【畢業(yè)學位論文】（Word原稿）瓜枝孢弱致病菌株誘導黃瓜抗病性分子機制的初步研究植物病理學碩士論文

密級 論文編號 中國農業(yè)科學院 學位論文 瓜枝孢 弱致病 菌株誘導黃瓜抗病 性 分子機制 的 初步研究 I 摘 要 生物因子誘導的植物抗病性是增強寄主抗病性的重要方法。與病毒相比，真菌、細菌弱致病菌及其誘導抗病機制的研究相對滯后。本論文以本實驗室通過高溫誘導在國內外首次篩選出的瓜枝孢 (致病菌株為試材，采用 術系統(tǒng)分析了瓜枝孢弱致病菌株基因組的變化，以及瓜枝孢弱致病菌株誘導黃瓜抗病的差異表達，取得如下階段性進展： 1、通過瓜枝孢弱致病菌株誘導黃瓜抗病性的表型鑒定，進一步驗證了瓜枝孢弱致病菌株具有穩(wěn)定的致弱性，能顯著提高黃瓜對黑星病的抗性，誘導抗病效 果達 2、瓜枝孢弱致病菌株 2R 和 3R 的孢子比對應強致病菌株 2Q 和 3Q 的孢子小，形態(tài)規(guī)則，孢子形狀呈橢圓形或近圓形，而對應強致病菌株孢子形狀多種多樣，有梭形、近梭形、橢圓形及近 圓形等形狀。 3、 術可以有效揭示弱致病菌株 平的變異，瓜枝孢經(jīng) 50高溫處理得到的弱致病菌株基因組發(fā)生了顯著的變化。 256 個 物組合在擴增 2R/2Q 和 3R/3Q 時（ 2Q 和 3Q 為強致病菌株），分別產(chǎn)生 2910 和 2216 個 段產(chǎn)生， 2R 與 2Q 以及 3Q 的遺傳相似性分別為 4、篩選并優(yōu)化了黃瓜 應體系及反應程序。 利用 術分析了瓜枝孢弱致病菌株誘導黃瓜抗病相關基因表達片段的時序特性：差異表達片段在弱致病菌株誘導后的 9 個時間點均有分布 ,弱致病菌株引發(fā)的一系列調控始于 3h 或更早， 69h 至 24h 期間變化不明顯， 24h 開始顯著減少。 5、獲得了經(jīng) 證的瓜枝孢弱致病菌株誘導的 4 個特異 段序列。 4 個特異 段與 一些編碼誘導抗病相關基因的 列有較高的同源 性，主要包括梨 酶 亞基 、 黑麥抗病基因 擬南芥水楊酸葡糖基轉移酶、磷脂酶 C 等。 上述研究結果，在理論上將為進一步深入研究瓜枝孢弱致病菌株的遺傳特性，以及 進一步克隆瓜枝孢弱致病菌株誘導抗病的相關基因奠定基礎 ；在實踐上將為植物真菌疫苗的研制和開發(fā)提供一定的依據(jù)。 關鍵詞： 瓜枝孢；弱致病菌株；誘導抗病性；黃瓜；黑星病 by is to a of by of is of in In . by to of in at . in by 1. . by to up 2. of 2R R . or of to 3. . in NA 0 . 2910 216 R/2Q R/3Q (2Q Q 56 of R/2Q R/3Q 4. CR of by in A of by hr or t hr 4of 45. NA by to TP of 1. In a on of . to 錄 第一章 緒論 . 1 言 . 1 瓜誘導抗病性研究進展 . 1 黃瓜誘導抗病因子 . 1 黃瓜誘導抗病機理 . 1 黃瓜誘導抗病性的研究展望 . 4 1.3 術在研究植物基因差異表達中的應用 . 5 術的應用 . 5 研究的意義 . 6 第二章 瓜枝孢 弱致病 菌株基因組分析 . 8 料與方法 . 8 枝孢 弱致病 菌株的篩選 . 8 枝孢 弱致病 菌株致病性鑒定 . 8 致病 菌株遺傳穩(wěn)定性研究 . 9 弱致病 菌株基因組分析 . 9 . 9 據(jù)處理 . 10 結果與分析 . 