和過敏反應(yīng) (關(guān)的（ 2002）。大部分這種 關(guān)抗性符合 基因?qū)?植病互作模型（ 1971）。玉米中的介導(dǎo)真菌 性的 科學(xué)家利用轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽方法克隆的第一個 R 基因（ 1992）。 碼 后來克隆的 基 因具有不同機理。 et 1993) 成功地從番茄中分離出了 因，該 R 基因編碼一個絲氨酸 /蘇氨酸激酶 ，能夠介導(dǎo)番茄對細(xì)菌（ pv 抗性。 因 是第一例利用圖位克隆方法分離的 R 基因。 第一個被克隆的介導(dǎo)真菌病害（ 性的 R 基因（ et 1994）； C. 于細(xì)胞間的半活體寄生真菌，不形成吸器。已經(jīng)分離的細(xì)胞內(nèi)形成吸器的活體寄生真菌的 2003). 迄今，已經(jīng)有超過 50 個符合 基因?qū)?互作模式的 R 基因得到分離（ et 2005），大部分 R 基因具有亮氨酸豐富重復(fù)、核苷酸結(jié)合位點和激酶等同源域。這些過去 10 多年克隆的 R 基因極大地豐富了我們對植物抗病性的了解 然而，我們也應(yīng)該注意 植物的感病性 。研究者通過掃描誘導(dǎo)突變體庫和自然群體，發(fā)現(xiàn)了一系列隱性遺傳的抗活體寄生真菌的 R 基 因，包括大麥 et 1997），番茄 et 2000）和 擬南芥的 因（ 2000; et 2002; 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 博士 學(xué)位論文 第一章 緒論 2 et 2003）。因為 因介導(dǎo)的抗性反應(yīng)和那些防御反應(yīng)標(biāo)記基因的表達沒有關(guān)聯(lián)（ 2002； et 2002；本論文），所以我們可以推測和這些隱性基因所對應(yīng)的顯性基因是感病 反應(yīng)必需寄主基因；另一個可能就是這些基因參與了一種未知的防御反應(yīng)途徑。對克隆基因 研究支持了寄主蛋白 別位于植物細(xì)胞壁、吸器基質(zhì)和吸器外膜（圖 1）并在該位點起作用。與非親和互作引起的過敏性細(xì)胞死亡相反；在親和互作中，維生素 B 在吸器中的合成抑制了細(xì)胞死亡，寄主的 制子也許是其作用靶子（ 2003）。這種細(xì)胞死亡的抑制在大麥和大麥白粉病菌（ f. 的親和互作中表現(xiàn)為所謂的 綠島效應(yīng) （ （ 2000）。位于病原菌的質(zhì)膜上的 H+許也參與了親和互作的建立。 盡管如此，我們對植物與活體寄生真菌互作的理解還是非常有限的。然而，很明顯鑒定和分離更多的感病因子不僅可以使我們更好地理解親和互作的機理，也可以為育種提供新的抗性來源。大麥的 因就是一個很好的例子，該基因在抗病育種中得到了很多年的利用。正如 因 ，這種類因可能介導(dǎo)對所有生理小種的廣譜抗性。 p a p il l u ri a l n e ck b a n dE x h a u s ri a l m a xP la n t c e w a la n t p l a sm am e m b ra n P a s eV m i n B sy O?P M P M E x h a u st o ri a lm e m b ra n eP a t h o g e n ce w a a t h o g e n p l a sm am e m b ra n e d e a t h s u p p r e o nb a x i b it o r?De fe n s e s u p p r e o b in d i n g p e i n ?圖 1 在植物與活體寄生真菌互作中的在植物細(xì)胞中的吸器模式圖。這個模式圖代表不同的植物與活體寄生真菌互作，不是針對某一種互作。 （ 改編自 003 et 2002） A in a of a a (003 et 2002) 非寄主抗性和寄主抗性 盡管植物病害是影響作物生產(chǎn)中的嚴(yán)重問題之一，事實上許多植物對許多植物病原體是具有抗性的。在自然界中，病害其實只是例外而不是共性的現(xiàn)象。即使病害發(fā)生了，其也 往往是發(fā)生在一定的寄主范圍內(nèi)和特定的組織中，例如，番茄白粉病主要侵染葉和幼莖。而非 非寄主植物 和 非寄主病原體 指的就是以上這種情況（ 2003）。 如果一種植物的所有品系（ 對某種特定的病原體具有抗性或 非感性 這個植物物種可以被稱為這種特定病原體的 非寄主植物 ；而這種病原體被稱為這種植物的 非寄主病原體 。如果一個植物物種中的一些品種對某種特定的病原體具有感病性，這種植物被認(rèn)為是病原體的寄主。因此，非寄主抗性是指物種間的抗性；而寄主抗性是在 物種內(nèi)表現(xiàn)、的抗性。根據(jù)抗性表現(xiàn)的范圍，寄主抗性可以劃分為小種轉(zhuǎn)化性抗性、非小種轉(zhuǎn)化性抗性及基礎(chǔ)防御（表 1）。 表 1 基礎(chǔ)抗病有關(guān)概念 (引自 et 2003) et 2003) 術(shù)語 釋 病表現(xiàn) 國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 博士 學(xué)位論文 第一章 緒論 3 非寄主抗性 病性發(fā)生在種間 有效抵 抗所有已知病原 無癥狀 非小種?