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X射線晶體衍射分析【摘要】：本文介紹了晶體衍射分析的原理并對X射線在晶體衍射中的應用及具體分析步驟進行了闡述。X射線晶體衍射分析能解析蛋白質晶體中原子在空間的位置與排列，迄今仍然是蛋白質和核酸三維結構測定的最主要方法，是精確測定蛋白質分子中每個原子在三維空間位置的工具。【關鍵詞】：X射線 晶體 衍射81. 引言任何物質均由原子離子或分子組成。晶體有別于非晶物質，它的內部所含原子離子或分子具有嚴格的三維有規(guī)則的周期性排列?？梢詮木w中取出一個基本單元，稱為之晶胞。晶體的周期性結構使晶體能對X射線中子流電子流等產生衍射效應，形成X射線衍射法.中子流衍射法.電子流衍射法。這些衍射法能獲得有關晶體結構可靠而精確的數據，其中最重要的是X射線晶體衍射法。1912年勞厄（M.von Laue）首先發(fā)現X射線可以被晶體衍射，開創(chuàng)了晶體結構分析的X射線衍射法。此后不久英國物理學家布拉格父子（W.H.Bragg和W.L.Bragg）在勞厄實驗的基礎上，導出了一個比較直觀的X射線衍射方程式，從而為X射線衍射理論和技術的發(fā)展奠定了堅實的基礎。X射線晶體衍射分析能解析蛋白質晶體中原子在空間的位置與排列，迄今仍然是蛋白質和核酸三維結構測定的最主要方法，是精確測定蛋白質分子中每個原子在三維空間位置的工具。2. X射線晶體衍射分析的發(fā)展史2.1 蛋白質晶體的第一個X射線圖像時Bernal和Crowfoot于1934年測定的，他們發(fā)現蛋白質分子含有豐富的結構信息。2.2 1954年由Perrtz等人證明重原子同晶置換（heavy atom isomorphous replacement）可以解決相應的問題，又經Blow和Crick加以發(fā)展，才解析了蛋白質的晶體結構。2.3 在1957年和1959年Kerdrew和Perutz分別獲得了肌紅蛋白和血紅蛋白的低分辨率（0.6nm和0.5nm）結構。2.4 在19571967年的10年里，溶菌酶、胰凝乳蛋白酶A、核糖核酸酶、核糖核酸酶S和羧肽酶也分別獲得了高分辨率的晶體結構。2.5 從20世紀60年代末進入70年代，X射線晶體衍射分析從對生物大分子三維結構測定進入生物大分子三維結構及其生物學功能之間關系的研究。2.6 現在，生物大分子晶體學已被應用到測定由許多生物大分子組成的極其復雜的大分子組裝體的晶體結構。3. X射線衍射分析原理3.1 X射線的產生 1912年勞埃等人根據理論預見，并用實驗證實了X射線與晶體相遇時能發(fā)生衍射現象，證明了X射線具有電磁波的性質，成為X射線衍射學的第一個里程碑。 3.2 X射線晶體衍射分析的理論依據X射線衍射分析是利用晶體形成的X射線衍射，對物質進行內部原子在空間分布狀況的結構分析方法。將具有一定波長的X射線照射到結晶性物質上時，X射線因在結晶內遇到規(guī)則排列的原子或離子而發(fā)生散射，散射的X射線在某些方向上相位得到加強，從而顯示與結晶結構相對應的特有的衍射現象。衍射X射線滿足布拉格（W.L.Bragg）方程：2d sin=n式中：是X射線的波長；是衍射角；d是結晶面間隔；n是整數。波長可用已知的X射線衍射角測定，進而求得面間隔，即結晶內原子或離子的規(guī)則排列狀態(tài)。將求出的衍射X射線強度和面間隔與已知的表對照，即可確定試樣結晶的物質結構，此即定性分析。從衍射X射線強度的比較，可進行定量分析。本法的特點在于可以獲得元素存在 的化合物狀態(tài)、原子間相互結合的方式，從而可進行價態(tài)分析，可用于對環(huán)境固體污染物的物相鑒定，如大氣顆粒物中的風沙和土壤成分、工業(yè)排放的金屬及其化合物（粉塵）、汽車排氣中鹵化鉛的組成、水體沉積物或懸浮物中金屬存在的狀態(tài)等等。4. X射線晶體衍射分析步驟X 射線晶體衍射分析主要包括以下幾個步驟：4.1 蛋白質單晶的制備制備蛋白質單晶常用氣相擴散法和平衡透析法氣相擴散法。前者是蛋白質晶中使用的標準方法，小體積比較合適，容易建立且易于監(jiān)測反應進度。通常的做法是“懸滴”，即在蛋白質溶液中加入濃度不足以沉淀蛋白質的“沉淀劑”。懸滴于一個大的含有沉淀劑的儲液槽相對，當把儲液槽封閉后，平衡時懸滴液內的蛋白質傾向于過飽和濃度，從而引發(fā)懸滴液內的蛋白質結晶。而平衡透析法，在具有高或低離子強度的蛋白質結晶中使用。在容器中用半透膜隔開小體積的蛋白質溶液和沉淀劑，沉淀劑慢慢促使隔間中的蛋白質溶液形成晶體。