【畢業(yè)學(xué)位論文】（Word原稿）豬帶絳蟲(chóng)六鉤蚴45W-4B和TSO18重組基因工程疫苗的研究預(yù)防獸醫(yī)學(xué)博士論文

密級(jí) 論文編號(hào) 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 博士學(xué)位論文 豬帶絳蟲(chóng)六鉤蚴 45 組基因工程疫苗的研究 of on 5of of of 5 豬帶絳蟲(chóng)六鉤蚴 45 組基因工程疫苗的研究 摘要 囊蟲(chóng)?。?由豬 帶絳蟲(chóng)（ 幼蟲(chóng)豬囊尾蚴寄生于人或豬等中間宿主而引起的人畜共患寄生蟲(chóng)病，在中國(guó)大部分地區(qū)尤其在少數(shù)民族地區(qū)是一個(gè)重要的公共衛(wèi)生問(wèn)題，對(duì)人的健康危害很大。不僅如此，囊蟲(chóng)病的廣泛存在還造成畜牧業(yè)的重大經(jīng)濟(jì)損失，極大影響了我國(guó)畜產(chǎn)品在國(guó)際市場(chǎng)上的競(jìng)爭(zhēng)力，因而是公認(rèn)的社會(huì)經(jīng)濟(jì)病之一。豬囊尾蚴病的免疫預(yù)防之所以一直困擾著獸醫(yī)工作者，主要原因是抗原來(lái)源非常有限。羊絳蟲(chóng) 45W 重組基因工程疫苗的研制成功，為豬囊尾蚴重組基因工程疫苗的研制提供了典范。為了探索豬帶絳蟲(chóng) 45 組抗原對(duì) 豬囊尾蚴感染的免疫保護(hù)效果，獲得具有良好免疫保護(hù)作用的重組抗原，用做豬囊蟲(chóng)病的免疫預(yù)防，我們進(jìn)行了本項(xiàng)研究。 收集成熟的豬帶絳蟲(chóng)蟲(chóng)卵，經(jīng)孵化和激活后，提取六鉤蚴總 設(shè)計(jì)特異性引物增 45 因，測(cè)序證實(shí)擴(kuò)增產(chǎn)物與國(guó)外克隆的豬帶絳蟲(chóng) 45同源性分別為 說(shuō)明 45不同蟲(chóng)株間相對(duì)保守。用蛋白質(zhì)專家系統(tǒng)對(duì) 5行結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)它們都有分泌信號(hào)序列、 酸化位點(diǎn)。根據(jù)預(yù)測(cè)結(jié) 果 增 截 去 45因的 N 端信號(hào)肽和 得 45 5制性內(nèi)切酶處理 后與相同處理的表達(dá)載體 化 切及 測(cè)序證明閱讀框完全正確，用 物進(jìn)行 現(xiàn)在合適的誘導(dǎo)溫度和 度下，分別獲得了高效表達(dá)且以可溶性形式存在的 45是人囊蟲(chóng)陽(yáng)性血清均可被兩種重組蛋白所識(shí)別。 分別用純化的 45 206 為佐劑制成疫苗免疫豬，用 25000枚豬帶絳蟲(chóng)蟲(chóng)卵攻擊感染， 時(shí)用 分析免疫和感染后豬外周血淋巴細(xì)胞增殖情況。結(jié)果表明，免疫后15感染后 30至少在免疫后 90免疫后外周血淋巴細(xì)胞略有增殖，而在感染后 1021染后 90數(shù)各組的 囊尾蚴感染數(shù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn) 55%和 94%，與豬囊尾蚴粗抗原免疫組（減蟲(chóng)率為 92%） 的保護(hù)效果相當(dāng)。而 疫組的減蟲(chóng)率為 完全保護(hù)率達(dá) 80%，保護(hù)效果明顯優(yōu)于粗抗原對(duì)照組。 在補(bǔ)體參與下， 5鉤蚴的存活率分別從 90%和 85%下降到 55%和 70%。 P= 此推測(cè) 免疫應(yīng)答過(guò)程中作用可能較小。用5W 不等， 在所有的樣品中 顯示為次要的亞型，如果忽略質(zhì)粒本身的作用，上述結(jié)果仍然能夠很好的重復(fù)（ et 995） 。早期研究表明 ， 此推斷45本研究所做的補(bǔ)體依賴實(shí)驗(yàn)也證明，在補(bǔ)體參與下， P=而 45體無(wú)論是否存在補(bǔ)體，其對(duì)六鉤蚴的殺傷作用差異不大。這一結(jié)果似乎也證明， 45要中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士學(xué)位論文 第五章 重組抗原的免疫機(jī)理和保護(hù)性研究 69 補(bǔ)體參與。 清抗體增長(zhǎng)曲線分析 豬第一次免疫后 15倍以上，二免以 后 20加強(qiáng)免疫外，另一個(gè)原因是攻擊感染所致。因?yàn)楣ハx(chóng)后 14d 血清中已出現(xiàn)六鉤蚴抗體。（ 1996）研究認(rèn)為豬帶絳蟲(chóng)中絳期抗原含有與成蟲(chóng)和六鉤蚴階段抗血清交叉反應(yīng)的表位，而六鉤蚴卻含有大量階段特異性抗體。 血清中的六鉤蚴特異性抗體在感染后一個(gè)月即可檢測(cè)到，而囊尾蚴階段的抗體到感染后第 3政用豬囊尾蚴勻漿抗原配以佐劑對(duì)豬免疫兩次，用妊娠節(jié)片攻擊，總保 護(hù)率達(dá) 100%，接種 105% 48d 抗體滴度達(dá)到峰值，并可維持 164們所得的結(jié)果與上述結(jié)果基本一致，抗體水平在免疫后 1545且可保持抗體陽(yáng)性達(dá) 4個(gè)月左右。但本實(shí)驗(yàn)我們?cè)诟腥竞笠粋€(gè)月開(kāi)始用粗制囊尾蚴抗原檢測(cè)抗體，抗體水平均表現(xiàn)低水平，三個(gè)月時(shí)的 體負(fù)荷與囊尾蚴抗體之間無(wú)相關(guān)性，即豬體的囊尾蚴數(shù)量多而囊尾蚴抗體卻不高。