【畢業(yè)學位論文】（Word原稿）豬帶絳蟲六鉤蚴45W-4B和TSO18重組基因工程疫苗的研究預(yù)防獸醫(yī)學博士論文

密級 論文編號 中國農(nóng)業(yè)科學院 博士學位論文 豬帶絳蟲六鉤蚴 45 組基因工程疫苗的研究 of on 5of of of 5 豬帶絳蟲六鉤蚴 45 組基因工程疫苗的研究 摘要 囊蟲?。?由豬 帶絳蟲（ 幼蟲豬囊尾蚴寄生于人或豬等中間宿主而引起的人畜共患寄生蟲病，在中國大部分地區(qū)尤其在少數(shù)民族地區(qū)是一個重要的公共衛(wèi)生問題，對人的健康危害很大。不僅如此，囊蟲病的廣泛存在還造成畜牧業(yè)的重大經(jīng)濟損失，極大影響了我國畜產(chǎn)品在國際市場上的競爭力，因而是公認的社會經(jīng)濟病之一。豬囊尾蚴病的免疫預(yù)防之所以一直困擾著獸醫(yī)工作者，主要原因是抗原來源非常有限。羊絳蟲 45W 重組基因工程疫苗的研制成功，為豬囊尾蚴重組基因工程疫苗的研制提供了典范。為了探索豬帶絳蟲 45 組抗原對 豬囊尾蚴感染的免疫保護效果，獲得具有良好免疫保護作用的重組抗原，用做豬囊蟲病的免疫預(yù)防，我們進行了本項研究。 收集成熟的豬帶絳蟲蟲卵，經(jīng)孵化和激活后，提取六鉤蚴總 設(shè)計特異性引物增 45 因，測序證實擴增產(chǎn)物與國外克隆的豬帶絳蟲 45同源性分別為 說明 45不同蟲株間相對保守。用蛋白質(zhì)專家系統(tǒng)對 5行結(jié)構(gòu)預(yù)測，發(fā)現(xiàn)它們都有分泌信號序列、 酸化位點。根據(jù)預(yù)測結(jié) 果 增 截 去 45因的 N 端信號肽和 得 45 5制性內(nèi)切酶處理 后與相同處理的表達載體 化 切及 測序證明閱讀框完全正確，用 物進行 現(xiàn)在合適的誘導溫度和 度下，分別獲得了高效表達且以可溶性形式存在的 45是人囊蟲陽性血清均可被兩種重組蛋白所識別。 分別用純化的 45 206 為佐劑制成疫苗免疫豬，用 25000枚豬帶絳蟲蟲卵攻擊感染， 時用 分析免疫和感染后豬外周血淋巴細胞增殖情況。結(jié)果表明，免疫后15感染后 30至少在免疫后 90免疫后外周血淋巴細胞略有增殖，而在感染后 1021染后 90數(shù)各組的 囊尾蚴感染數(shù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn) 55%和 94%，與豬囊尾蚴粗抗原免疫組（減蟲率為 92%） 的保護效果相當。而 疫組的減蟲率為 完全保護率達 80%，保護效果明顯優(yōu)于粗抗原對照組。 在補體參與下， 5鉤蚴的存活率分別從 90%和 85%下降到 55%和 70%。 P= 此推測 免疫應(yīng)答過程中作用可能較小。用5W 不等， 在所有的樣品中 顯示為次要的亞型，如果忽略質(zhì)粒本身的作用，上述結(jié)果仍然能夠很好的重復（ et 995） 。早期研究表明 ， 此推斷45本研究所做的補體依賴實驗也證明，在補體參與下， P=而 45體無論是否存在補體，其對六鉤蚴的殺傷作用差異不大。這一結(jié)果似乎也證明， 45要中國農(nóng)業(yè)科學院博士學位論文 第五章 重組抗原的免疫機理和保護性研究 69 補體參與。 清抗體增長曲線分析 豬第一次免疫后 15倍以上，二免以 后 20加強免疫外，另一個原因是攻擊感染所致。因為攻蟲后 14d 血清中已出現(xiàn)六鉤蚴抗體。（ 1996）研究認為豬帶絳蟲中絳期抗原含有與成蟲和六鉤蚴階段抗血清交叉反應(yīng)的表位，而六鉤蚴卻含有大量階段特異性抗體。 血清中的六鉤蚴特異性抗體在感染后一個月即可檢測到，而囊尾蚴階段的抗體到感染后第 3政用豬囊尾蚴勻漿抗原配以佐劑對豬免疫兩次，用妊娠節(jié)片攻擊，總保 護率達 100%，接種 105% 48d 抗體滴度達到峰值，并可維持 164們所得的結(jié)果與上述結(jié)果基本一致，抗體水平在免疫后 1545且可保持抗體陽性達 4個月左右。