10 瓜黑星病弱致病菌的篩選 . 10 枝孢 弱致病 菌株遺傳穩(wěn)定性研究 . 11 枝孢 弱致病 菌株及其 強致病 菌株的差異 . 12 增圖譜 . 12 增圖譜 . 13 溫誘導的 弱致病 菌株與其 強致病 菌株間的遺傳相似性 . 14 結 . 15 第三章 瓜枝孢 弱致病 菌株誘導黃瓜抗病差異表達分析 . 17 料與方法 . 17 枝孢 弱致病 菌株誘導抗病性鑒定 . 17 系 . 17 枝孢 弱致病 菌株誘導的 異片段克隆 . 19 異片段測序 . 20 異片段的序列同源性搜索與相似性比對 . 20 異片段 證 . 20 果與分析 . 20 枝孢 弱致病 菌株誘導黃瓜對黑星病抗性的表型鑒定 . 20 瓜 應體系優(yōu)化 . 21 瓜枝孢 弱致病 菌株誘導黃瓜抗病相關的差異片段的 析 . 23 枝孢 弱致病 菌株誘導黃瓜抗病相關基因的時序表達 . 23 異表達片段的回收和克隆 . 25 異表達片段的測序及同源性比較 . 26 交分析 . 28 結 . 29 第四章 結論與討論 . 30 論 . 30 驗證了瓜枝孢 弱致病 菌株 2R 的致弱性及對黃瓜黑星病的誘導抗病性 . 30 基因組水平分析了高溫誘導產(chǎn)生的 弱致病 菌株與 強致病 菌株的差異 . 30 化了黃瓜 應體系 . 30 析了瓜枝孢 弱致病 菌株誘導黃瓜抗病相關基因差異表達的時序性 . 30 獲得了經(jīng) 證的瓜枝孢 弱致病 菌株誘導的 4 個特異 段序列及其同源性比對結果 . 31 論 . 31 瓜枝孢 弱致病 菌株的誘導抗病性 . 31 溫誘導產(chǎn) 生的瓜枝孢 弱致病 菌株的基因組分析 . 31 枝孢 弱致病 菌株誘導黃瓜抗病機理研究 . 32 差異顯示分析中的應用 . 33 參考文獻 . 35 附錄 . 40 致謝 . 46 作者簡歷 . 48 中國農業(yè)科學院碩士學位論文 第一章 緒論 1 第一章 緒論 言 植物病害是威脅農業(yè)生產(chǎn)的自然災害之一。人類賴以生存的有益植物，如農作物、蔬菜、果樹、花卉、林木等，都會不斷受到病原微生物 （ 包括真菌、細菌、病毒和類病毒 ） 的侵襲，病害發(fā)生嚴重，造成減產(chǎn)、品質降低、甚至植株死亡，使生產(chǎn)遭受重大的經(jīng)濟損失。目前，農作物病害的防治主要依賴于化學防治，由化學藥劑過量使用所造成抗藥性問題和環(huán)保問題，使其在生產(chǎn)中的應用受到越來越多的限制。因而提高和利用寄主本身的抗病性是增強作物抵御多種病害的根本有效途徑。 植物誘導抗病性以其寄主植物獲得 的抗性具有廣譜性和持久性等特點，成為當前植物病害防御的研究熱點之一。 瓜誘導抗病性研究進展 黃瓜誘導抗病因子 誘導因子是指能誘導植物產(chǎn)生抗病反應的物質，主要包括非生物性誘導因子和生物性誘導因子，非生物性誘導因子包括物理因子和化學因子。許多學者先后利用各種誘導因子開展了黃瓜誘導抗性的研究，在已報道的黃瓜誘導抗性研究結果中所涉及的誘導因子包括熱擊、高溫、低溫、低濕、重力等物理誘導因子（ A,1984； ,1987； 李寶聚， 2001； 趙歡， 2005； 李寶聚， 2005），水楊酸、苯酚類、乙烯類、磷酸鹽等化學誘導因子以及無致病性菌株、 弱致病 菌株等生物誘導因子（云興福， 2000； .,1991 ；沈其榮 ， 2000； ， 1995； S， 2004； J,1995； 邱馳等 ， 2005；王晨芳 ， 2005； 馬青 ， 2003， 2004； 魏國強， 2004；郭海淵， 2005）。