原因之一可能是囊尾蚴抗體在感染 3性較低，檢測(cè)循環(huán)抗原的方法相對(duì)比較敏感，理論上可檢測(cè)出一個(gè)或幾個(gè)蟲(chóng)體。另一原因可能是只有感染的囊尾蚴達(dá)到一定數(shù)量，抗體水平與囊尾蚴數(shù)才存在一定的相關(guān)性。 2003）以 103、104、 105劑量的豬帶絳蟲(chóng)蟲(chóng)卵分別感染三組小豬，用單抗檢測(cè)血清中的循環(huán)抗體，發(fā)現(xiàn)在感染后 2有活囊蟲(chóng)的豬僅在短期內(nèi)可檢測(cè)到，當(dāng)囊尾蚴鈣化后 此我們認(rèn)為本研究囊尾蚴抗體的水平普遍較低，可能與 蟲(chóng)體寄生數(shù)量太少和蟲(chóng)體的發(fā)育程度不同以及檢測(cè)方法的敏感性都有關(guān)系。 照組免疫結(jié)果分析 啟動(dòng)子，與日本血吸蟲(chóng)的 谷胱甘肽 合的可用乳糖類似物誘導(dǎo)的高水平表達(dá)載體。 1999）研究了豬帶絳蟲(chóng)谷胱甘肽 S 轉(zhuǎn)移酶，發(fā)現(xiàn)其活性與哺乳動(dòng)物 近，分子量為 26且 白存在于豬囊尾蚴的體壁、實(shí)質(zhì)組織（ 原腎管（ 外皮的神經(jīng)細(xì)胞體中，用豬帶絳蟲(chóng) 疫小鼠可降低中絳期蟲(chóng)體負(fù)荷達(dá) 析顯示豬帶絳蟲(chóng) 帶絳蟲(chóng)、鼠巨頸絳蟲(chóng)等發(fā)生交叉反應(yīng)，而與曼氏血吸蟲(chóng)、鼠、兔以及豬肝組織的 明血吸蟲(chóng) 蟲(chóng)發(fā)生交叉反應(yīng)，而與豬帶絳蟲(chóng)和哺乳動(dòng)物組織中的 以 刺激宿主產(chǎn)生很高的抗體滴度，但該抗體不能識(shí)別豬帶絳蟲(chóng)的 而對(duì)豬帶絳蟲(chóng)感染沒(méi)有保護(hù)性，所以 于該組的蟲(chóng)體數(shù)高于未免疫對(duì)照組，可能主要是這兩組豬屬于不同的來(lái)源，存在年齡、遺傳背景和個(gè)體方面的差異造成的。 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士學(xué)位論文 第五章 重組抗原的免疫機(jī)理和保護(hù)性研究 70 組抗原的免疫保護(hù)性分析 從剖檢結(jié)果可以看出，重組抗原免疫組的減蟲(chóng)率都在 67%以上，而無(wú)論是 45獨(dú)免疫的減蟲(chóng)率都在 94%，與粗制抗原免疫組的減蟲(chóng)率相當(dāng)。而且 4保護(hù)率也達(dá)到 80%。說(shuō)明 45它幾組減蟲(chóng)率降低，主要原因可能與補(bǔ)充免疫豬的蟲(chóng)體負(fù)荷普遍都偏高有關(guān)。而且未免疫對(duì)照組的感染率不高，也是導(dǎo)致減蟲(chóng)率低的主要原因。本實(shí)驗(yàn)加有 粒的免疫組，除 4疫組外未出現(xiàn)預(yù)期的免疫增強(qiáng)作用， 有些組反而減蟲(chóng)率有所降低。一是可能基因免疫受很多因素的影響，如質(zhì)粒的純度、免疫的方式及所用的佐劑等；二是豬個(gè)體之間的差異所致，因?yàn)榧词雇幻庖呓M豬的蟲(chóng)體負(fù)荷可以從零到幾十不等；但最重要的原因可能是補(bǔ)充免疫豬在各組中的分布不平衡造成的。從各組蟲(chóng)體計(jì)數(shù)的結(jié)果可以看出，在和 33，而減蟲(chóng)率為 95%和 89%。而在4和 50，兩組的減蟲(chóng)率分別為 94%和 83%。所以這兩組的減蟲(chóng)率較未加 而其免疫水平最好，保護(hù)率也最高。 （ 2003）用合成的三肽（ 疫豬，發(fā)現(xiàn)外周血單核細(xì)胞合成的 細(xì)胞因子（ 劇增加，并且導(dǎo)致感染早期嚴(yán)重的局部炎癥反應(yīng)。說(shuō)明該疫苗的保護(hù)效果是以細(xì)胞免疫為主。 張唯哲 等（ 1997） 應(yīng)用四甲基偶氮唑鹽（ 檢測(cè)了 31例未經(jīng)治療的囊蟲(chóng)病患者外周血單個(gè)核細(xì)胞 （ 產(chǎn)生 平，同時(shí)用 30 例健康人作對(duì)照。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，囊蟲(chóng)病 患者 平明顯低于正常人（ P而患者血清中 平明顯高于正常人（ P本實(shí)驗(yàn)提示囊蟲(chóng)病患者外周血中低水平的 能與患者細(xì)胞免疫功能低下有關(guān) ，說(shuō)明囊蟲(chóng)病患者產(chǎn)生的免疫應(yīng)答以體液免疫為主 。 （ 2003）研究了小鼠接種豬帶絳蟲(chóng)中絳期抗原后 取免疫和對(duì)照鼠的脾細(xì)胞 現(xiàn)中絳期抗原能誘導(dǎo) 時(shí)能誘導(dǎo)產(chǎn)生嗜酸性細(xì)胞和特異性 其 是 內(nèi)產(chǎn)生的免疫應(yīng)答和體外細(xì)胞因子的產(chǎn)生具有很好的相關(guān)性，說(shuō)明中絳期抗原誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答系 合性，但以體液免疫為主。從我們的結(jié)果分析，第一次免疫后淋巴細(xì)胞的增殖不太明顯，加強(qiáng)免疫后才出現(xiàn)明顯增殖。