但本實驗我們在感染后一個月開始用粗制囊尾蚴抗原檢測抗體，抗體水平均表現(xiàn)低水平，三個月時的 體負荷與囊尾蚴抗體之間無相關(guān)性，即豬體的囊尾蚴數(shù)量多而囊尾蚴抗體卻不高。原因之一可能是囊尾蚴抗體在感染 3性較低，檢測循環(huán)抗原的方法相對比較敏感，理論上可檢測出一個或幾個蟲體。另一原因可能是只有感染的囊尾蚴達到一定數(shù)量，抗體水平與囊尾蚴數(shù)才存在一定的相關(guān)性。 2003）以 103、104、 105劑量的豬帶絳蟲蟲卵分別感染三組小豬，用單抗檢測血清中的循環(huán)抗體，發(fā)現(xiàn)在感染后 2有活囊蟲的豬僅在短期內(nèi)可檢測到，當囊尾蚴鈣化后 此我們認為本研究囊尾蚴抗體的水平普遍較低，可能與 蟲體寄生數(shù)量太少和蟲體的發(fā)育程度不同以及檢測方法的敏感性都有關(guān)系。 照組免疫結(jié)果分析 啟動子，與日本血吸蟲的 谷胱甘肽 合的可用乳糖類似物誘導的高水平表達載體。 1999）研究了豬帶絳蟲谷胱甘肽 S 轉(zhuǎn)移酶，發(fā)現(xiàn)其活性與哺乳動物 近，分子量為 26且 白存在于豬囊尾蚴的體壁、實質(zhì)組織（ 原腎管（ 外皮的神經(jīng)細胞體中，用豬帶絳蟲 疫小鼠可降低中絳期蟲體負荷達 析顯示豬帶絳蟲 帶絳蟲、鼠巨頸絳蟲等發(fā)生交叉反應(yīng)，而與曼氏血吸蟲、鼠、兔以及豬肝組織的 明血吸蟲 蟲發(fā)生交叉反應(yīng)，而與豬帶絳蟲和哺乳動物組織中的 以 刺激宿主產(chǎn)生很高的抗體滴度，但該抗體不能識別豬帶絳蟲的 而對豬帶絳蟲感染沒有保護性，所以 于該組的蟲體數(shù)高于未免疫對照組，可能主要是這兩組豬屬于不同的來源，存在年齡、遺傳背景和個體方面的差異造成的。 中國農(nóng)業(yè)科學院博士學位論文 第五章 重組抗原的免疫機理和保護性研究 70 組抗原的免疫保護性分析 從剖檢結(jié)果可以看出，重組抗原免疫組的減蟲率都在 67%以上，而無論是 45獨免疫的減蟲率都在 94%，與粗制抗原免疫組的減蟲率相當。而且 4保護率也達到 80%。說明 45它幾組減蟲率降低，主要原因可能與補充免疫豬的蟲體負荷普遍都偏高有關(guān)。而且未免疫對照組的感染率不高，也是導致減蟲率低的主要原因。本實驗加有 粒的免疫組，除 4疫組外未出現(xiàn)預(yù)期的免疫增強作用， 有些組反而減蟲率有所降低。一是可能基因免疫受很多因素的影響，如質(zhì)粒的純度、免疫的方式及所用的佐劑等；二是豬個體之間的差異所致，因為即使同一免疫組豬的蟲體負荷可以從零到幾十不等；但最重要的原因可能是補充免疫豬在各組中的分布不平衡造成的。從各組蟲體計數(shù)的結(jié)果可以看出，在和 33，而減蟲率為 95%和 89%。而在4和 50，兩組的減蟲率分別為 94%和 83%。所以這兩組的減蟲率較未加 而其免疫水平最好，保護率也最高。 （ 2003）用合成的三肽（ 疫豬，發(fā)現(xiàn)外周血單核細胞合成的 細胞因子（ 劇增加，并且導致感染早期嚴重的局部炎癥反應(yīng)。說明該疫苗的保護效果是以細胞免疫為主。 張唯哲 等（ 1997） 應(yīng)用四甲基偶氮唑鹽（ 檢測了 31例未經(jīng)治療的囊蟲病患者外周血單個核細胞 （ 產(chǎn)生 平，同時用 30 例健康人作對照。實驗結(jié)果顯示，囊蟲病 患者 平明顯低于正常人（ P而患者血清中 平明顯高于正常人（ P本實驗提示囊蟲病患者外周血中低水平的 能與患者細胞免疫功能低下有關(guān) ，說明囊蟲病患者產(chǎn)生的免疫應(yīng)答以體液免疫為主 。 （ 2003）研究了小鼠接種豬帶絳蟲中絳期抗原后 取免疫和對照鼠的脾細胞 現(xiàn)中絳期抗原能誘導 時能誘導產(chǎn)生嗜酸性細胞和特異性 其 是 內(nèi)產(chǎn)生的免疫應(yīng)答和體外細胞因子的產(chǎn)生具有很好的相關(guān)性，說明中絳期抗原誘導的免疫應(yīng)答系 合性，但以體液免疫為主。從我們的結(jié)果分析，第一次免疫后淋巴細胞的增殖不太明顯，加強免疫后才出現(xiàn)明顯增殖。