研究結果表明：利用水楊酸、乙烯、紫外線等非生物性因子以及細菌、真菌和病毒及它們的代謝產(chǎn)物等作為誘導因子，均能提高黃瓜對霜霉病、白粉病、黑星病、炭疽病等病害的抗病能力 李淑菊， 1997；栗波， 1994；王維榮， 1994）。 此外，微量元素、硅、煙酸衍生物等誘導因子也有報道 (， 1995； ， 1992； J， 1995； P， 1990； ， 1995)。 黃瓜誘導抗病機理 誘導抗病機理主要是誘導劑影響植物和病原物之間的關系，以某種方式改變了植物代謝，使植物的生長向有利于抗病方向發(fā)展。近來來 , 分子生物學技術的發(fā)展日新躍益 ， 對植物病害誘導防御技術的研究日漸深入， 但誘導抗性的免疫機制是復雜的。目前研究較深入的中國農業(yè)科學院碩士學位論文 第一章 緒論 2 誘導抗病機理大多集中在擬南芥和煙草等模式植物上，黃瓜誘導抗病機理的研究還不是很深入。本文將從多方面對黃瓜誘導抗病性的機理進行闡述。 構物質變化 經(jīng)誘導劑處理的黃瓜植株，其部分結構組成物質會發(fā)生一定的變化，主要表現(xiàn)在角質、乳突、侵填體 、胼胝質、膠質物質的形成及木質化的產(chǎn)生，在一定程度上改變了黃瓜的形態(tài)結構，增強了誘導后黃瓜植株遠離侵染點的細胞壁和表皮組織的木質化能力，在病原菌和植株間形成一種屏蔽，從而阻止病原菌的進一步侵染，使病菌的致病過程受到抑制，因而有助于提高黃瓜對病原物的抗性。 研究發(fā)現(xiàn)在接種黃瓜瘡痂病后，抗病黃瓜品種的下胚軸皮層 (接種 5天后 )具有木質素沉積 ,而在感病的和健康的黃瓜下胚軸中則沒有，推測木質化作用可作為抗病的一種因素。 任何刺激寄主在侵染點產(chǎn)生木質化的物質，都能增加植物對病害的抗性（ 1995） 。木質素 合成量的提高正是植物抗性潛能被激活的結果 ( 1987)。用非致病菌接種植物后，可刺激植物在維管束形成侵填體和膠質物質，阻止病菌在維管束中的擴展。如用導侵填體和膠質物質形成，阻止了根部病菌f. 陳捷 , 1994） 。 用氨基寡聚素處理黃瓜葉片后 ,可以誘導黃瓜產(chǎn)生對白粉病的抗病性 ,表現(xiàn)為細胞壁加厚 ,寄主細胞壁下產(chǎn)生多層次結構的乳突， 乳突的大量產(chǎn)生阻止 了該菌菌絲侵入黃瓜葉片中 （ 馬青 ， 2004） 。 組織結構抗病性是黃瓜抵御病原菌侵染的第一道屏障，可以有效抑制病原菌的進一步侵染。 活性變化 植物在誘導因子作用下，植株體內有多種抗病相關酶活性發(fā)生變化。主要包括，苯丙氨酸解氨酶（ 過氧化物酶（ 超氧化物歧化酶（ 多酚氧化酶（ 脂氧合酶 （ 酶類。黃瓜經(jīng)誘導處理后體內 性明顯增強 (,1982; ,1982； A, 1984)， 化苯丙氨酸向 肉桂酸轉變是木質素合成的起點，而且該酶也是酚類代謝、木質素和植保素合成中的關鍵酶。 其同工酶參與植物細胞壁蛋白的交聯(lián)反應和木質素的合成。它利用體內的 而阻止病原菌侵染。 能將 酚類物質氧化成醌類物質，起到殺菌作用。植物感病后，體內會產(chǎn)生過多的活性氧，主要有 氧陰離子）和 氧化氫）。 要用來清 除 轉而把 化為 2。 李冠等人（ 1989）在誘導免疫的哈密瓜植株中發(fā)現(xiàn)， 其它兩個苯丙烷類代謝的關鍵酶同步升高。 李洪蓮等用激 發(fā)子和誘抗菌處理黃瓜后，發(fā)現(xiàn)植物體內 且對 炭疽病表現(xiàn)有抗性。