【畢業(yè)學(xué)位論文】（Word原稿）G-CSF改善子宮內(nèi)膜狀況的臨床及機理研究

蘭州大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文 善子宮內(nèi)膜狀況的臨床及機理研究 1 中英文縮略對照 英文縮寫 英文全稱 中文全稱 n 外授精及胚胎移植 細胞集落刺激因子 細胞集落刺激因子受體 組人粒細胞集落刺激因子 噬細胞集落刺激因子 細胞 /巨噬細胞集落刺激因子 酸鹽緩沖液 -(4,52,5甲 基偶氮唑鹽比色法 甲基亞砜 牛血清 式細胞儀 介素 二醇 P 激素 泡刺激素 體生成素 體泌乳素 木精 疫組織化學(xué) 氨基聯(lián)苯胺 宮內(nèi)膜基底 蘭州大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文 善子宮內(nèi)膜狀況的臨床及機理研究 2 第一章 前言 胚胎種植是人類輔助生殖過程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，它依賴于正常的內(nèi)分泌激素、多種細胞因子之間相互協(xié)調(diào)而建立的胚胎發(fā)育與子宮內(nèi)膜容受 狀態(tài)的同步化過程。炎癥和損傷使子宮內(nèi)膜的 組織結(jié)構(gòu)和功能完整性受到破壞，引起內(nèi)膜過薄、對雌激素及血管活性藥物反應(yīng)差 ，宮壁組織瘢痕粘連、宮腔變形、狹窄和閉鎖，降低了子宮內(nèi)膜的容受性，因此選擇一種有效的改善子宮內(nèi)膜容受性的措施對于促進胚胎種植，改善 娠率具有重要的意義 。目前， 輸卵管因素 是造成不孕癥 的主要 病 因， 一般由女性生殖系統(tǒng)的炎癥所致。 病原微生物沿陰道上行經(jīng)宮頸蔓延至子宮內(nèi)膜，長期慢性的炎癥，可引起子宮內(nèi)膜基底 終不僅引起輸卵 管的炎癥、粘連，功能障礙，也影響了內(nèi)膜的功能，造成胚胎著床障礙 。 哺乳動物的成功妊娠中具有重要的作用，參與了人卵泡、胎盤及子宮內(nèi)膜的生長、發(fā)育，是胚胎種植過程中 不可或缺的一種細胞因子，它通過升高外周血中的白細胞，增強了機體的 免疫 力。 對紐約 2 家獨立的心的 4 位患者進行了前瞻性同期研究， 4 位行 療的患者，體外受精 現(xiàn)有治療方法進行過多種嘗試后，內(nèi)膜厚度仍極不達標，于是使用 陰道對內(nèi)膜行灌注治療，測量指標為移植日子宮內(nèi)膜厚度及妊娠率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對之前對于激素及血管舒張藥物不敏感的患者使用 腔灌注后，其子宮內(nèi)膜至少長至 74 位患者胚胎移植后，均獲得妊娠，其中 1 位患者因?qū)m角妊娠而終 止妊娠。灌注后大約 48 小時內(nèi)，子宮內(nèi)膜增長至最小移植厚度。這提示我們 解決目前棘手的內(nèi)膜過薄 、行滲出性改變、 胎反復(fù)種植失敗 問題的一個新方法，但其 改善 子宮內(nèi)膜的機理 仍需進一步研究。 粒細胞集落刺激因子 （ 是一種糖蛋白，含有 174 個氨基酸，分子量約為 20000。人 位于 17 號染色體的 的單個基因編碼，長約2.5 5 個外顯子和 4 個內(nèi)含子 ,其蛋白質(zhì)由 174 個氨基酸組成 ，含 30 個氨基酸的疏水信號系列 1。 要由 活化單核或巨噬細胞分泌，但在適當?shù)拇碳は驴捎蓹C體多種細胞產(chǎn)生，這其中包括一些腫瘤細胞 ,可刺激骨髓中性粒前體細胞的增殖及分化 ,促進中性粒細胞的成熟及功能 2。對于成熟的中性粒細胞，蘭州大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文 善子宮內(nèi)膜狀況的臨床及機理研究 3 促進其游走、吞噬、產(chǎn)酶、釋放活性氧、殺菌能力和對外來異物的粘著作用，還可動員成熟中性粒細胞從骨髓進入外周。 目前臨床 要用于預(yù)防和治療腫瘤放療或化療后引起的白細胞減少癥、治療骨髓造血機能障礙及骨髓增生異常綜合征、預(yù)防白細胞減少可能潛在的感染并發(fā)癥、以及使感染引起的中性粒細胞減少的恢復(fù)加快。 機體抗感染機制中起著重要的作用，早在 1991 年 ， 批準了 劑用于各種非髓性腫瘤的骨髓抑制性化療中 ， 以避免因粒細胞減少癥引起的感染和死亡，此外 ,應(yīng)用于其他原因引起的免疫缺陷患者 ， 可刺激嗜中性粒細胞的分化增殖 ,起到提高抗感染能力的作用 3, 4。也有研究 5表明 有抗細胞凋亡及抑制炎癥反應(yīng)的作用 。 