而攻擊感染后淋巴細(xì)胞增殖非常明顯，說(shuō)明初期階段重組抗原所致的免疫應(yīng)答以細(xì)胞免疫為主。而感染時(shí)的抗體水平統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，抗體水平的高低與最后的減蟲(chóng)率密切相關(guān)。再者免疫血清對(duì)六鉤蚴的殺傷是補(bǔ)體介導(dǎo)的抗體作用，至少說(shuō)明抗體在保護(hù)宿主免受感染方面起重要作用。一些研究也認(rèn)為，囊尾蚴感染早期的宿主 免疫應(yīng)答以體液免疫為主，而感染后期細(xì)胞免疫才被啟動(dòng)。 盡管入侵的幼蟲(chóng)能被免疫血清和補(bǔ)體殺死，但包囊階段的免疫卻依賴于細(xì)胞免疫。 所以要搞清兩種抗原到底是以細(xì)胞免疫還是以體液免疫為主，需要檢測(cè)外周血淋巴細(xì)胞在抗原刺激下，表達(dá)細(xì)胞因子的類型。或鑒定出免疫血清中的 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士學(xué)位論文 第五章 重組抗原的免疫機(jī)理和保護(hù)性研究 71 從本實(shí)驗(yàn)可以看出，影響豬囊尾蚴基因工程疫苗免疫效果的因素很多，往往導(dǎo)致出現(xiàn)意想不到的結(jié)果。本實(shí)驗(yàn)兩種重組抗原單獨(dú)免疫的減蟲(chóng)率都較高，與粗抗原免疫組相當(dāng)。而添加 。其原因可能是： 1. 感染時(shí)蟲(chóng)卵的活力，因?yàn)樨i帶絳蟲(chóng)的蟲(chóng)卵只能通過(guò)顯微鏡檢查才能對(duì)其活力進(jìn)行定性分析，而不可能像病毒和細(xì)菌一樣進(jìn)行定量測(cè)定，只能通過(guò)感染動(dòng)物剖檢囊尾蚴的數(shù)目才能真正知道蟲(chóng)卵的感染力； 口服含一定蟲(chóng)卵的生理鹽水溶液 ,不能保證豬在吞咽的時(shí)蟲(chóng)卵完全進(jìn)入豬胃內(nèi)，使感染的蟲(chóng)卵數(shù)產(chǎn)生誤差，導(dǎo)致個(gè)體間的蟲(chóng)體負(fù)荷差異較大； 疫苗免疫后抗體水平達(dá)到峰值時(shí)進(jìn)行攻擊感染，此時(shí)獲得的保護(hù)性應(yīng)當(dāng)是最好的。 然而由于豬帶絳蟲(chóng)蟲(chóng)卵獲得比較困難，而且保存時(shí)間不能過(guò)長(zhǎng)。所 以抗體達(dá)到峰值需要感染的時(shí)候往往不能及時(shí)獲得蟲(chóng)卵。而在免疫工作尚未做好，抗體水平尚未完全升高時(shí)，又獲得蟲(chóng)卵需要盡快感染，往往使研究處在事與愿違的尷尬境地；本實(shí)驗(yàn)盡管按正常的免疫程序設(shè)計(jì)，即在加強(qiáng)免疫后 3由于蟲(chóng)卵提前獲得，所以攻擊感染在二免后 7d 進(jìn)行，此時(shí)二免時(shí)補(bǔ)充的豬抗體水平還很低，所以導(dǎo)致這些豬的蟲(chóng)體負(fù)荷偏高。 于不同的個(gè)體具有不同的遺傳背景、不同的性別、不同的健康狀態(tài)，導(dǎo)致同一組不同個(gè)體間蟲(chóng)體負(fù)荷差異較大，即使對(duì)照組也會(huì)出現(xiàn)幾個(gè)到幾百的 蟲(chóng)體差異。 且完成需要很長(zhǎng)時(shí)間，當(dāng)結(jié)果不太理想時(shí)進(jìn)行多次重復(fù)不太現(xiàn)實(shí)。因?yàn)樨i囊蟲(chóng)感染后至少要在 70d 后才能知道免疫的效果，如果要進(jìn)行幾批實(shí)驗(yàn)，而且每次都按正常的免疫程序進(jìn)行，一次動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的時(shí)間幾乎在半年左右，所以一年內(nèi)只能重復(fù)一次。 生物應(yīng)有所區(qū)別。微生物免疫保護(hù)的效果是以動(dòng)物是否發(fā)病為標(biāo)準(zhǔn)，即使它有一定量的微生物感染，但并不表現(xiàn)臨床癥狀，則視為具有免疫保護(hù)性。而寄生蟲(chóng)疫苗盡管獲得了 99%的減蟲(chóng)率，但畢竟還有 1%的蟲(chóng)體感染，所以按照現(xiàn)有 的標(biāo)準(zhǔn)，仍然視為保護(hù)性為零。目前一些學(xué)者已經(jīng)建議將減蟲(chóng)率等同于保護(hù)率，使寄生蟲(chóng)疫苗的質(zhì)量判定更加標(biāo)準(zhǔn)化、更加客觀。 本實(shí)驗(yàn)的免疫豬雖然完全保護(hù)率低，但仍然可作為疫苗抗原應(yīng)用。因?yàn)榧词挂呙绲臏p蟲(chóng)率在 50%，免疫接種后也會(huì)大大降低囊尾蚴發(fā)育成絳蟲(chóng)的數(shù)量，從而降低豬囊尾蚴病的流行。在新西蘭羊囊尾蚴的自然感染率在 13%，田間實(shí)驗(yàn)接種羊 45低到 感染率降低了 83%。 根據(jù)巨頸絳蟲(chóng)蛋白序列合成三種多肽疫苗 p，三種多肽已在小鼠 證明能誘導(dǎo)保護(hù)同源攻擊感染，且被證明能作為疫苗抵抗豬帶絳蟲(chóng)，降低蟲(chóng)體負(fù)荷達(dá) 50%。