其中 功酶帶數(shù)增加，著色加深，這說明誘導抗性的產(chǎn)生與上述酶活性的增強有關 （ 李 洪連 ， 1993） 。 A 等（ 1993）報中國農業(yè)科學院碩士學位論文 第一章 緒論 3 道，用 誘導黃瓜的系統(tǒng)抗病性， 性增強。 魏國強（ 2004）用硅誘導接種能使黃瓜葉片的過氧化氫酶 （ 、過氧化物酶 （ 活性升高 ,超氧化物歧化酶 （ 活性降低 。 誘導黃瓜幼苗對白粉病的抗性。 物抗毒素物質變化 植物抗毒素（ 病原菌侵入寄主時，寄主細胞產(chǎn)生抑制病原菌生長的物質。在黃瓜抗病研究中發(fā)現(xiàn)的抗毒素種類主要有酚類物質、類黃酮等。酚類物質（單寧、綠原酸等）是殺菌性物質，又是木質素合成的前體，故能抗病。 等、李洪連、王金生等（ 1993）用炭疽?。?抗菌或激發(fā)子處理的黃瓜植株產(chǎn)生對致病菌的抗性，同時葉片中酚類物質的沉積作用增強， 在黃瓜葉片提取物中發(fā)現(xiàn)糖基化的類黃酮類抗毒素（ 2004）。 病相關蛋白（ 由 1970） 發(fā)現(xiàn)的病程相關蛋白 （ R /認為是植物產(chǎn)生誘導抗病性的生化機制之一， 作為 生的標志。 到目前 白包括 17 個蛋白家族。其中 、 丁質酶）、 族的 白在離體條件下顯示抗微生物活性的 白中，研究的最廣泛的是 丁 質酶）和 （ ,1996； R,1996；， 1988； ， 1993）。 酸性 要分布于植物細胞間隙，堿性 多分布于細胞液中， 分子量都很低。 現(xiàn)的活性主要有幾丁質酶、 3功能主要包括 :攻擊病原物、降解細胞壁大分子釋放二級 (內源 )激發(fā)子、分解毒素、結合或抑制病毒外殼蛋白等。 在黃瓜葉片上用真菌、細菌、病毒侵染后，可誘導 累 （ ， 1980； F 等， 1995； ， 1982； ， 1994)。關于這方面的誘導抗病機制還需要更為深入地研究。 病信號物質 目前，黃瓜系統(tǒng)抗病性已成為研究熱點，誘導抗病的信號路徑是系統(tǒng)抗病性研究的重要內容，誘導抗病性的一些信號物質相繼被報道。植物激素 楊酸（ 茉莉酸（ 乙烯被公認系統(tǒng)信號分子。在誘導抗病的過程中，誘導因子、病原菌和植物的互作是一個復雜過程。當誘導因子作用植物時，誘導抗病路徑被激活，信號因子開始轉移、擴散，防 御基因的轉錄活化，抗病相關物質表達，形成化學的或物理的屏障。 1995）利用 導黃瓜體內的 斷誘導菌與黃瓜葉片互作產(chǎn)生原初信號，從而激發(fā) 導系統(tǒng)抗性產(chǎn)生。 1984）報道。短暫熱擊后可誘導黃瓜感病品種對黑星病的抗性，同時熱擊后 6小時，乙烯積累量比對照株中國農業(yè)科學院碩士學位論文 第一章 緒論 4 高出大約 2倍。熱擊黃瓜苗中乙烯含量的增加可能是由于其 前體 11量增加的結果，熱擊增加了 而使 煙草和擬南芥轉基因試驗證明， 徐建明 , 2000） 。 李冠， 1988） 。 抗壞血酸過氧化物酶（ 等 最終積累 沈文飚 , 1999)。 瓜誘導抗病性分子機制 在植物 的誘導抗病進程中先后有兩套基因起作用，即抗病基因和防衛(wèi)反應基因。抗病基因產(chǎn)物與病菌無毒基因產(chǎn)物有識別作用，從而誘導防衛(wèi)反應基因的表達。同時，一些調節(jié)抗病相關物質表達的基因也起作用。 （ 1993）提出黃瓜對炭疽病的系統(tǒng)獲得抗性（ 作用模式，病原菌誘導合成，從而激活信號轉導路徑，引起一系列 關基因的協(xié)調表達，導致系統(tǒng)抗性蛋白在黃瓜中大量積累。