目前 ， 臨床應(yīng)用主要有以下幾方面 3 用于骨髓移植治療免疫性疾?。鹤泽w外周造血干細胞移植，應(yīng)用 重組人粒細胞集落刺激因子（ 將患者造血干細胞動員至外周血 ， 并經(jīng)過采集分選等處理后重新輸回患者 ,使其造血和免疫重建；用于各種腫瘤 ,如急性白血病的化療和嚴重粒細胞減少癥；用于非血液系統(tǒng)腫瘤的治療和治療感染性疾??； 于心肌保護和神經(jīng)保護有功效 。 較高同源性，具有相似的生理作用及功能， 近幾年有文獻 9, 10報道 創(chuàng)面、潰瘍的愈合也有很好的療效，具有促進粘膜細胞增殖的作用。不同濃度 胎兒口腔粘膜成纖維細胞的增殖及 成有刺激作用，在 80ng/成纖維細胞生長達到最佳狀態(tài)，可能機制為 卵巢顆粒細胞、睪丸 胞、胎盤、子宮內(nèi)膜細胞中均有表達，可能參與了人卵泡顆粒細胞、胎盤及子宮內(nèi)膜細胞生長、發(fā)育的調(diào)節(jié)，也是胚胎著床的調(diào)節(jié)因子之一 11。小鼠研究 12表明一定濃度的 通過旁分泌方式調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜基質(zhì)細胞活化數(shù)目，調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜蛻膜化，利于胚胎著床，但其具體 機制尚不清楚。 此外，有研究發(fā)現(xiàn) 13 支氣管哮喘、慢性阻塞性肺病、膿毒血癥、結(jié)腸炎等疾病均有不同程度的治療作用，在腦、腎缺血再灌注中能夠促進血管的生成。 蘭州大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文 善子宮內(nèi)膜狀況的臨床及機理研究 4 圖 圖 2 生物活性圖 蘭州大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文 善子宮內(nèi)膜狀況的臨床及機理研究 5 圖 3. 神經(jīng)細胞 的 作用機制圖 圖 4 白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu) 蘭州大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文 善子宮內(nèi)膜狀況的臨床及機理研究 6 對健康男子進行的靜脈點滴及皮下注射給藥（ 1 g/的研究結(jié)果表明：靜滴 30 ，其 為 h，并有隨劑量的增加而延長的傾向，藥時曲線下面積為 ngh/下注射，血藥峰濃度出現(xiàn)于給藥后 h， 為 時曲線下面積為 ngh/物利用度是 下注射 4 h 以后，血藥濃度比同一時間靜滴時為高。靜滴或皮下注射連續(xù)給藥 6 h，血藥濃度變化均與單次給藥時無明顯差異。無論哪種給藥方法及用量，給藥 48 h 后，血藥及尿藥濃度均在檢出界限以下 17。 能會有以下不良反應(yīng) 18： 1. 偶有皮膚 發(fā)紅、皮疹，有時會有食欲不振、惡心、嘔吐等消化道反應(yīng)及肝功能損害；還可引起骨痛、腰痛、胸痛等；還可能引起堿性磷酸酶，低密度脂蛋白升高及發(fā)熱、頭痛、倦怠、心悸、尿酸和肌酐升高等。 2. 對孕婦及早產(chǎn)兒、嬰兒的安全性尚未確認。 3. 對本品或其它基因重組制品有過敏反應(yīng)的患者忌用本品。 4. 有藥物過敏史、有過敏體質(zhì)以及有肝、腎、心、肺功能重度障礙的患者，需慎用。臨床前研究表明，無論哪種給藥途徑，單次給予本品對大鼠、狗和猴的 在 3000 g/10 g/（ kgd）連續(xù)靜注 4 周、 1 g/（ kgd） 連續(xù)靜注 13 周無不良影響。 生物學(xué)作用是通過與效應(yīng)細胞表面特異性受體 （ 合而產(chǎn)生的。在髓祖細胞，髓性白血病細胞、成熟中性粒細胞、血小板、單細胞及某些 T， B 淋巴細胞均有不同密度的受體存在 19某些非造血細胞 ， 如血管內(nèi)皮細胞、胎盤細胞、小細胞、肺癌細胞系及滋養(yǎng)層細胞等 ， 也有 在 。 粒系祖細胞 數(shù)量隨著細胞的成熟而增加，人類成熟粒細胞表面有200 1 000 R/細胞，有一單一的高親力位點，其解離常數(shù) （ 值約為 200 500 ，交聯(lián)試驗表明 白分子量約為 130 000 150 000 道爾頓，僅需少量 合即可誘發(fā)最大 物效應(yīng)。 隆是 1990 年報告的， 分子克隆對闡明作用機理有極其重要的價值。