為進(jìn)一步驗(yàn)證該多肽疫苗的田間免疫效果，免疫豬 120頭，另設(shè)未免疫豬 120 頭（該地區(qū)豬囊蟲(chóng)的自然感染率為 14%）作為對(duì)照， 10月后剖檢， 120 頭免疫豬共檢出 1369 個(gè)囊蟲(chóng)，而 120 頭對(duì)照豬共檢出 66565 個(gè)囊蟲(chóng)，免疫后囊蟲(chóng)的總數(shù)減少了 降低囊蟲(chóng)流行 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士學(xué)位論文 第六章 重組蛋白的穩(wěn)定性分析 72 第六章 重組蛋白的穩(wěn)定性分析 摘要： 重組蛋白的穩(wěn)定性對(duì)于一種疫苗抗原而言是非常重要的，即使抗原的免疫保護(hù)效果再好，如果不能貯存一定的時(shí)間或經(jīng)過(guò)一定時(shí)間大部分 已降解，那應(yīng)用起來(lái)也是很不方便。45然都是經(jīng)大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)并純化得到的，但由于二者間系不同的蛋白分子，而且也經(jīng)過(guò)了不同的修飾，因此這兩種表達(dá)產(chǎn)物的活性和穩(wěn)定性可能存在一定差異。將純化重組蛋白 5 放置 90d，然后免疫家豬，測(cè)定不同時(shí)間抗體的增長(zhǎng)動(dòng)態(tài)，并在二免后 4570計(jì)算各組的減蟲(chóng)率，比較重組抗原減蟲(chóng)率的變化。分別取保存后 1 個(gè)月、 2個(gè)月的重組蛋白進(jìn)行 蛋白濃度測(cè)定，分析 重組蛋白的穩(wěn)定性。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明， 45疫組的減蟲(chóng)率達(dá)到 97%，完全保護(hù)率為 60%，免疫保護(hù)效果基本沒(méi)有發(fā)生變化。而 疫組的減蟲(chóng)率從保存前的 95%下降到 降低了 蛋白濃度和析結(jié)果表明 原很不穩(wěn)定，保存 2 個(gè)月后 2/3 已降解，所以 組蛋白最好在 15重組 45少可以在 4 保存 3 個(gè)月以上。 關(guān)鍵詞 ： 45蟲(chóng)率；含量檢測(cè)；保存期 1 材料和方法 劑和動(dòng)物 劑 脫氧膽酸鈉（ 、十二烷基肌氨酸鈉（ 溶菌酶、尿素購(gòu)自上海生工生物工程公司、 06佐劑、豬囊尾蚴粗制抗原、豬囊蟲(chóng)陽(yáng)性血清、胰酶、鹽酸胍、鄰苯二氨（ 由本實(shí)驗(yàn)室保存。 囊尾蚴檢測(cè)試劑盒由本室研制。 液的配制 10 l( 1 :5050油， 硫蘇糖醇。 10 2710118于 950 加水至 1000 10胱甘肽洗脫緩沖液： 原性谷胱苷肽溶解于 50脫緩沖液 50 高 低 酸鈉 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士學(xué)位論文 第六章 重組蛋白的穩(wěn)定性分析 73 包被液（ 蒸餾水至 1000 4 保存。 底物溶液（ ：磷酸鹽檸檬酸緩沖液 100苯二胺（ 4030%鮮配制。 洗滌液（ ： 8g 2溶于 950 水至 100020。 磷酸鹽檸檬酸緩沖液（ )檬酸（ ） 餾水 50 終止液（ 22濃硫酸 餾水 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 18頭 10按常規(guī)的飼養(yǎng)和管理方式進(jìn)行飼喂。 驗(yàn)方法 組抗原的免疫保護(hù)實(shí)驗(yàn) 組抗原的制 備及純化 按第五章 苗的制備及免疫 將重組抗原置于 4 冰箱 3 個(gè)月后，分別與 206 佐劑乳化制成疫苗。實(shí)驗(yàn)豬隨機(jī)分成 3組： 45疫組、未免疫感染對(duì)照組，每組 6 頭。每頭豬于頸部肌肉注射 300 15免疫感染對(duì)照組不做任何免疫。 驗(yàn)動(dòng)物的攻擊感染 剪取豬帶絳蟲(chóng)的新鮮成熟節(jié)片，生理鹽水沖洗數(shù)次后，置平皿中用眼科剪刀剪碎節(jié)片，并擠壓使蟲(chóng)卵完全釋放出來(lái)，用顯微鏡觀察蟲(chóng)卵的活力，計(jì)數(shù)結(jié)構(gòu)完整 和形態(tài)清楚的蟲(chóng)卵，然后計(jì)算每毫升中所含的蟲(chóng)卵數(shù)，用生理鹽水將蟲(chóng)卵稀釋至 10000 枚 /第二次免疫后45d，用注射器吸取 卵液，撬開(kāi)豬嘴，將注射器伸進(jìn)豬口腔內(nèi)，輕輕將蟲(chóng)卵液注入豬舌根部，待豬將蟲(chóng)卵液吞入胃內(nèi)，大約半小時(shí)后再進(jìn)行飲水或飼喂。 驗(yàn)豬血清抗體的檢測(cè) 分別在免疫前和免疫后每隔 15d，在前腔靜脈叢采血 37 溫箱 1 4放置幾小時(shí)， 3500r/10心分離血清。將 純化的 45 原，用包被液（ 稀釋 至 50 g/孔加入 100 所述中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士學(xué)位論文 第六章 重組蛋白的穩(wěn)定性分析 74 方法進(jìn)行間接 苗的免疫保護(hù)性分析 三組實(shí)驗(yàn)豬于感染蟲(chóng)卵 70d 后采血剖殺，仔細(xì)檢查豬體全身的囊尾蚴感染情況，并分別計(jì)數(shù)干酪樣和水泡樣蟲(chóng)體，以及每頭豬總的囊尾蚴感染數(shù)。與對(duì)照組的蟲(chóng)體進(jìn)行比較，計(jì)算各免疫組的減蟲(chóng)率，評(píng)價(jià)兩種抗原保存 3個(gè)月后的免疫效果。 組抗原穩(wěn)定性的定性定量分析 將通過(guò) 純化的 45溶性蛋白和用 純化的 涵體蛋白進(jìn)行酸、 蛋白檢測(cè)儀分別測(cè)定 算其含量后放在 4 冰箱。