放射標記證明， 被病原菌侵染后的植物中產(chǎn)生的苯丙氨酸和苯甲酸合成的 （ 995） 。 （ 1995）從表達 黃瓜葉片的胞間濾液中提取出一種 33近氧化物酶（ 運用 部分氨基酸序列獲得全長為1218克?。?從這種 斷出的氨基酸序列與經(jīng)純化的蛋白質測得的氨基酸序列是一致的，同時也證明 許多已知植物過氧化物酶的典型形式。 指出，利用非致病細菌 誘導黃瓜植物的系統(tǒng)抗病性，該菌的誘導作用是通過細菌內的 因控制的， 因編碼的 白起到激發(fā)植物抗病性的作用 ( E, 1996)。有研究證實查爾酮合成酶（ 查爾酮合成酶同工酶（ 因的表達活性增強與黃瓜的誘導抗性直接相關，明確了類黃酮化合物在該種植物復雜的防御體系中起到重要的作用 (, 2002)。柴立紅等 （ 2003） 針對 種茉莉酸類似物）對黃瓜花葉病毒基因組 制和積累的影響，采用 雜交并結合定量檢測方法，確定不同濃度的 理后在不同的時間對病毒 荷量的影響。 黃瓜發(fā)芽期經(jīng)冷處理可以誘導賴氨酸脫羧酶基因表達（逯明輝， 2005）。 誘導抗病性的分子機 制的研究在 擬南芥、番茄和煙草等模式植物上研究的較深入。 黃瓜誘導抗病性的研究展望 誘導抗病性具有無污染、抗菌譜廣、持續(xù)時間較長、可控性等特點，因此具有良好的應用前景。 田波將衛(wèi)星 合到病毒基因組 ，研制成功兩個生防制劑（ 田間試驗表明這些生防制劑能誘導黃瓜對霜霉病的抗性，顯著減輕病害發(fā)生，增加產(chǎn)量，用衛(wèi)星 弱，由致弱 控制 衛(wèi)星 成的生防因子（ 誘導黃瓜植株對霜霉病的抗性（ ,1990； Y,H， 1992）。 （ 1998）研究了三種 : 、 和 國農業(yè)科學院碩士學位論文 第一章 緒論 5 對黃瓜抗炭疽病 （ 、角斑病 （ 和葫蘆萎縮病 （ 的誘導抗病效果。結果表明 ,這三種混合物的誘抗效果達到了一種人工合成的化學誘抗劑 效果 ,并且有顯著的促進植物生長的作用。 為了快速、有效地推進黃瓜誘導抗病性研究在實際中的應用，應加強在以下三方面的研究內容：進一步加強黃瓜誘導抗病機制的研究，為其有效地利用提供可靠的理論依據(jù)；建立方便、簡單、有效的黃瓜誘導劑的篩選體系，如 （ 1998）建立了一種快速的檢測生物和非生物 導劑的系統(tǒng) 歐芹懸浮細胞，這種誘導劑篩選體系是否適用于黃瓜上還有待進一步驗證；對誘導劑進行風險評估，特別是化學合成誘導劑對作物生長發(fā)育、產(chǎn)量及環(huán)境的影響； （ 3） 在應用性的研究方面，進行 誘導劑田間應用的條件的研究。 許多學者正在致力于黃瓜誘導抗病性機制的研究，這必將 為誘導抗病技術最終應用于生產(chǎn)實踐，取代目前化學藥劑防治病害的方法奠定理論基礎。 1.3 術在研究植物基因差異表達中的應用 析技術是由 發(fā)明并由 1995）發(fā)展起來的一種檢測 態(tài)性的新方法。由于結合了 技術優(yōu)勢， 具了穩(wěn)定性強和靈敏度高的特點，同時也因為它豐富的多態(tài)信息量（ 易操作性，是近幾年發(fā)展最快的 子標記技術。 術的應用 因表達特性的研究 析同其它 紋技術和基于 片技術比較，可直接地研究基因表達特性 (et 1999). (1996)利用己知表達模式的土豆貯藏蛋白 因驗證 術研究基因表達的可行性，證實它可用于研究基因的 時空表達模式。 