人類 由 813 氨基酸組成的單一胯膜區(qū)的多肽鏈分子組成的，與小鼠 的 核酸水平有 源性，在氨基酸水平有 同源性，與 體之間的同源性相對小的多。 1 個胞外區(qū)、胯膜區(qū)及胞漿內(nèi)區(qū)組成，結(jié)構(gòu)分析表明， 州大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文 善子宮內(nèi)膜狀況的臨床及機理研究 7 息傳導(dǎo)蛋白等，其特點是胞外區(qū)有 4個保守的半胱氨酸殘基和一個 題序列 23。 胞外區(qū) 6 氨基酸組成的免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu) （ 結(jié)構(gòu) ） ，是配體與受體結(jié)合的部位；緊接其后是 （ 97，在 的 N 端有一 個富含 列，其 C 端有 題序列， 缺失分析表明 是配體與受體結(jié)合所必需的結(jié)構(gòu)，若無此區(qū)配體結(jié)合后不能形成寡聚結(jié)構(gòu)，因此 結(jié)構(gòu)及 是 受體結(jié)合所必不可少的區(qū)域。 與胯膜區(qū)之間 （ 310由 3 個重復(fù)的 型纖維蛋白結(jié)構(gòu) （ 區(qū) ） 組成。 胞內(nèi)區(qū)由 183 成， 種突變化的研究表明：近膜區(qū)的 55 增殖及生存信號轉(zhuǎn)導(dǎo)所必須的，該區(qū)域內(nèi)有兩個功能亞區(qū)，稱為 基， 亞基中有很強的保守性，且都參與細胞增殖及生存信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)。之后的 30 56，有顯著擴大受體介導(dǎo)的有絲分裂信號的作用，提示該區(qū)內(nèi)可能存在另外的功能亞區(qū)。 內(nèi) 8 轉(zhuǎn)導(dǎo)細胞成熟信號必需的區(qū)域。近年來發(fā)現(xiàn)，該區(qū)域也是 導(dǎo)的細胞凋亡所必不可少的區(qū)域，在髓系細胞中能抑制增殖信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)。這一區(qū)域內(nèi)有一保守序列稱為 樣存在于 號傳導(dǎo)蛋白 ， 能誘導(dǎo)正常小鼠骨髓粒細胞集落的形成，并能誘導(dǎo) 血病細胞向成熟細胞分化，說明區(qū)可能通過與之相關(guān)的特異的細胞底物直接參與了調(diào)控細胞成熟的過程24。 迄今為止，已發(fā)現(xiàn) 5 種不同類型的 異構(gòu)體 （ ，主要是由于 同的剪接方式造成的，各種變構(gòu)體的生物學(xué)作用及其表達的調(diào)控目前尚不十分明確。 5發(fā)現(xiàn) 1 例 因上有 1 個 突變，而使 胞 異體的表達明顯增加，而變化了的 能轉(zhuǎn)導(dǎo)細胞成熟的信號，只能傳導(dǎo)增殖信號。推測白血病的發(fā)生與 突變有一定關(guān)系。先天性粒細胞缺乏的患者也發(fā)現(xiàn)類似 常的情況，因此對各種 不同細胞表達情況的研究對揭示粒細胞性疾病的發(fā)病機理有重要的意義。 蘭州大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文 善子宮內(nèi)膜狀況的臨床及機理研究 8 第二 章 料與方法 例資料 選擇內(nèi)膜對雌激素及血管活性藥物反應(yīng)極差，至少 3 個周期監(jiān)測示內(nèi)膜厚度未超過 0.7 子宮內(nèi)膜基底完全低回聲，之前有過 1 次或多次因內(nèi)膜因素 敗的患者共 60 例行 腔灌注治療，其中 7 人既往孕早中期胚胎停育史；選擇同期內(nèi)膜情況相似患者 30 例作為對照。 2 組患者的年齡、不育時間、體質(zhì)量指數(shù)（ 胚胎質(zhì)量及灌前內(nèi)膜評分均無統(tǒng)計學(xué)差異（ P見表 1。 表 1 間斷停藥組與未停藥組一般情況 組別 n 年齡（歲） 不育 時間（年） kg/ 胚胎質(zhì)量 灌前內(nèi)膜評分 灌注組 60 照組 30 子宮內(nèi)膜回聲評分 在內(nèi)膜增生中晚期，若形態(tài)為 A 型，記 4 分， B 型 3 分， C 型 2 分，若因內(nèi)膜過薄呈線性，記 1 分；宮腔無積液，記 1 分，存在宮腔積液，記 0 分；縱切位暴露全子宮，基底低回聲面積 1/3，記 4 分，介于 1/3 與 2/3 面積，記 3 分， 2/3記 2 分，完全低回聲時，記 1 分。各項相加的總分為子宮內(nèi)膜回聲評分。 