分別在 1個(gè)月和 2個(gè)月后吸取少量進(jìn)行 蛋白的濃度變化進(jìn)行定性分析。并用核酸、蛋白檢測(cè)儀測(cè)定其含量，比較分析純化蛋白在 4 的穩(wěn)定性。 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士學(xué)位論文 第六章 重組蛋白的穩(wěn)定性分析 75 2 結(jié)果 組蛋白的免疫實(shí)驗(yàn) 體水平的動(dòng)態(tài)檢測(cè) 45疫組在一免后 15強(qiáng)免疫后抗體水平急劇升高。在二免后 21d 疫組的抗體水平達(dá)到峰值。而 45疫組抗體繼續(xù)升高 ,在攻擊感 染前達(dá)到最高。 5攻擊感染時(shí)抗體水平僅為 4擊感染后兩組的抗體水平均呈現(xiàn)不同幅度的降低。未免疫對(duì)照組的抗體水平在攻擊感染后 15后即緩慢下降。 注 ： 1 為第一次免疫時(shí)的血清抗體水平； 2為第二次免疫時(shí)的血清抗體； 4 為攻擊感染時(shí)的抗體水平； 物保護(hù)實(shí)驗(yàn) 剖檢結(jié)果表明 ， 疫組的減蟲(chóng)率較第六章的結(jié)果明顯降低，減蟲(chóng)率從 95%就其原因可能是 存 3 個(gè)月后蛋白降解，免疫保護(hù)性降低所致。 45疫組的減蟲(chóng)率和完全保護(hù)率分別從 94%和 20%升高到 97%和 60%。說(shuō)明保存 3個(gè)月后 45表 2. 重組抗原保存 3 個(gè)月后免疫豬囊尾蚴的剖檢結(jié)果 組別 水泡樣蟲(chóng)體 蟲(chóng)體總數(shù) 蟲(chóng)體平均數(shù) 減蟲(chóng)率 (%) 保護(hù)率 (%) 疫組 46,47,30,29,52,59 263 45疫組 0,0,5,0,7 12 0 未免疫感染組 135,77,57,46 315 0 圖1 . 3 4 5 6采血時(shí)間（次） O 1 8 免疫組45 第六章 重組蛋白的穩(wěn)定性分析 76 的免疫活性基本沒(méi)有發(fā)生變化，略有升高可能與此次 實(shí)驗(yàn)的攻蟲(chóng)時(shí)間是在二次免疫后 45時(shí) 4而對(duì)攻擊感染可產(chǎn)生較好的抵抗力。而 5以它們兩者的減蟲(chóng)率差異較大。與前面的結(jié)果比較可以發(fā)現(xiàn)， 放置 3個(gè)月后免疫活性大大降低，而 45本保持了純化時(shí)的免疫活性。 組蛋白穩(wěn)定性的定量分析 通過(guò) 純化的 45組蛋白 4 放置 1 個(gè)月后， 示蛋白條帶無(wú)明顯變化，含量測(cè)定結(jié)果與保存前基本相同 ，都保持在 月后含量略微下降，但保持在 明 45較穩(wěn)定 ,可以在 4 保存 3 個(gè)月以上。而純化的 放置 1 個(gè)月后， 白條帶已明顯減弱，至 兩個(gè)月后蛋白濃度僅為 2.0 mg/明 白很不穩(wěn)定，必須在純化后 15 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士學(xué)位論文 第六章 重組蛋白的穩(wěn)定性分析 77 3 討論 一般來(lái)說(shuō)，真核基因在原核系統(tǒng)中表達(dá)量的影響因素很多，諸如不同的載體系統(tǒng)、菌種、誘導(dǎo)表達(dá)條件，以及目的基因本 身的堿基組成等。而且真核基因的在大腸桿菌中的表達(dá)產(chǎn)物容易受到宿主菌蛋白酶的水解，所以一般在蛋白表達(dá)和純化時(shí)應(yīng)加入一定量的蛋白酶抑制劑如 防止產(chǎn)物的降解?；蛘哌x擇蛋白酶缺失的宿主菌表達(dá)外源蛋白，甚至對(duì)基因序列進(jìn)行修飾，截去影響其穩(wěn)定性的部分。 我們通過(guò) 于未用蛋白酶抑制劑處理，所以 4 保存3個(gè)月后，與第一次免疫實(shí)驗(yàn)相比，減蟲(chóng)率降低了 51%。推測(cè)可能是重組蛋白發(fā)生了部分降解。 蛋白含量測(cè)定進(jìn)一步表明，該蛋白在 4 保存僅 1 個(gè)月， 蛋白就發(fā)生 降解，兩個(gè)月后的濃度已經(jīng)降低至不到原來(lái)的 1/3，說(shuō)明該蛋白的免疫保護(hù)性的降低是由于蛋白不穩(wěn)定造成的。而 45存 3 個(gè)月后的免疫保護(hù)性基本不變，減蟲(chóng)率和完全保護(hù)率均有所提高，兩次實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示較好的重復(fù)性。含量檢測(cè)顯示，放置 2 個(gè)月后 45從另一方面也驗(yàn)證了重組蛋白保存一定時(shí)期后，其保護(hù)性的高低還與該蛋白的穩(wěn)定性密切相關(guān)。盡管 疫組的抗體水平在二次免疫后出現(xiàn)了與 45在二免后三周迅速降低，到感染前僅為 45體水平的一半。此時(shí)的抗體 水平可能不足以抵抗豬帶絳蟲(chóng)的攻擊感染，導(dǎo)致感染率的升高。同時(shí)本次實(shí)驗(yàn)免疫豬出現(xiàn)了較多的干酪樣蟲(chóng)體，而且以肝臟和肌肉中多見(jiàn)。這在前面的免疫實(shí)驗(yàn)中所沒(méi)有或很少見(jiàn)的，其原因是否與感染的時(shí)間以及剖檢時(shí)蟲(chóng)體的發(fā)育程度有關(guān)尚需近一步研究。 羊全長(zhǎng) 45W 重組基因工程疫苗問(wèn)世，極大地鼓舞了人們用其它 45W 基因研制豬囊尾蚴疫苗的熱情。