將 于研究植物與病原間相互作用的關系，并且試圖闡明相互作用過程中基因表達的變化 (et 2000a;2000b)。 傳標記分析 (2000)利用 析木薯作圖群體的一對親本，獲得 500 多個它們分別在各自的親本中表達，對其中 50 個 行克隆和分析，并將部分標記定位于遺傳圖譜上。同時，對 傳作圖表明， 隨機 更多的多態(tài)性。另外， 可以用于遺傳群體分析，直接構建基因組范圍的轉錄圖譜， 到的差異克隆可直接作為一個遺傳標記用于遺傳分析中國農業(yè)科學院碩士學位論文 第一章 緒論 6 (， 2002)。 離特異表達的基因 分析基因表達差異，尋找分子標記最終的目的是為了分離基因以及研究該基因對于生物個體發(fā)育的影響。研究發(fā)現(xiàn)利用單酶切 術，比較普通牽牛白花、紅花兩個品系的花芽 得 2 個在兩個品種有不同擴增條帶的 段（ ，1997）。 (2000)利用 法分離了不同環(huán)境條件下，植物病原基因表達不同序列，并通過 交分析證明。進一步研究指出 比較在分離差異表達基因方面具有更高的可行性（ 1998 ）。利用傳統(tǒng)的 法，依賴于 與隨機引物間的 增， 3端的非編碼區(qū)也常被擴增，所以差異表達的序列包含的信息少，利用該片段所獲得的序列信息來分離基因非常困 難。相反 得我們最大可能地獲得編碼區(qū)的信息（李子銀， 1999；凌杏元， 2000）。 本研究的意義 黃瓜黑星病是一種重要的流行性病害，廣泛分布于歐洲、北美洲和東南亞一帶，在我國的東北、華北等省市都有發(fā)生 ,特別在東北三省是保護地黃瓜生產(chǎn)上的重要病害之一。 黃瓜黑星病的病原為瓜枝孢 (半枝菌亞門枝孢屬，菌絲白色至灰色，具分隔，分生孢子梗細長，叢生，褐色或淡褐色，頂部、中部有分枝或單枝，分生孢子圓柱形，近梭形，單生或串生，褐色或橄欖綠 色，光滑或具微刺。黃瓜整個生育期均可發(fā)生此病，其中以幼嫩部分易感病。 病原菌對寄主的破壞是通過各致病因子對寄主超微結構的影響來實現(xiàn)的。關于瓜枝孢菌侵染后寄主的病理變化前人已有一些研究 , 并推測纖維素酶在分解細胞壁中可能起重要作用。細胞壁降解酶和毒素是瓜枝孢菌在侵染黃瓜過程中重要的致病因子（ 李寶聚， 1999； 2000； 2001） ，這對瓜枝孢菌致病機理的認識具有重要的理論意義。 本課題組利用物理方法誘變篩選到幾個具有弱致病性的瓜枝孢 弱致病 菌株，并已經(jīng)證明瓜枝孢 弱致病 菌株具有致弱穩(wěn)定性和對黃瓜具有較好的誘導抗病 性，這種誘導抗病性作用也具有高穩(wěn)定性（ 關愛民， 2005） ，本文將在此研究的基礎上，利用 術，在表達水平上分析瓜枝孢 弱致病 菌株誘導黃瓜產(chǎn)生抗病性的時序表達進程，初步探討瓜枝孢 弱致病 菌株誘導黃瓜抗性的分子機制以及利用 術對瓜枝孢 弱致病 菌株進行了基因組分析，為獲得瓜枝 弱致病 菌株誘導黃瓜抗性的相關全長 而克隆相關基因以及深入探討其分子機制奠定基礎。 目前，蔬菜的種植條件有利于病害的發(fā)生與流行，一旦發(fā)病往往造成重大經(jīng)濟損失。并且當前蔬菜病害的防治技術水平低，手段單一，滿足 不了生產(chǎn)發(fā)展的需要，而使用化學農藥防治污染嚴重，且易導致病菌產(chǎn)生抗藥性。而抗性品種的育種手段繁雜，年限較長，抗性中國農業(yè)科學院碩士學位論文 第一章 緒論 7 品種的農藝性狀有待改良等。因此，生物防治已成為現(xiàn)今病害防治研究的熱點。用 弱致病 菌株誘導寄主植物產(chǎn)生對強菌侵