療方案 根據(jù)患者的具體情況選擇在早卵 泡期、晚卵泡期，或圍排卵期進行 者憋尿后取截石位于檢查床上，用窺陰器暴露宮頸；碘伏消毒外陰及陰道。腹超監(jiān)測子宮。使用移植管及 2 射器組合而成的灌注器抽吸00 2 白，山東齊魯制藥）。移植管經(jīng)陰道進入宮頸口，穿過宮頸內(nèi)口即可將灌注液緩慢推入患者宮腔內(nèi)，腹超監(jiān)測。陰道窺撤出陰器后，蘭州大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文 善子宮內(nèi)膜狀況的臨床及機理研究 9 患者保持截石位 10 下床即可。灌前監(jiān)測患者子宮內(nèi)膜的厚度、回聲、基底回聲、血流動力學(xué)等指標，灌注后連續(xù)監(jiān)測內(nèi)膜厚度及回聲的變化，灌注后48 h 再次監(jiān)測血流動力學(xué)指標，根 據(jù)內(nèi)膜的改善情況決定灌注的次數(shù)，所有患者灌注次數(shù)為 1。根據(jù)內(nèi)膜情況，決定移植與否及移植日，選擇 2優(yōu)質(zhì)胚胎進行移植，移植后 14 16 d 驗血 定生化妊娠，移植后 30 d 陰道超聲檢查確定臨床妊娠。所用儀器為美國 9 彩色多普勒超聲診斷儀，經(jīng)陰道探頭頻率范圍 5量部位：縱切位全面暴露子宮，觀察內(nèi)膜線性，前后壁基底區(qū)各選擇兩點測血流，待出現(xiàn)至少連續(xù) 4 個穩(wěn)定的波形圖后再作測量，取其平均值為該患者子宮基底區(qū)動脈的血流動力學(xué)值。 計學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)采用 行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)經(jīng)正態(tài)性檢驗，如為正態(tài)分布，用均數(shù) 標準差表示，組內(nèi)前后比較用自身配對 T 檢驗，組間比較采用重復(fù)測量方差分析。如為非正態(tài)分布，組內(nèi)前后比較采用非參數(shù) 號秩檢驗，組間比較采用 參數(shù)檢驗。 基底區(qū)動脈 8 h 后較前增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（ 基底區(qū)動脈 8 h 后較前增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（ 在灌后 96 h 內(nèi)膜厚度及基底回聲評分有統(tǒng)計學(xué)差異（ 見表 6、 7，圖 5、 6。 表 6 圍排卵期灌注前子宮內(nèi)膜厚度、基底回聲及血流變化的比較 組別 n 灌注前 內(nèi)膜厚度 回聲 I 對照組 10 注組 19 7 圍排卵期灌注后 48 h 及 96 h 子宮內(nèi)膜厚度、基底回聲及血流變化的比較 組別 n 灌注后 48h 灌注后 96h 內(nèi)膜厚度 回聲 I 內(nèi)膜厚度 回聲 對照組 10 注組 19 與對照組相比較 *P灌注前相比較 P 5 不同時期子宮內(nèi)膜厚度及回聲評分變化圖 蘭州大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文 善子宮內(nèi)膜狀況的臨床及機理研究 12 圖 6 不同時期子宮內(nèi)膜 動脈 化圖 組妊娠率的比較 在已行胚胎移植的患者中，灌注組的妊娠率為 35/56），對照組的妊娠率為 9/27），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（ P 注前后血清細胞因子檢測 灌注組與對照組相比，血清 D 值增高， 低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義， D 值無明顯變化，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。則可反應(yīng)血清濃度，即：灌注組血清 度 增高 ， 低 。 見表 8。 表 8 灌注前后兩組血清細胞因子 變化幅度表 對照組 注組 與對照組相比較 *P州大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文 善子宮內(nèi)膜狀況的臨床及機理研究 13 論 胚胎著床既需要胚胎具有良好的發(fā)育潛能，又需要子宮內(nèi)膜具有良好的容受性，子宮內(nèi)膜容受性受激素、細胞因子、神經(jīng)免疫因素等多方面的調(diào)控。