；钥剐?病性發(fā)生在種內(nèi) 有效抵抗所有已知病原 R 蛋白介導(dǎo) 僅有某些植物基因型表現(xiàn)完全抗性 小種?；钥剐?病性在種內(nèi)有所變化 僅在植物具有 R 蛋白，同時病原菌?；孕》N產(chǎn)生相應(yīng)激發(fā)子的情況下有效抵抗 每一植物基因型表現(xiàn)出對不同病原菌分離小種不同的抗病性及感病性 基礎(chǔ)防御 主植物感病基因型中被激活 感病性在不同的感病基因型中有所變化 和寄主抗性相比非寄主抗性更普遍和持久，根據(jù)抗性特征可以將非寄主抗性劃分為兩種類型。第一種類型沒有明顯的表現(xiàn)特征；第二種類型非寄主抗性表現(xiàn)為快速過敏反應(yīng)（ 2004）。 2003) 羅列了植物具有的五種非寄主病原體可能遇到的障礙。按病原體侵染的過程，前 4 個障礙包括植物影響病原體分化的信號分子、即有障礙（ 古老 可誘導(dǎo)的障礙和營養(yǎng)吸收的障礙可能是第一種類型非寄主抗性的原因。第五種假設(shè)的障礙和由多 獨立的 R/因組合介導(dǎo)防御體系相關(guān)。其實寄主抗性和非寄主抗性沒有非常嚴(yán)格的界限，這也解釋了為什么許多研究表明寄主和非寄主抗性反應(yīng)的基因表達非常相似（ et 2003）。幾個有關(guān)信號分子，例如水楊酸、乙烯， 熱休克蛋白被發(fā)現(xiàn)在寄主和非寄主抗性種都起作用（ 2004）。 et 2003), et 1996) 和 et 2003) 介導(dǎo)光譜抗性，是聯(lián)系寄主 抗性和非寄主抗性的橋梁。盡管許多例子表明寄主和非寄主抗性 反應(yīng)由很大程度的重疊，對非寄主抗性的理解仍然非常欠缺。然而，對病原體在非生命物質(zhì)表面、寄主和非寄主植物表面的發(fā)育的研究可以幫助理解第一類型的非寄主抗性。對特定植物和那些與寄主植物有不同的遺傳進化距離非寄主病原體的互作的進一步研究；以及利用特定的病原體和那些與寄主植物有不同遺傳距離的非寄主植物的互作的研究，可能會使我們對非寄主抗性有更深入的理解。 單基因和多基因抗性 寄主抗性像其它性狀一樣表現(xiàn)為質(zhì)量性和數(shù)量性。寄主抗性也因此可以劃分為質(zhì)量性抗性（通常 有一個基因控制）和數(shù)量性抗性（通常由多個基因控制）。再育種應(yīng)用的大多數(shù)抗性是單基因控制的抗性，多基因控制抗性在育種中的應(yīng)用相對較少（ do et 2001）。多基因控制抗性是許多微效基因共同作用的結(jié)果，因此分離群體表現(xiàn)出連續(xù)性的抗性水平，抗性個體和感病個體不容易區(qū)分。相反，單基因控制抗性由一個主效基因控制，分離群體表現(xiàn)不連續(xù)的抗性水平，因而抗性個體和感病個體比較容易區(qū)分。除了幾個少數(shù)幾個 R 基因（例如 以介導(dǎo)持久抗性外，大部分顯性單基因控制抗性由于相應(yīng)的病 原體的 進化而被攻克，因此抗性持續(xù)時間較短。而多基因抗性通常被認(rèn)為是非小種轉(zhuǎn)化性和持久的（ do et 2001）。盡管多基因抗性在許多作物中對許多病原體表現(xiàn)除不同水平的抗性（ do et 2001），但是這種抗性并不象單基因抗性在實際生產(chǎn)中應(yīng)用的那么廣泛。多基因抗性沒有被廣泛利用的主要原因是因為這種抗性常常并不完全和聚集的這些所有的 單一的品種中非常困難。利用側(cè)翼分子標(biāo)記可以幫助聚集多個 一個單一品種（ 2005）。將單基因和多基因抗性聚集到一個單一品種中可能有利于提高抗性的水平和持久性（本論文）。因而，雖然研究許多微效基因要比研究一個主效基因困難，但是多基因抗性育種仍然值得引起注意。 顯性和隱性 R 基因 過去植物抗病性的研究大多集中在顯性 R 基因和相應(yīng)的抗性途徑（ et 2004）。 相關(guān)的工作已經(jīng)得到了很好的總結(jié)（ et 2003； 003），在本論文中的前言部分主要介紹隱性 R 基因的情況。再已經(jīng)克隆的 50 多個 R 基 因（ et 2005）中，大部分是顯性基因，其中的大部分基因擁有相似的保守區(qū)域（富含鏈亮氨酸重復(fù)， 相對于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 博士 學(xué)位論文 第一章 緒論 4 顯性 R 基因 只有很少的幾個隱性基因被克隆。幸運的是，感病性機理正引起人們越來越多的注意，一系列的介導(dǎo)對不同病原體抗性的隱性抗性基因位點也被相繼發(fā)現(xiàn)。 迄今，有三個隱性 R 基因得到分離，分別是 2004）， et 2002）和 et 1997） 。 與水稻白葉枯?。?抗性相關(guān)的隱性基因；鑒定所用菌株（小種）：菲律賓菌株 編碼一個轉(zhuǎn)錄因子 A 的 亞基（ 與已知抗病基因具有不同結(jié)構(gòu)， 一般真核生物的轉(zhuǎn)錄因子，但以前對其在抗病基因中作用未知，對 序發(fā)現(xiàn)，抗病和感病材料之間有兩個核苷酸替代從而導(dǎo)致氨基酸的變化（ 2004）。從對青枯菌（ 病和抗病的擬南