而攻擊感染后淋巴細胞增殖非常明顯，說明初期階段重組抗原所致的免疫應(yīng)答以細胞免疫為主。而感染時的抗體水平統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，抗體水平的高低與最后的減蟲率密切相關(guān)。再者免疫血清對六鉤蚴的殺傷是補體介導的抗體作用，至少說明抗體在保護宿主免受感染方面起重要作用。一些研究也認為，囊尾蚴感染早期的宿主 免疫應(yīng)答以體液免疫為主，而感染后期細胞免疫才被啟動。 盡管入侵的幼蟲能被免疫血清和補體殺死，但包囊階段的免疫卻依賴于細胞免疫。 所以要搞清兩種抗原到底是以細胞免疫還是以體液免疫為主，需要檢測外周血淋巴細胞在抗原刺激下，表達細胞因子的類型?；蜩b定出免疫血清中的 中國農(nóng)業(yè)科學院博士學位論文 第五章 重組抗原的免疫機理和保護性研究 71 從本實驗可以看出，影響豬囊尾蚴基因工程疫苗免疫效果的因素很多，往往導致出現(xiàn)意想不到的結(jié)果。本實驗兩種重組抗原單獨免疫的減蟲率都較高，與粗抗原免疫組相當。而添加 。其原因可能是： 1. 感染時蟲卵的活力，因為豬帶絳蟲的蟲卵只能通過顯微鏡檢查才能對其活力進行定性分析，而不可能像病毒和細菌一樣進行定量測定，只能通過感染動物剖檢囊尾蚴的數(shù)目才能真正知道蟲卵的感染力； 口服含一定蟲卵的生理鹽水溶液 ,不能保證豬在吞咽的時蟲卵完全進入豬胃內(nèi)，使感染的蟲卵數(shù)產(chǎn)生誤差，導致個體間的蟲體負荷差異較大； 疫苗免疫后抗體水平達到峰值時進行攻擊感染，此時獲得的保護性應(yīng)當是最好的。 然而由于豬帶絳蟲蟲卵獲得比較困難，而且保存時間不能過長。所 以抗體達到峰值需要感染的時候往往不能及時獲得蟲卵。而在免疫工作尚未做好，抗體水平尚未完全升高時，又獲得蟲卵需要盡快感染，往往使研究處在事與愿違的尷尬境地；本實驗盡管按正常的免疫程序設(shè)計，即在加強免疫后 3由于蟲卵提前獲得，所以攻擊感染在二免后 7d 進行，此時二免時補充的豬抗體水平還很低，所以導致這些豬的蟲體負荷偏高。 于不同的個體具有不同的遺傳背景、不同的性別、不同的健康狀態(tài)，導致同一組不同個體間蟲體負荷差異較大，即使對照組也會出現(xiàn)幾個到幾百的 蟲體差異。 且完成需要很長時間，當結(jié)果不太理想時進行多次重復不太現(xiàn)實。因為豬囊蟲感染后至少要在 70d 后才能知道免疫的效果，如果要進行幾批實驗，而且每次都按正常的免疫程序進行，一次動物實驗的時間幾乎在半年左右，所以一年內(nèi)只能重復一次。 生物應(yīng)有所區(qū)別。微生物免疫保護的效果是以動物是否發(fā)病為標準，即使它有一定量的微生物感染，但并不表現(xiàn)臨床癥狀，則視為具有免疫保護性。而寄生蟲疫苗盡管獲得了 99%的減蟲率，但畢竟還有 1%的蟲體感染，所以按照現(xiàn)有 的標準，仍然視為保護性為零。目前一些學者已經(jīng)建議將減蟲率等同于保護率，使寄生蟲疫苗的質(zhì)量判定更加標準化、更加客觀。 本實驗的免疫豬雖然完全保護率低，但仍然可作為疫苗抗原應(yīng)用。因為即使疫苗的減蟲率在 50%，免疫接種后也會大大降低囊尾蚴發(fā)育成絳蟲的數(shù)量，從而降低豬囊尾蚴病的流行。在新西蘭羊囊尾蚴的自然感染率在 13%，田間實驗接種羊 45低到 感染率降低了 83%。 根據(jù)巨頸絳蟲蛋白序列合成三種多肽疫苗 p，三種多肽已在小鼠 證明能誘導保護同源攻擊感染，且被證明能作為疫苗抵抗豬帶絳蟲，降低蟲體負荷達 50%。為進一步驗證該多肽疫苗的田間免疫效果，免疫豬 120頭，另設(shè)未免疫豬 120 頭（該地區(qū)豬囊蟲的自然感染率為 14%）作為對照， 10月后剖檢， 120 頭免疫豬共檢出 1369 個囊蟲，而 120 頭對照豬共檢出 66565 個囊蟲，免疫后囊蟲的總數(shù)減少了 降低囊蟲流行 中國農(nóng)業(yè)科學院博士學位論文 第六章 重組蛋白的穩(wěn)定性分析 72 第六章 重組蛋白的穩(wěn)定性分析 摘要： 重組蛋白的穩(wěn)定性對于一種疫苗抗原而言是非常重要的，即使抗原的免疫保護效果再好，如果不能貯存一定的時間或經(jīng)過一定時間大部分 已降解，那應(yīng)用起來也是很不方便。