慢性子宮內(nèi)膜炎、子宮內(nèi)膜息肉、宮腔粘連的情況在 常有存在，使子宮內(nèi)膜在形態(tài)學(xué)、受體及相關(guān)因子的表達上發(fā)生變化 ,降低了其容受性。子宮內(nèi)膜超聲形態(tài)如厚度、回聲、基底回聲、血流灌 注等是反應(yīng)子宮內(nèi)膜狀況最直接的指標。超聲顯示正常子宮內(nèi)膜種植窗時期厚度一般約在 910 容積不小于 2 超聲下內(nèi)膜面積多在 5 宮腔有效空間減少或內(nèi)膜過薄都會影響胚胎著床與發(fā)育，黃體中期時，子宮內(nèi)膜厚度 7 嚴重影響受精卵的著床 26。內(nèi)膜回聲變化應(yīng)均勻一致并具備與卵泡發(fā)育的同步性變化，否則會影響妊娠率27，在內(nèi)膜增生期可以觀察到清晰的 三線征 ，而中重度子宮內(nèi)膜炎，無論結(jié)核性或非結(jié)核性，其炎性滲出物往往造成內(nèi)膜回聲不均或基底低回聲，是影響成功妊娠的內(nèi)膜因素之一。此外， 子宮內(nèi)膜的血管活動呈周期性改變，子宮血流舒張末血流逐漸升高，黃體中期達高峰，阻力指數(shù) （ 明顯下降，利于胚胎著床。如果子宮動脈 持續(xù)增高 ,血管阻力高 ， 組織血液灌注減少 ， 子宮內(nèi)膜的血供不良 ,影響子宮內(nèi)膜的發(fā)育，胚胎則不能著床或著床后穩(wěn)定性差 28。 一種糖蛋白，主要作用于中性粒細胞系促進其增殖、分化和活化，對成熟的中性粒細胞可促進游走、吞噬、產(chǎn)酶、釋放活性氧、提高殺菌能力和對外來異物的粘著作用。臨床主要用于預(yù)防和治療腫瘤放化療后引起的白細胞減少癥、治療骨髓造血機能障礙及骨髓增生異常綜合征、 預(yù)防白細胞減少可能潛在的感染并發(fā)癥、以及促進由感染引起的中性粒細胞減少的恢復(fù)。它與同類的巨噬細胞集落刺激因子（ 粒細胞 生殖系統(tǒng)及粘膜修復(fù)中也起到一定的作用：對創(chuàng)面、潰瘍的愈合有較好的療效，具有促進粘膜細胞增殖的作用 29。對于生殖系統(tǒng)，集落刺激因子參與了卵泡發(fā)育及排卵過程 30、調(diào)節(jié)卵巢 31及調(diào)節(jié)顆粒細胞功能 32，調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜蛻膜化 33、促進子宮內(nèi)膜細胞增殖 34及胚胎種植 35。近年的研究發(fā)現(xiàn) 刺激周期可以改善低反應(yīng) 患者卵巢敏感性 38， 是卵子及胚胎種植潛能的一種標記物 39，能夠降低復(fù)發(fā)性流產(chǎn)風險 35,40，是預(yù)測 局的指標之一 31，且對自蘭州大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文 善子宮內(nèi)膜狀況的臨床及機理研究 14 身免疫性疾病具有抑制作用 41。 34對 4 例內(nèi)膜反應(yīng)性差、雌激素及血管活性藥物抵抗的患者進行了報道，發(fā)現(xiàn)當子宮內(nèi)膜厚度小于 7 ，使用 300 ug/度的 行宮腔灌注對子宮內(nèi)膜厚度及容受性具有明顯的改善作用，提示 能具有促進子宮內(nèi)膜細胞增生及刺激內(nèi)膜血管網(wǎng)再生等作用。我們的研究基于 的報道，選擇內(nèi)膜厚度不足、基底低回聲、反復(fù)種植失敗的患者作為研究對象，給予 宮腔灌注，在早卵泡期及晚卵泡期，對于子宮內(nèi)膜厚度及基底回聲改善明顯，圍排卵期宮腔灌注并不能改善內(nèi)膜的厚度，但對基底回聲仍然有效，可能與 激了子宮內(nèi)膜血管網(wǎng)中白細胞的生成及成熟，增加了抗炎作用有關(guān)；對于子宮內(nèi)膜基底區(qū)血流動力學(xué)的影響，主要在于增加了基底區(qū)動脈的血流灌注，使得搏動指數(shù)增加，然而，并未使得阻力指數(shù)下降，但這只是灌注后 48 h 的血流，而我們尚未對多次灌注后、或胚胎移植日的血流動力學(xué)做監(jiān) 測，目前的研究結(jié)果顯示， 腔灌注可改善子宮內(nèi)膜的厚度及基底回聲，對于內(nèi)膜較薄、基底低回聲及胚胎反復(fù)種植失敗的患者具有較好的臨床治療效果。 受體（ 人類子宮內(nèi)膜細胞上廣泛分布， 受體表達于人類子宮內(nèi)膜的上皮細胞，基質(zhì)細胞、白細胞及滋養(yǎng)層細胞 42, 43及蛻膜化組織等， 由巨噬細胞和 胞所分泌 44, 45。研究發(fā)現(xiàn)正常非妊娠婦女的子宮內(nèi)膜基質(zhì)細胞可分泌少量的 而所分泌的 以在 88作用 下顯著增加。 