但羊 45大腸桿菌中表達(dá)的產(chǎn)物很不穩(wěn)定，大多以降解形式存在，因而大大影響了疫苗的實(shí)際應(yīng)用，不能滿足疫苗商業(yè)化發(fā)展的需要。而很多證據(jù)已證明， 穩(wěn)定性影響很大。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析發(fā)現(xiàn)羊 45W 和豬帶絳蟲(chóng) 端都有 17 個(gè)氨基酸的分泌信號(hào)序列。 996)等研究認(rèn)為當(dāng)羊絳蟲(chóng) 45W 基因缺失 7個(gè)氨基酸時(shí)，表達(dá)蛋白的穩(wěn)定性大大增加， 組抗原在 2以穩(wěn)定保存 18 個(gè)月。本實(shí)驗(yàn)將豬 45 端 17 個(gè)氨基酸的信號(hào)肽序列截去后， 4合蛋白的穩(wěn)定性大大提高，保存 3個(gè)月的免疫保護(hù)性仍然達(dá) 含量檢測(cè)顯示， 4 4 可穩(wěn)定保存 3 個(gè)月以上。所以推測(cè) 白 N 端的 17 個(gè)氨基酸的信號(hào) 肽序列對(duì) 合蛋白的穩(wěn)定性也會(huì)有影響。下一步應(yīng)對(duì) 因進(jìn)行修飾，截去其 N 端的信號(hào)肽序列，以提高該重組蛋白的穩(wěn)定性，獲得表達(dá)量高、穩(wěn)定性好和免疫原性良好的重組蛋白。另一方面，純化蛋白時(shí)加入蛋白酶抑制劑 抑制蛋白酶活性或選擇蛋白酶缺失菌株作為宿主菌 可能也是解決 解的有效途徑。當(dāng)然用真核表達(dá)系統(tǒng)如酵母進(jìn)行該基因的表達(dá)，不僅可以克服蛋白降解的問(wèn)題，而且還能對(duì) 外源蛋白進(jìn)行翻譯后的加工和修飾，獲得免疫保護(hù)性更好的重組蛋白。 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士學(xué)位論文 第七章 結(jié)論 78 第七章 結(jié)論 1. 在國(guó)內(nèi)首次成功克隆了 因，同源性比較表明 在不同地方株間比較保守。 2. 對(duì) 二者 7 個(gè)氨基酸的分泌信號(hào)肽， 9其它已知的宿主保護(hù)性六鉤蚴抗原具有相似的結(jié)構(gòu)特征。 45高度疏水的跨膜螺旋區(qū) 和大量 磷酸化、糖基化位點(diǎn)； 白有 1個(gè)糖基化和 4 個(gè)磷酸化位點(diǎn)，二者均定位于細(xì)胞外。由此推測(cè) 45能為六鉤蚴階段分泌的糖蛋白，并且可能具有酶的活性。 3. 在大腸桿 菌中成功表達(dá)了具有免疫活性的 5 45主要以可溶性形式高效表達(dá) ,這種差異主要由重組蛋白的氨基酸組成所決定。 45明人囊蟲(chóng)血清中含有高滴度六鉤蚴 抗體。 4. 初步揭示了重組抗原 5明感染前的抗體水平與重組抗原的減蟲(chóng)率密切相關(guān)，而囊尾蚴抗體水平與囊尾蚴蟲(chóng)體負(fù)荷間無(wú)相關(guān)性。重組抗原的免疫保護(hù)作用是細(xì)胞免疫和體液免疫共同作用的結(jié)果。 5. 國(guó)內(nèi)外首次體外實(shí) 驗(yàn)證明，在補(bǔ)體參與下， 45體對(duì)六鉤蚴的殺傷作用均有所增強(qiáng)，但在補(bǔ)體介導(dǎo)下 P=。說(shuō)明 傷六鉤蚴依賴補(bǔ)體的參與，由此推測(cè) 苗的免疫效果可能優(yōu)于45 6. 在豬體確證了 45組疫苗良好的免疫保護(hù)效果，其減蟲(chóng)率分別達(dá) 95%和94%，與囊尾蚴粗制抗原的免疫效果（減蟲(chóng)率為 92%） 相當(dāng)，而 80%，免疫效果優(yōu)于囊尾蚴粗 制抗原免疫組，這一結(jié)果為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)商品化 5 7. 通過(guò)豬體實(shí)驗(yàn)和含量檢測(cè)，確定了重組抗原 45 4 的 保存期，證明了N 端信號(hào)肽序列對(duì)重組蛋白的穩(wěn)定性影響很大，截去 N 端信號(hào)肽序列，或在真核系統(tǒng)中進(jìn)行表達(dá)將會(huì)大大提高 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士學(xué)位論文 第八章 文獻(xiàn)綜述：絳蟲(chóng)蚴感染后宿主免疫應(yīng)答的研究 79 第八章 文獻(xiàn)綜述 絳蟲(chóng)蚴感染后宿主免疫應(yīng)答的研究 絳蟲(chóng)蚴病是指由帶科絳蟲(chóng)的中絳期寄生于中間宿主體內(nèi)所引起的寄生蟲(chóng)病，對(duì)家畜和人危害最大最常見(jiàn)的主要有豬囊尾蚴病和棘球蚴病。絳蟲(chóng)蚴作為一種復(fù)雜的病原體 ，不僅抗原成分復(fù)雜，而且 不同發(fā)育階段的抗原組份不盡相同，所以不同的發(fā)育階段，即使同一階段的不同感染時(shí)期所引起的免疫反應(yīng)的程度和類型也不完全相同。一般而言， 寄生蟲(chóng)引起的免疫反應(yīng)與細(xì)菌、病毒引起的免疫反應(yīng)，無(wú)論程度和持續(xù)時(shí)間，前者都不及后者。寄生蟲(chóng)免疫通常表現(xiàn)為不完全免疫，血清中產(chǎn)生的免疫球蛋白與免疫保護(hù)不成比例關(guān)系。寄生蟲(chóng)若在某一宿主體內(nèi)發(fā)育至成蟲(chóng)，以后則能在宿主體內(nèi)長(zhǎng)期生存下去。