45然都是經(jīng)大腸桿菌表達系統(tǒng)表達并純化得到的，但由于二者間系不同的蛋白分子，而且也經(jīng)過了不同的修飾，因此這兩種表達產(chǎn)物的活性和穩(wěn)定性可能存在一定差異。將純化重組蛋白 5 放置 90d，然后免疫家豬，測定不同時間抗體的增長動態(tài)，并在二免后 4570計算各組的減蟲率，比較重組抗原減蟲率的變化。分別取保存后 1 個月、 2個月的重組蛋白進行 蛋白濃度測定，分析 重組蛋白的穩(wěn)定性。動物實驗結(jié)果表明， 45疫組的減蟲率達到 97%，完全保護率為 60%，免疫保護效果基本沒有發(fā)生變化。而 疫組的減蟲率從保存前的 95%下降到 降低了 蛋白濃度和析結(jié)果表明 原很不穩(wěn)定，保存 2 個月后 2/3 已降解，所以 組蛋白最好在 15重組 45少可以在 4 保存 3 個月以上。 關(guān)鍵詞 ： 45蟲率；含量檢測；保存期 1 材料和方法 劑和動物 劑 脫氧膽酸鈉（ 、十二烷基肌氨酸鈉（ 溶菌酶、尿素購自上海生工生物工程公司、 06佐劑、豬囊尾蚴粗制抗原、豬囊蟲陽性血清、胰酶、鹽酸胍、鄰苯二氨（ 由本實驗室保存。 囊尾蚴檢測試劑盒由本室研制。 液的配制 10 l( 1 :5050油， 硫蘇糖醇。 10 2710118于 950 加水至 1000 10胱甘肽洗脫緩沖液： 原性谷胱苷肽溶解于 50脫緩沖液 50 高 低 酸鈉 中國農(nóng)業(yè)科學院博士學位論文 第六章 重組蛋白的穩(wěn)定性分析 73 包被液（ 蒸餾水至 1000 4 保存。 底物溶液（ ：磷酸鹽檸檬酸緩沖液 100苯二胺（ 4030%鮮配制。 洗滌液（ ： 8g 2溶于 950 水至 100020。 磷酸鹽檸檬酸緩沖液（ )檬酸（ ） 餾水 50 終止液（ 22濃硫酸 餾水 實驗動物 18頭 10按常規(guī)的飼養(yǎng)和管理方式進行飼喂。 驗方法 組抗原的免疫保護實驗 組抗原的制 備及純化 按第五章 苗的制備及免疫 將重組抗原置于 4 冰箱 3 個月后，分別與 206 佐劑乳化制成疫苗。實驗豬隨機分成 3組： 45疫組、未免疫感染對照組，每組 6 頭。每頭豬于頸部肌肉注射 300 15免疫感染對照組不做任何免疫。 驗動物的攻擊感染 剪取豬帶絳蟲的新鮮成熟節(jié)片，生理鹽水沖洗數(shù)次后，置平皿中用眼科剪刀剪碎節(jié)片，并擠壓使蟲卵完全釋放出來，用顯微鏡觀察蟲卵的活力，計數(shù)結(jié)構(gòu)完整 和形態(tài)清楚的蟲卵，然后計算每毫升中所含的蟲卵數(shù)，用生理鹽水將蟲卵稀釋至 10000 枚 /第二次免疫后45d，用注射器吸取 卵液，撬開豬嘴，將注射器伸進豬口腔內(nèi)，輕輕將蟲卵液注入豬舌根部，待豬將蟲卵液吞入胃內(nèi)，大約半小時后再進行飲水或飼喂。 驗豬血清抗體的檢測 分別在免疫前和免疫后每隔 15d，在前腔靜脈叢采血 37 溫箱 1 4放置幾小時， 3500r/10心分離血清。將 純化的 45 原，用包被液（ 稀釋 至 50 g/孔加入 100 所述中國農(nóng)業(yè)科學院博士學位論文 第六章 重組蛋白的穩(wěn)定性分析 74 方法進行間接 苗的免疫保護性分析 三組實驗豬于感染蟲卵 70d 后采血剖殺，仔細檢查豬體全身的囊尾蚴感染情況，并分別計數(shù)干酪樣和水泡樣蟲體，以及每頭豬總的囊尾蚴感染數(shù)。與對照組的蟲體進行比較，計算各免疫組的減蟲率，評價兩種抗原保存 3個月后的免疫效果。 組抗原穩(wěn)定性的定性定量分析 將通過 純化的 45溶性蛋白和用 純化的 涵體蛋白進行酸、 蛋白檢測儀分別測定 算其含量后放在 4 冰箱。分別在 1個月和 2個月后吸取少量進行 蛋白的濃度變化進行定性分析。并用核酸、蛋白檢測儀測定其含量，比較分析純化蛋白在 4 的穩(wěn)定性。 