認為對妊娠滋養(yǎng)層細胞的增值具有促進作用 46，據(jù)報道，蛻膜化的子宮內(nèi)膜基質(zhì)細胞可產(chǎn)生豐富的非蛻膜化內(nèi)膜基質(zhì)細胞只產(chǎn)生很少量 47從而解釋 腔灌注對于既往胚胎停育患者的具有治療作用的原因。有研究顯示過量的 通過抑制子宮內(nèi)膜基質(zhì)細胞向分泌泌乳素（ 基質(zhì)細胞分化，從而抑制了8導(dǎo)的蛻膜化，而適量的 能夠促進基質(zhì)細胞向分泌 加 分泌 50。由于子宮內(nèi)膜基質(zhì)細胞有多種分泌類型， 如普通基質(zhì)細胞，分泌 基質(zhì)細胞，分泌泌乳素的蛻膜化細胞等等，而 子宮內(nèi)膜容受性的調(diào)節(jié)可能是通過改變不同分泌類型的細胞數(shù)量，從而使內(nèi)膜分泌的各種生物活性因子達到更利于胚胎植入的狀態(tài)。這也可能蘭州大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文 善子宮內(nèi)膜狀況的臨床及機理研究 15 是 腔灌注可改善子宮內(nèi)膜狀況機制之一。 腔灌注能夠?qū)Υ萍に丶把芑钚运幬锏挚沟淖訉m內(nèi)膜的厚度、不明原因基底低回聲的內(nèi)膜有所改善，對子宮內(nèi)膜炎癥具有治療作用、促進了子宮內(nèi)膜細胞增生以及改善了子宮內(nèi)膜容受性。 孕婦及早產(chǎn)兒、嬰兒的安全性尚未確認，現(xiàn)有的研究表明，在安全劑量下靜滴或 皮下注射 影響人體健康；無論哪種給藥方法及用量，給藥 48 h 后，血藥及尿藥濃度均在檢出界限以下。 脈及皮下注射時存在一些風險及不良反應(yīng)，可能引起骨痛、腰痛、胸痛、發(fā)熱、頭痛、倦怠、心悸等不適，偶有皮膚發(fā)紅、皮疹；食欲不振、惡心、嘔吐等消化道反應(yīng)及肝功能損害；偶爾可能引起堿性磷酸酶，低密度脂蛋白升高及尿酸和肌酐升高等。對于疼痛可口服消炎痛半片或肌注非那根半支對癥治療；其余不適無需特殊處理。在我們行宮腔灌注的 60 例患者中，有 1 人發(fā)生輕度骨痛，第二天緩解， 2 人出現(xiàn)眼睛紅腫干澀，休息后緩解， 2 人 有脫發(fā)癥狀，其余患者無不適。在經(jīng)過 復(fù)宮腔灌注治療后，對于內(nèi)膜狀況較前改善的患者擇期解凍胚胎進行移植，取得了較好的妊娠率，由于本研究的樣本量有限，觀察時間尚短，期待今后大樣本的臨床實驗?zāi)軌蜻M一步證實 子宮內(nèi)膜厚度、回聲的改善及對作用機制進行更深入的研究。 蘭州大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文 善子宮內(nèi)膜狀況的臨床及機理研究 16 第 三 章 料與方法 織標本的獲取 選取 2012 年 12 月 4 月在蘭州大學(xué)附屬第一醫(yī)院婦產(chǎn)科因子宮肌瘤（肌壁間）行全子宮切除術(shù)的患者 6 例，平均年齡 40 歲，所有患者術(shù)前 3 個 月均未用過激素治療。在行全子宮切除術(shù)后，無菌條件下切取子宮內(nèi)膜，浸于加有雙抗（青霉素 +鏈霉素）的生理鹽水中， 30 運往實驗室進行分離培養(yǎng)。 要儀器 高壓滅菌儀 日本 司 4 冰箱 青島海爾有限公司 冰箱 青島海爾有限公司 離心機 美國 司 搖床 北京恒奧生物科技有限公司 酶聯(lián)免疫檢測儀 美國 司 英國 司 倒置相差顯微鏡 日本 司 超凈工作臺 濟南鑫貝西生物有限公司 96 孔細胞培養(yǎng)板 美國 司 6 孔細胞培養(yǎng)板 美國 司 直徑 10胞培養(yǎng)皿 美國 司 細胞計數(shù)板 上海求精生化試劑儀器有限公司 粘附載玻片 上海臥宏科技有限公司 要試劑 12 培養(yǎng)基 美國 司 胎牛血清 美國 司 胰蛋白酶 美國 司 蘭州大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文 善子宮內(nèi)膜狀況的臨床及機理研究 17 膠原酶 美國 司 國 司 鼠抗人 克隆抗體 美國 司 國 司 海譜振生物科技有限公司 抗人角蛋白抗體 美國 司 抗波形蛋白抗體 美國 司 劑盒 武漢博士德生物工程有限公司 色劑 武漢博士德生物工程有限公司 垢劑 美國 司 記 國 司 宮內(nèi)膜細胞組織塊培養(yǎng)法 用無菌生理鹽水沖洗內(nèi)膜組織 3，超凈臺內(nèi)在 60 養(yǎng)皿中用眼 科剪將內(nèi)膜組織剪碎至糊狀（約 1 加入適量 養(yǎng)液，用 1 入培養(yǎng)皿，再加入適量培養(yǎng)液將皿中的組織塊吹打均勻，置于 37 二氧化碳培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng) 3 天， 3 天后用倒置顯微鏡觀察細胞貼壁情況。 