盡管宿主能識(shí)別蟲(chóng)體并產(chǎn)生免疫反應(yīng)，但并不能將其完全殺滅或驅(qū)除出去。絳蟲(chóng)從感染性蟲(chóng)卵或幼蟲(chóng)進(jìn)入宿主體內(nèi)，到最終發(fā)育至中絳期（囊尾蚴或 棘球蚴），只是形態(tài)、大小和結(jié)構(gòu)上的變化，而不象細(xì)菌和病毒可在動(dòng)物體內(nèi)大量繁殖或復(fù)制。因此研究蟲(chóng)卵或六鉤蚴進(jìn)入中間宿主體內(nèi)后，宿主免疫系統(tǒng)將發(fā)生怎樣的反應(yīng)來(lái)應(yīng)對(duì)外源物質(zhì)的入侵，而蟲(chóng)體從六鉤蚴到囊尾蚴的不同發(fā)育階段又以什么方式降低自身的抗原性而不與宿主發(fā)生免疫反應(yīng)，或以什么方式逃避宿主的免疫監(jiān)視而得以生存，這些問(wèn)題的闡明將有助于了解絳蟲(chóng)蚴的侵襲機(jī)制和宿主產(chǎn)生免疫應(yīng)答的機(jī)理，為絳蟲(chóng)蚴病的免疫預(yù)防和診斷提供理論基礎(chǔ)。 1 細(xì)胞免疫及細(xì)胞因子 從目前研究來(lái)看 ,寄生蟲(chóng)免疫主要由免 疫效應(yīng)細(xì)胞和細(xì)胞因子承擔(dān)。參與免疫的效應(yīng)細(xì)胞有 噬細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞、紅細(xì)胞和杯狀細(xì)胞等。 2002） 等研究了沙鼠和倉(cāng)鼠豬帶絳蟲(chóng)小腸粘膜的炎性反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)非免疫抑制小鼠嗜酸性細(xì)胞和嗜中性細(xì)胞適度增加，而杯狀細(xì)胞和肥大細(xì)胞則大量增加。感染 613對(duì)照組的 4倍。而沙鼠肥大細(xì)胞在感染后 9d 有 8 倍的增加，這說(shuō)明沙鼠和倉(cāng)鼠豬帶絳蟲(chóng)的驅(qū)除可能與杯狀細(xì)胞和肥大細(xì)胞的增加有關(guān)，而且在不同動(dòng)物模型中細(xì)胞的增殖有所不同。豬帶絳蟲(chóng)感染豬后 ,宿主炎性細(xì)胞在囊尾蚴周圍出現(xiàn)似乎 有先后順序。 19是最先到達(dá)炎性部位的效應(yīng)細(xì)胞。嗜中性粒細(xì)胞可釋放嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子 ( ,從而吸引大量的嗜酸性粒細(xì)胞在豬囊尾蚴周圍聚集。蟲(chóng)體周圍宿主反應(yīng)主要是炎性細(xì)胞浸潤(rùn) ,以嗜中性粒細(xì)胞及嗜酸性粒細(xì)胞為主 ,并有較多的淋巴細(xì)胞 。 感染后 30d,巨噬細(xì)胞及上皮樣細(xì)胞開(kāi)始出現(xiàn) ,但炎性細(xì)胞仍以嗜酸性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)為主 ,并 在炎性細(xì)胞外層開(kāi)始出現(xiàn)結(jié)締組織增生。隨著感染時(shí)間的延長(zhǎng) ,蟲(chóng)體周圍出現(xiàn)壞死 ,壞死細(xì)胞主要是嗜酸性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞 ,同時(shí)巨噬細(xì)胞和上皮樣細(xì)胞變得非 ?；钴S ,在蟲(chóng)體周圍呈圍墻樣增生 ,試圖吞噬或消滅蟲(chóng)體 ,當(dāng)無(wú)法消滅時(shí) ,在蟲(chóng)體外圍形成結(jié)締組織包囊使其局限在某一部位（ 劉永杰等， 2003） 。通過(guò)顱內(nèi)感染 c 小鼠豬帶絳蟲(chóng)相關(guān)種建立動(dòng)物模型研究 病免疫應(yīng)答和相關(guān)的病理變化是研究 有效手段。免疫應(yīng)答顯示 薄壁細(xì)胞外區(qū)域 大量的炎性滲透出現(xiàn)在感染后 2d，相反免疫細(xì)胞向 薄壁組織的滲透大大延遲。感染鼠早期誘導(dǎo) 細(xì)胞為主的適應(yīng)性免疫應(yīng)答， 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士學(xué)位論文 第八章 文獻(xiàn)綜述：絳蟲(chóng)蚴感染后宿主免疫應(yīng)答的研究 80 et 2004） 。 胞免疫與疾病病程的關(guān)系 盡管在囊尾蚴感染的早期炎癥細(xì)胞發(fā)揮著重要作用，但 中 揮細(xì)胞毒性作用 ,直接殺傷蟲(chóng)體寄生細(xì)胞，而 細(xì)胞主要通過(guò)分泌淋巴因子參與免疫反應(yīng)。針對(duì)不同的寄生蟲(chóng)感染 ,化為 以 主要作用寄生于細(xì)胞內(nèi)的蟲(chóng)體。 此 研究不同細(xì)胞因子對(duì)免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)，有助于了解抗寄生蟲(chóng)的免疫應(yīng)答 。 要了解抗寄 生蟲(chóng)的免疫應(yīng)答怎樣朝殺滅寄生蟲(chóng)方向發(fā)展或者怎樣朝寄生蟲(chóng)慢性感染方向發(fā)展 , 則需要研究淋巴細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子以及間的平衡關(guān)系。 (2002)研究認(rèn)為，在豬囊尾蚴病和棘球蚴病中， 具有活囊尾蚴和棘球蚴的宿主個(gè)體，細(xì)胞免疫傾向于 寄生蟲(chóng)被殺滅或生長(zhǎng)受到限制的個(gè)體細(xì)胞免疫傾向于 2002） 將自然感染豬囊尾蚴的豬淋巴細(xì)胞的炎性反應(yīng)分為 1， 3， 5三級(jí)， 1級(jí)炎癥反應(yīng)僅有少量嗜酸 性細(xì)胞和單核細(xì)胞的炎性滲透， 胞遠(yuǎn)多于 3級(jí)反應(yīng)中肉芽腫尚未形成，而蟲(chóng)體開(kāi)始降解，此時(shí)盡管 胞明顯增加，但 5級(jí)中蟲(chóng)體周圍有廣泛的肉芽腫性滲透，淋巴細(xì)胞亞群數(shù)量減少，除 級(jí)無(wú)區(qū)別。因此積極抵抗豬囊尾蚴的炎性反應(yīng)應(yīng)包括 免疫反應(yīng)的強(qiáng)度和類型還與寄生蟲(chóng)的活力和解剖部位有關(guān)。在用豬帶絳蟲(chóng)提取物和巨頸絳蟲(chóng)囊液作為刺激物，分析淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清中的細(xì)胞因子產(chǎn)生，發(fā)現(xiàn)炎癥病 人具有較高水平的 ,而非炎癥病人和對(duì)照組 炎癥病人的腦積液（ 6%和 40%。所有檢測(cè)的細(xì)胞種群中 明顯優(yōu)勢(shì)。當(dāng)用 炎癥病人主要產(chǎn)生 癥病人淋巴細(xì)胞對(duì)體外刺激表現(xiàn) 非炎癥病人卻 表現(xiàn) et 004)。 2000） 評(píng)價(jià)了 動(dòng)期炎癥性病人 明在 大多數(shù)炎癥損傷中細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答是非常明顯的， 包括 內(nèi)的促炎性細(xì)胞因子占優(yōu)勢(shì)，而未檢測(cè)到 此，認(rèn)為中樞神經(jīng)系統(tǒng)（ 該寄生蟲(chóng)的應(yīng)答與全身 性應(yīng)答不同，是 免疫應(yīng)答。 在 泡狀包蟲(chóng)病的研究中，發(fā)現(xiàn)失敗性（ 病人產(chǎn)生的細(xì)胞因子與進(jìn)行性(人相反，而陽(yáng)性血清病人則出現(xiàn)介于兩者間的中間類型。失敗性 人的 一結(jié)果確證了 et 000)。 染強(qiáng)度與細(xì)胞免疫的類型 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士學(xué)位論文 第八章 文獻(xiàn)綜述：絳蟲(chóng)蚴感染后宿主免疫應(yīng)答的研究 81 研究發(fā)現(xiàn)，宿主接觸寄生蟲(chóng)的數(shù)量與宿主產(chǎn)生免疫應(yīng)答的類型密切相關(guān)， 即細(xì)胞免疫的類型和強(qiáng)度與感染的劑量有關(guān)。 2003)在分析小鼠感染細(xì)粒棘球蚴后早期和晚期細(xì)胞因子的應(yīng)答時(shí)發(fā)現(xiàn)，接種 500個(gè)原頭蚴的小鼠脾細(xì)胞早期誘導(dǎo) 接種 2000個(gè)原頭蚴的小鼠早期誘導(dǎo) 且低劑量感染組的寄生蟲(chóng)的生長(zhǎng)水平較低，說(shuō)明在棘球蚴感染中細(xì)胞因子的應(yīng)答取決于宿主接觸寄生蟲(chóng)的劑量。 芽腫階段的細(xì)胞免疫 肉芽腫的形成是宿主免疫系統(tǒng)與囊尾蚴之間斗爭(zhēng)的結(jié)果，有利于宿主的免疫反應(yīng)。一些研究已證實(shí)，由肉芽 腫引起的炎癥反應(yīng)與包囊中蟲(chóng)體的瀕臨死亡有關(guān)。盡管入侵的幼蟲(chóng)能被免疫血清和補(bǔ)體殺死，但包囊階段的免疫卻依賴于細(xì)胞免疫。 在囊尾蚴病早期肉芽腫與 后期肉芽腫反應(yīng)中寄生蟲(chóng)蟲(chóng)體被完全破壞，為 此 答顯然在豬囊蟲(chóng)致病機(jī)理和清除寄生蟲(chóng)方面起重要作用。 1998） 進(jìn)行了 8份豬囊尾蚴周圍的肉芽腫樣品的組織學(xué)和免疫組化分析，結(jié)果表明所有成熟的肉芽腫樣品都由相關(guān)聯(lián)的纖維化、血管發(fā)生和炎性浸潤(rùn)組成，里面包裹著瀕臨死亡的囊尾蚴。在肉芽腫周圍最豐富的細(xì)胞是漿 細(xì)胞、 噬細(xì)胞、肥大細(xì)胞，以及包括 在內(nèi)的 此肉芽腫的形成對(duì)于殺滅寄生蟲(chóng)具有重要作用。細(xì)胞免疫雖然限制了細(xì)胞外病原的擴(kuò)散，但免疫應(yīng)答的效率決定于病原特異性記憶 2002)的研究結(jié)果表明， 細(xì)胞明顯增加，而且光譜分型顯示只有 細(xì)胞受體增加。這為 細(xì)胞具有活性作用提供強(qiáng)有力的證據(jù)。 2004)研究了不同免疫缺陷小鼠 細(xì)胞種群在控制實(shí)驗(yàn)性多房棘球蚴感染中的作用時(shí)也發(fā)現(xiàn) 細(xì)胞在限制其生長(zhǎng)中起主要作用，而 細(xì)胞和 生蟲(chóng)周圍沒(méi)有肉芽腫形成，脾細(xì)胞對(duì) 和抗原刺激的應(yīng)答降低。在 ）都增加，與寄生蟲(chóng)的高負(fù)荷相一致。因此抗多房棘球蚴感染不依賴于 而依賴于細(xì)胞介導(dǎo)的效應(yīng)因子的功能。 2 體液免疫 主對(duì)初次感 染的抗體應(yīng)答 寄生蟲(chóng)感染過(guò)程中的一個(gè)顯著特點(diǎn)是宿主外周血中嗜酸性細(xì)胞明顯增多，而且主要是