中國農(nóng)業(yè)科學院博士學位論文 第六章 重組蛋白的穩(wěn)定性分析 75 2 結(jié)果 組蛋白的免疫實驗 體水平的動態(tài)檢測 45疫組在一免后 15強免疫后抗體水平急劇升高。在二免后 21d 疫組的抗體水平達到峰值。而 45疫組抗體繼續(xù)升高 ,在攻擊感 染前達到最高。 5攻擊感染時抗體水平僅為 4擊感染后兩組的抗體水平均呈現(xiàn)不同幅度的降低。未免疫對照組的抗體水平在攻擊感染后 15后即緩慢下降。 注 ： 1 為第一次免疫時的血清抗體水平； 2為第二次免疫時的血清抗體； 4 為攻擊感染時的抗體水平； 物保護實驗 剖檢結(jié)果表明 ， 疫組的減蟲率較第六章的結(jié)果明顯降低，減蟲率從 95%就其原因可能是 存 3 個月后蛋白降解，免疫保護性降低所致。 45疫組的減蟲率和完全保護率分別從 94%和 20%升高到 97%和 60%。說明保存 3個月后 45表 2. 重組抗原保存 3 個月后免疫豬囊尾蚴的剖檢結(jié)果 組別 水泡樣蟲體 蟲體總數(shù) 蟲體平均數(shù) 減蟲率 (%) 保護率 (%) 疫組 46,47,30,29,52,59 263 45疫組 0,0,5,0,7 12 0 未免疫感染組 135,77,57,46 315 0 圖1 . 3 4 5 6采血時間（次） O 1 8 免疫組45 第六章 重組蛋白的穩(wěn)定性分析 76 的免疫活性基本沒有發(fā)生變化，略有升高可能與此次 實驗的攻蟲時間是在二次免疫后 45時 4而對攻擊感染可產(chǎn)生較好的抵抗力。而 5以它們兩者的減蟲率差異較大。與前面的結(jié)果比較可以發(fā)現(xiàn)， 放置 3個月后免疫活性大大降低，而 45本保持了純化時的免疫活性。 組蛋白穩(wěn)定性的定量分析 通過 純化的 45組蛋白 4 放置 1 個月后， 示蛋白條帶無明顯變化，含量測定結(jié)果與保存前基本相同 ，都保持在 月后含量略微下降，但保持在 明 45較穩(wěn)定 ,可以在 4 保存 3 個月以上。而純化的 放置 1 個月后， 白條帶已明顯減弱，至 兩個月后蛋白濃度僅為 2.0 mg/明 白很不穩(wěn)定，必須在純化后 15 中國農(nóng)業(yè)科學院博士學位論文 第六章 重組蛋白的穩(wěn)定性分析 77 3 討論 一般來說，真核基因在原核系統(tǒng)中表達量的影響因素很多，諸如不同的載體系統(tǒng)、菌種、誘導表達條件，以及目的基因本 身的堿基組成等。而且真核基因的在大腸桿菌中的表達產(chǎn)物容易受到宿主菌蛋白酶的水解，所以一般在蛋白表達和純化時應(yīng)加入一定量的蛋白酶抑制劑如 防止產(chǎn)物的降解?；蛘哌x擇蛋白酶缺失的宿主菌表達外源蛋白，甚至對基因序列進行修飾，截去影響其穩(wěn)定性的部分。 我們通過 于未用蛋白酶抑制劑處理，所以 4 保存3個月后，與第一次免疫實驗相比，減蟲率降低了 51%。推測可能是重組蛋白發(fā)生了部分降解。 蛋白含量測定進一步表明，該蛋白在 4 保存僅 1 個月， 蛋白就發(fā)生 降解，兩個月后的濃度已經(jīng)降低至不到原來的 1/3，說明該蛋白的免疫保護性的降低是由于蛋白不穩(wěn)定造成的。而 45存 3 個月后的免疫保護性基本不變，減蟲率和完全保護率均有所提高，兩次實驗結(jié)果顯示較好的重復性。含量檢測顯示，放置 2 個月后 45從另一方面也驗證了重組蛋白保存一定時期后，其保護性的高低還與該蛋白的穩(wěn)定性密切相關(guān)。盡管 疫組的抗體水平在二次免疫后出現(xiàn)了與 45在二免后三周迅速降低，到感染前僅為 45體水平的一半。此時的抗體 水平可能不足以抵抗豬帶絳蟲的攻擊感染，導致感染率的升高。同時本次實驗免疫豬出現(xiàn)了較多的干酪樣蟲體，而且以肝臟和肌肉中多見。這在前面的免疫實驗中所沒有或很少見的，其原因是否與感染的時間以及剖檢時蟲體的發(fā)育程度有關(guān)尚需近一步研究。 羊全長 45W 重組基因工程疫苗問世，極大地鼓舞了人們用其它 45W 基因研制豬囊尾蚴疫苗的熱情。