宮內(nèi)膜細胞 分離及接種 基質(zhì)細胞分離 待子宮內(nèi)膜細胞貼皿底達 80%以上時進行分離，用培養(yǎng)液沖洗皿底 3 次，加入 蛋白酶 3-5 化 3-5 顯微鏡下觀察細胞變圓，成懸浮細胞后，加入完全培養(yǎng)基吹打終止消化。收集細胞懸液至無菌刻度離心管中放入離心機， 以 500 r/心 3 集上清液，主要為基質(zhì)細胞，以1200 r/心 10 上清液即得基質(zhì)細胞，加入適量完全培養(yǎng)基，重懸細胞以 1106/密度接種細胞。 腺上皮細胞分離 將消化的細胞懸液置于刻度離心管中放入離心機 500 r/心 3收集沉淀物，用無血清 養(yǎng)液漂洗后 800 r/心 5 上清，加入適量完全培養(yǎng)基 重懸細胞 1106/密度接種細胞；基質(zhì)細胞和腺上皮細胞于培養(yǎng)箱中靜置 3 天后均貼壁。 疫組化法鑒定 子宮內(nèi)膜細 胞 用細胞角蛋白 波形蛋白抗體對腺上皮和基質(zhì)細胞進行細胞爬片免疫化蘭州大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文 善子宮內(nèi)膜狀況的臨床及機理研究 18 學(xué)染色，基質(zhì)細胞及腺上皮細胞爬片 5 天后進行免疫細胞組織化學(xué)染色鑒定。一抗為兔抗人 克隆抗體，濃縮液 1： 200 稀釋，鼠抗人 克隆抗體 1:200 稀釋，二抗為生物素標記羊抗兔或小鼠 劑盒，試驗步驟嚴格按照試劑盒說明書進行，具體如下： 洗標本 3 次 ， 各 1 4%多聚甲醛固定 30 氣干燥 5 洗標本 3 次 ， 各 2 ） 孵育 1 次 20 洗標本 3 次 ， 各 2 3%色液體）孵育 1520 除內(nèi)源性過氧化酶活性， 洗標本 3 次 ， 各 2 加封閉血清（試劑 A 藍色液體）室溫孵育 1520 去，勿洗，滴加適當比例稀釋的一抗孵育（滴度 1： 200，濕盒） 4 過夜或 37 23 h； 洗標本 3 次 ， 各 3 加試劑 B（黃色液體）即二抗工作液孵室溫或 37 1520 洗標本 3 次 ， 各 3 滴加試劑 C（橙色液體），室溫或 37 孵育1520 洗標本 3 次 ， 各 3 色（ A， B， C 依次各加一滴，避光，鏡下觀察至棕色 ）約 310 來水充分沖洗，蘇木素復(fù)染，蘸后即刻取出，自來水洗返藍，梯度酒精脫水 85， 95， 100%各 3 甲苯透明，蘸后即刻取出，用中性樹膠封片后顯微鏡觀察及拍片。 及 腺上皮細胞的影響 96 孔板中的細胞貼壁 24 h 后 ， 棄去培養(yǎng)基 ,加入 新鮮 含血清的 養(yǎng)基 200 分別加入不同濃度的 度 分別 為 100 pg/200 pg/500 pg/ 1000 pg/并設(shè)有空白對照組 和 陰性對照組。繼續(xù)培養(yǎng) ， 24 h 后加入 5mg/ 20孔 ， 孵育 4 h， 棄去培養(yǎng)基 ， 加入 37 孵育30速震蕩 10在酶聯(lián)免疫檢測儀 490 長測定吸收值 （ ， 比較各組 并 繪制條圖 。 可反應(yīng) 細胞存活率表示 ， 即細胞存活率 =（ 實驗組 空白對照組 ） /（陰性 對照組 空白對照組 ）*100%。 式細胞儀 檢測 兩組細胞 6 孔板中的細胞貼壁 24 h 后，棄 去培養(yǎng)基 ,加入 新鮮 含血清的 養(yǎng)基2 基質(zhì)細胞和腺上皮細胞 培養(yǎng)孔中 分別加入 200 及 500 pg/48h 后棄去培養(yǎng)基，用不含血清 洗 2 遍，使用胰酶分別消化兩種細胞，于顯微鏡下觀察懸浮細胞達 80%以上時，終止消化。以 1200 r/ 800 r/速度分別離心基質(zhì)細胞及腺上皮細胞，棄去上清，將沉淀物吹打均勻后，取 200 P 管中，分別加入 10 E 熒光標記的 吹蘭州大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文 善子宮內(nèi)膜狀況的臨床及機理研究 19 打均勻，室溫放置 15，上機檢測。 組 細胞 3及 241 6 孔板中的細胞貼壁 24 h 后，棄去培養(yǎng)基 ,加入新鮮含血清的養(yǎng)基 2 質(zhì)細胞和腺上皮細胞培養(yǎng)孔中分別加入 200 及 500 pg/48h 后棄去培養(yǎng)基，用不含血清 洗 2 遍， 進行如下操作： 取 1. 