但羊 45大腸桿菌中表達的產(chǎn)物很不穩(wěn)定，大多以降解形式存在，因而大大影響了疫苗的實際應(yīng)用，不能滿足疫苗商業(yè)化發(fā)展的需要。而很多證據(jù)已證明， 穩(wěn)定性影響很大。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測分析發(fā)現(xiàn)羊 45W 和豬帶絳蟲 端都有 17 個氨基酸的分泌信號序列。 996)等研究認為當羊絳蟲 45W 基因缺失 7個氨基酸時，表達蛋白的穩(wěn)定性大大增加， 組抗原在 2以穩(wěn)定保存 18 個月。本實驗將豬 45 端 17 個氨基酸的信號肽序列截去后， 4合蛋白的穩(wěn)定性大大提高，保存 3個月的免疫保護性仍然達 含量檢測顯示， 4 4 可穩(wěn)定保存 3 個月以上。所以推測 白 N 端的 17 個氨基酸的信號 肽序列對 合蛋白的穩(wěn)定性也會有影響。下一步應(yīng)對 因進行修飾，截去其 N 端的信號肽序列，以提高該重組蛋白的穩(wěn)定性，獲得表達量高、穩(wěn)定性好和免疫原性良好的重組蛋白。另一方面，純化蛋白時加入蛋白酶抑制劑 抑制蛋白酶活性或選擇蛋白酶缺失菌株作為宿主菌 可能也是解決 解的有效途徑。當然用真核表達系統(tǒng)如酵母進行該基因的表達，不僅可以克服蛋白降解的問題，而且還能對 外源蛋白進行翻譯后的加工和修飾，獲得免疫保護性更好的重組蛋白。 中國農(nóng)業(yè)科學院博士學位論文 第七章 結(jié)論 78 第七章 結(jié)論 1. 在國內(nèi)首次成功克隆了 因，同源性比較表明 在不同地方株間比較保守。 2. 對 二者 7 個氨基酸的分泌信號肽， 9其它已知的宿主保護性六鉤蚴抗原具有相似的結(jié)構(gòu)特征。 45高度疏水的跨膜螺旋區(qū) 和大量 磷酸化、糖基化位點； 白有 1個糖基化和 4 個磷酸化位點，二者均定位于細胞外。由此推測 45能為六鉤蚴階段分泌的糖蛋白，并且可能具有酶的活性。 3. 在大腸桿 菌中成功表達了具有免疫活性的 5 45主要以可溶性形式高效表達 ,這種差異主要由重組蛋白的氨基酸組成所決定。 45明人囊蟲血清中含有高滴度六鉤蚴 抗體。 4. 初步揭示了重組抗原 5明感染前的抗體水平與重組抗原的減蟲率密切相關(guān)，而囊尾蚴抗體水平與囊尾蚴蟲體負荷間無相關(guān)性。重組抗原的免疫保護作用是細胞免疫和體液免疫共同作用的結(jié)果。 5. 國內(nèi)外首次體外實 驗證明，在補體參與下， 45體對六鉤蚴的殺傷作用均有所增強，但在補體介導下 P=。說明 傷六鉤蚴依賴補體的參與，由此推測 苗的免疫效果可能優(yōu)于45 6. 在豬體確證了 45組疫苗良好的免疫保護效果，其減蟲率分別達 95%和94%，與囊尾蚴粗制抗原的免疫效果（減蟲率為 92%） 相當，而 80%，免疫效果優(yōu)于囊尾蚴粗 制抗原免疫組，這一結(jié)果為進一步開發(fā)商品化 5 7. 通過豬體實驗和含量檢測，確定了重組抗原 45 4 的 保存期，證明了N 端信號肽序列對重組蛋白的穩(wěn)定性影響很大，截去 N 端信號肽序列，或在真核系統(tǒng)中進行表達將會大大提高 中國農(nóng)業(yè)科學院博士學位論文 第八章 文獻綜述：絳蟲蚴感染后宿主免疫應(yīng)答的研究 79 第八章 文獻綜述 絳蟲蚴感染后宿主免疫應(yīng)答的研究 絳蟲蚴病是指由帶科絳蟲的中絳期寄生于中間宿主體內(nèi)所引起的寄生蟲病，對家畜和人危害最大最常見的主要有豬囊尾蚴病和棘球蚴病。絳蟲蚴作為一種復雜的病原體 ，不僅抗原成分復雜，而且 不同發(fā)育階段的抗原組份不盡相同，所以不同的發(fā)育階段，即使同一階段的不同感染時期所引起的免疫反應(yīng)的程度和類型也不完全相同。一般而言， 寄生蟲引起的免疫反應(yīng)與細菌、病毒引起的免疫反應(yīng)，無論程度和持續(xù)時間，前者都不及后者。寄生蟲免疫通常表現(xiàn)為不完全免疫，血清中產(chǎn)生的免疫球蛋白與免疫保護不成比例關(guān)系。寄生蟲若在某一宿主體內(nèi)發(fā)育至成蟲，以后則能在宿主體內(nèi)長期生存下去。盡管宿主能識別蟲體并產(chǎn)生免疫反應(yīng)，但并不能將其完全殺滅或驅(qū)除出去。絳蟲從感染性蟲卵或幼蟲進入宿主體內(nèi)，到最終發(fā)育至中絳期（囊尾蚴或 棘球蚴），只是形態(tài)、大小和結(jié)構(gòu)上的變化，而不象細菌和病毒可在動物體內(nèi)大量繁殖或復制。因此研究蟲卵或六鉤蚴進入中間宿主體內(nèi)后，宿主免疫系統(tǒng)將發(fā)生怎樣的反應(yīng)來應(yīng)對外源物質(zhì)的入侵，而蟲體從六鉤蚴到囊尾蚴的不同發(fā)育階段又以什么方式降低自身的抗原性而不與宿主發(fā)生免疫反應(yīng)，或以什么方式逃避宿主的免疫監(jiān)視而得以生存，這些問題的闡明將有助于了解絳蟲蚴的侵襲機制和宿主產(chǎn)生免疫應(yīng)答的機理，為絳蟲蚴病的免疫預(yù)防和診斷提供理論基礎(chǔ)。 1 細胞免疫及細胞因子 從目前研究來看 ,寄生蟲免疫主要由免 疫效應(yīng)細胞和細胞因子承擔。參與免疫的效應(yīng)細胞有 噬細胞、嗜酸性粒細胞、肥大細胞、紅細胞和杯狀細胞等。 2002） 等研究了沙鼠和倉鼠豬帶絳蟲小腸粘膜的炎性反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)非免疫抑制小鼠嗜酸性細胞和嗜中性細胞適度增加，而杯狀細胞和肥大細胞則大量增加。感染 613對照組的 4倍。而沙鼠肥大細胞在感染后 9d 有 8 倍的增加，這說明沙鼠和倉鼠豬帶絳蟲的驅(qū)除可能與杯狀細胞和肥大細胞的增加有關(guān)，而且在不同動物模型中細胞的增殖有所不同。豬帶絳蟲感染豬后 ,宿主炎性細胞在囊尾蚴周圍出現(xiàn)似乎 有先后順序。 19是最先到達炎性部位的效應(yīng)細胞。嗜中性粒細胞可釋放嗜酸性粒細胞趨化因子 ( ,從而吸引大量的嗜酸性粒細胞在豬囊尾蚴周圍聚集。蟲體周圍宿主反應(yīng)主要是炎性細胞浸潤 ,以嗜中性粒細胞及嗜酸性粒細胞為主 ,并有較多的淋巴細胞 。 感染后 30d,巨噬細胞及上皮樣細胞開始出現(xiàn) ,但炎性細胞仍以嗜酸性粒細胞和淋巴細胞浸潤為主 ,并 在炎性細胞外層開始出現(xiàn)結(jié)締組織增生。隨著感染時間的延長 ,蟲體周圍出現(xiàn)壞死 ,壞死細胞主要是嗜酸性粒細胞和淋巴細胞 ,同時巨噬細胞和上皮樣細胞變得非 常活躍 ,在蟲體周圍呈圍墻樣增生 ,試圖吞噬或消滅蟲體 ,當無法消滅時 ,在蟲體外圍形成結(jié)締組織包囊使其局限在某一部位（ 劉永杰等， 2003） 。通過顱內(nèi)感染 c 小鼠豬帶絳蟲相關(guān)種建立動物模型研究 病免疫應(yīng)答和相關(guān)的病理變化是研究 有效手段。免疫應(yīng)答顯示 薄壁細胞外區(qū)域 大量的炎性滲透出現(xiàn)在感染后 2d，相反免疫細胞向 薄壁組織的滲透大大延遲。感染鼠早期誘導 細胞為主的適應(yīng)性免疫應(yīng)答， 中國農(nóng)業(yè)科學院博士學位論文 第八章 文獻綜述：絳蟲蚴感染后宿主免疫應(yīng)答的研究 80 et 2004） 。 胞免疫與疾病病程的關(guān)系 盡管在囊尾蚴感染的早期炎癥細胞發(fā)揮著重要作用，但 中 揮細胞毒性作用 ,直接殺傷蟲體寄生細胞，而 細胞主要通過分泌淋巴因子參與免疫反應(yīng)。針對不同的寄生蟲感染 ,化為 以 主要作用寄生于細胞內(nèi)的蟲體。 此 研究不同細胞因子對免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)，有助于了解抗寄生蟲的免疫應(yīng)答 。 要了解抗寄 生蟲的免疫應(yīng)答怎樣朝殺滅寄生蟲方向發(fā)展或者怎樣朝寄生蟲慢性感染方向發(fā)展 , 則需要研究淋巴細胞分泌的細胞因子以及間的平衡關(guān)系。 (2002)研究認為，在豬囊尾蚴病和棘球蚴病中， 具有活囊尾蚴和棘球蚴的宿主個體，細胞免疫傾向于 寄生蟲被殺滅或生長受到限制的個體細胞免疫傾向于 2002） 將自然感染豬囊尾蚴的豬淋巴細胞的炎性反應(yīng)分為 1， 3， 5三級， 1級炎癥反應(yīng)僅有少量嗜酸 性細胞和單核細胞的炎性滲透， 胞遠多于 3級反應(yīng)中肉芽腫尚未形成，而蟲體開始降解，此時盡管 胞明顯增加，但 5級中蟲體周圍有廣泛的肉芽腫性滲透，淋巴細胞亞群數(shù)量減少，除 級無區(qū)別。因此積極抵抗豬囊尾蚴的炎性反應(yīng)應(yīng)包括 免疫反應(yīng)的強度和類型還與寄生蟲的活力和解剖部位有關(guān)。在用豬帶絳蟲提取物和巨頸絳蟲囊液作為刺激物，分析淋巴細胞培養(yǎng)上清中的細胞因子產(chǎn)生，發(fā)現(xiàn)炎癥病 人具有較高水平的 ,而非炎癥病人和對照組 炎癥病人的腦積液（ 6%和 40%。所有檢測的細胞種群中 明顯優(yōu)勢。當用 炎癥病人主要產(chǎn)生 癥病人淋巴細胞對體外刺激表現(xiàn) 非炎癥病人卻 表現(xiàn) et 004)。 2000） 評價了 動期炎癥性病人 明在 大多數(shù)炎癥損傷中細胞介導的免疫應(yīng)答是非常明顯的， 包括 內(nèi)的促炎性細胞因子占優(yōu)勢，而未檢測到 此，認為中樞神經(jīng)系統(tǒng)（ 該寄生蟲的應(yīng)答與全身 性應(yīng)答不同，是 免疫應(yīng)答。 在 泡狀包蟲病的研究中，發(fā)現(xiàn)失敗性（ 病人產(chǎn)生的細胞因子與進行性(人相反，而陽性血清病人則出現(xiàn)介于兩者間的中間類型。失敗性 人的 一結(jié)果確證了 et 000)。 染強度與細胞免疫的類型 中國農(nóng)業(yè)科學院博士學位論文 第八章 文獻綜述：絳蟲蚴感染后宿主免疫應(yīng)答的研究 81 研究發(fā)現(xiàn)，宿主接觸寄生蟲的數(shù)量與宿主產(chǎn)生免疫應(yīng)答的類型密切相關(guān)， 即細胞免疫的類型和強度與感染的劑量有關(guān)。 2003)在分析小鼠感染細粒棘球蚴后早期和晚期細胞因子的應(yīng)答時發(fā)現(xiàn)，接種 500個原頭蚴的小鼠脾細胞早期誘導 接種 2000個原頭蚴的小鼠早期誘導 且低劑量感染組的寄生蟲的生長水平較低，說明在棘球蚴感染中細胞因子的應(yīng)答取決于宿主接觸寄生蟲的劑量。 芽腫階段的細胞免疫 肉芽腫的形成是宿主免疫系統(tǒng)與囊尾蚴之間斗爭的結(jié)果，有利于宿主的免疫反應(yīng)。一些研究已證實，由肉芽 腫引起的炎癥反應(yīng)與包囊中蟲體的瀕臨死亡有關(guān)。盡管入侵的幼蟲能被免疫血清和補體殺死，但包囊階段的免疫卻依賴于細胞免疫。 在囊尾蚴病早期肉芽腫與 后期肉芽腫反應(yīng)中寄生蟲蟲體被完全破壞，為 此 答顯然在豬囊蟲致病機理和清除寄生蟲方面起重要作用。 1998） 進行了 8份豬囊尾蚴周圍的肉芽腫樣品的組織學和免疫組化分析，結(jié)果表明所有成熟的肉芽腫樣品都由相關(guān)聯(lián)的纖維化、血管發(fā)生和炎性浸潤組成，里面包裹著瀕臨死亡的囊尾蚴。在肉芽腫周圍最豐富的細胞是漿 細胞、 噬細胞、肥大細胞，以及包括 在內(nèi)的 此肉芽腫的形成對于殺滅寄生蟲具有重要作用。細胞免疫雖然限制了細胞外病原的擴散，但免疫應(yīng)答的效率決定于病原特異性記憶 2002)的研究結(jié)果表明， 細胞明顯增加，而且光譜分型顯示只有 細胞受體增加。這為 細胞具有活性作用提供強有力的證據(jù)。 2004)研究了不同免疫缺陷小鼠 細胞種群在控制實驗性多房棘球蚴感染中的作用時也發(fā)現(xiàn) 細胞在限制其生長中起主要作用，而 細胞和 生蟲周圍沒有肉芽腫形成，脾細胞對 和抗原刺激的應(yīng)答降低。在 ）都增加，與寄生蟲的高負荷相一致。因此抗多房棘球蚴感染不依賴于 而依賴于細胞介導的效應(yīng)因子的功能。 2 體液免疫 主對初次感 染的抗體應(yīng)答 寄生蟲感染過程中的一個顯著特點是宿主外周血中嗜酸性細胞明顯增多，而且主要是