6 孔板加入 500 上勻漿（邊勻漿邊暫停） 2. 轉(zhuǎn)入一新 中（ 室溫裂解 10. 加氯仿 200 蕩混合（手搖劇烈），室溫靜置 5. 13000 離心 15. 轉(zhuǎn)移上層水相（吸 70%）到一新 中，加等體積異丙醇 ,振蕩混合，室溫靜置 10. 13000 離心 15. 倒掉上清，加 15%無水乙醇（ 4保存），振蕩混合， 8000 離心 5. 倒掉上清，室溫或 37放置 20P 管倒置在濾紙上 )使 淀干燥 9. 加 30至 中 10. 在 60孵育 3 分溶解 逆轉(zhuǎn)錄 1. 暫離心 2. 將 11 和 1入 內(nèi)，置于冰上，使 濃度為 加入 1輕混合均勻，短時間離心 3. 將反應(yīng)液置于 65 5上 1時間離心 4. 按順序加入： 5 400糖核苷酸酶抑制劑 10mm 2轉(zhuǎn)錄酶 1輕混合均勻，短時間離心 5. 將混合物置于 42， 60. 70加熱 5止上述反應(yīng)，置于冰上 蘭州大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文 善子宮內(nèi)膜狀況的臨床及機理研究 20 聚合酶鏈反應(yīng) . 物 上游引物 5 下 游引物 5 擴增片段理論長度 326 3 上游引物 5 下 游引物 5 擴增片段理論長度 262 上游引物 5 下游引物 5 擴增片段理論長度 645 5反應(yīng)體系，冰上操作，稍后短時間離心 1 1 1 補至 25環(huán) : 94 5 94 45s 45s 72 45s (從第 2 步開始循環(huán) 30 ) 72 7 4 12h 束后置于冰上開始電泳 凝膠電泳 加樣 ： 樣本孔：上樣緩沖液 6 物 10物 =1:5） ， ：取 果 宮內(nèi)膜細胞鑒定 用組織塊培養(yǎng)法聯(lián)合差速離心法對子宮內(nèi)膜基質(zhì)細胞及腺上皮細胞的分離蘭州大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文 善子宮內(nèi)膜狀況的臨床及機理研究 21 成功率均達 90%以上，子宮內(nèi)膜基質(zhì)細胞呈長梭形，腺上皮細胞形態(tài)較不規(guī)則，呈短梭形，蝌蚪狀、類圓形等。 見圖 7、 8。 圖 7 分離后的子宮內(nèi)膜基質(zhì)細胞 形態(tài) (倒置顯微鏡下 40 ) 圖 8 分離后的子宮內(nèi)膜腺上皮細胞 (倒置顯微鏡下 40 ) 蘭州大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文 善子宮內(nèi)膜狀況的臨床及機理研究 22 用免疫組化法對子宮內(nèi)膜基質(zhì)細胞和腺上皮細胞進行鑒定，基質(zhì)細胞對波形蛋白抗體呈陽性反應(yīng)，可見胞漿中棕黃色顆粒；腺上皮細胞對角蛋白抗體呈陽性反應(yīng)，胞漿顯示棕黃色。 見圖 9、 10。 圖 9 波形蛋白抗體對 子宮 內(nèi)膜基質(zhì)細胞的鑒定 圖 10 角蛋白抗體對 子宮內(nèi)膜 腺上皮 細胞的鑒定 宮內(nèi)膜細胞增殖 基質(zhì)細胞 如表 9、 10、 11、圖 11 所示 ， 基質(zhì)細胞在 004胞存活率無顯著性差異，體外培養(yǎng) 72h 時，細胞存活率下降，且與 度呈負相關(guān) 。 蘭州大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文 善子宮內(nèi)膜狀況的臨床及機理研究 23 表 9 加藥后 24 h 子宮內(nèi)膜 基質(zhì) 細胞 組別 pg/ 0 00 00 00 000 10 加藥后 48 h 子宮內(nèi)膜基質(zhì)細胞 組別 pg/ 0 00 00 500 1000 與對照組相比較 *P 11 加藥后 72 h 子宮內(nèi)膜基質(zhì)細胞 組別 pg/ 0 00 200 500 1000 與對照組相比較 *P州大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文 善子宮內(nèi)膜狀況的臨床及機理研究 24 圖 11 同濃度及 作用 時間 的 子宮 內(nèi)膜基質(zhì)細胞 增殖水平圖 腺上皮細胞 如表 12、 13、 14， 圖 12 所示 ， 腺上皮細胞在 00pg/8h，細胞存活率最高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（ P 表 12 加藥后 24 h 子