結構測定的精度依賴于晶體所能達到的衍射分辨率，所以獲得具有強衍射能力的晶體是蛋白質晶體結構測定分析的關鍵步驟，是蛋白質晶體結構分析的難點。4.2 衍射數據收集和處理衍射數據是晶體結構分析的基礎，衍射數據的好壞直接關系到結果的精度。好的衍射數據于晶體的好壞、X射線源的強度以及收集數據的儀器和方法有關。蛋白質晶體暴露于空氣中將解體，因為晶體中含水量相當高（20%70%），在收集數據前要將晶體密封于一種特殊的毛細管中?，F在常使用低溫冷凍晶體的方法來收集數據，蛋白質晶體快速冷凍魚液氮中，其結構不受影響，且蛋白質分子的熱運動降低，可以提供分辨率。對X射線衍射數據的收集和記錄裝置有兩大類：一類是使用對X射線敏感的照相底片或圖像板，另一類是計數管或面探測儀。他們都具有一定的自動化程度，但為了滿足結構基因組學研究的要求，還有待發(fā)展衍射數據收集的全自動化裝置。4.3 相位確定和改進相位確定是X射線晶體結構分析的核心。最基本的方法是同晶置換法，這是用于未知結構分析的最有效方法，另外還有分子置換法、差值電子密度法，以及目前發(fā)展很快的多波長反常散射法。晶胞的大小和形狀決定了晶體的衍射方向，反過來，通過衍射點的位置可以推算出晶胞參數和空間群，這叫做初步晶體學參數的測定。但晶胞中的原子種類以及它在晶胞中的分布位置決定了衍射線強度，反過來，通過衍射線強度和一些方法，可以了解相位信息，從而通過富里哀加和獲得電子密度函數，獲得原子在晶胞中的分布位置，這就是晶體結構測定的目的和結果。由電子密度函數確定的電子密度圖得質量及其后的可解釋性主要決定于相角的準確性。在某些情況下采用晶胞不對稱單元中等同部分的電子密度平均，有可能大大改善誤差較大的起始相角。4.4 電子密度圖的詮釋已知衍射線的結構振幅（強度）和相位，通過富里哀加和就可能計算電子密度圖。電子密度圖時晶體結構分析的直接結果，它包含了結構的全部信息，如何從一套電子密度圖分析出這些信息，尚有一系列問題需要解決。因為實驗每一步都有誤差，最后所有的誤差都會表現在電子密度圖上，在解釋電子密度圖之前有一些方法和原則改善電子密度圖，稱為電子密度圖的修飾。如溶劑平滑法（solvent flattering）、網格圖修飾法（histogram）。4.5 結構模型精化通過電子密度圖分析獲得的結構模型，還需要進行原子坐標的精化，結構精化主要使用的是限制性最小二乘修正。目前已經有一些全自動化的分析軟件用于結構修正，如：PROLSQ、XPLOR、TNT、CNS、BUSTER、REFMAC等。最后用實體模型或模型顯示系統將蛋白質空間結構顯示出來。5. X射線在晶體衍射分析中的應用X射線在結構分析中應用非常廣泛，現已滲透到物理、化學、礦物學、冶金學、地球科學和生命科學以及各種工程技術科學之內，成為一種重要的手段和分析方法，提供系統的結構信息。5.1 物相分析衍射圖晶體的射線衍射圖像實質上是晶體微觀結構的一種精細復雜的變換，每種晶體的結構與其射線衍射圖之間都有著一一對應的關系，其特征X射線衍射圖譜不會因為它種物質混聚在一起而產生變化，這就是射線衍射物相分析方法的依據。制備各種標準單相物質的衍射花樣并使之規(guī)范化，將待分析物質的衍射花樣與之對照，從而確定物質的組成相，就成為物相定性分析的基本方法。鑒定出各個相后，根據各相花樣的強度正比于改組分存在的量（需要做吸收校正者除外），就可對各種組分進行定量分析。目前常用衍射儀法得到衍射圖譜，用“粉末衍射標準聯合會（JCPDS）”負責編輯出版的“粉末衍射卡片（PDF卡片）”進行物相分析。5.2 點陣常數的精確測定點陣常數是晶體物質的基本結構參數，測定點陣常數在研究固態(tài)相變、確定固溶體類型、測定固溶體溶解度曲線、測定熱膨脹系數等方面都得到了應用。點陣常數的測定是通過X射線衍射線的位置（ ）的測定而獲得的，通過測定衍射花樣中每一條衍射線的位置均可得出一個點陣常數值。5.3 應力的測定X射線測定應力以衍射花樣特征的變化作為應變的量度。宏觀應力均勻分布在物體中較大范圍內，產生的均勻應變表現為該范圍內方向相同的各晶粒中同名晶面間距變化相同，導致衍射線向某方向位移，這就是X射線測量宏觀應力的基礎；微觀應力在各晶粒間甚至一個晶粒內各部分間彼此不同，產生的不均勻應變表現為某些區(qū)域晶面間距增加、某些區(qū)域晶面間距減少，結果使衍射線向不同方向位移，使其衍射線漫散寬化，這是X射線測量微觀應力的基礎。超微觀應力在應變區(qū)內使原子偏離平衡位置，導致衍射線強度減弱，故可以通過X射線強度的變化測定超微觀應力。測定應力一般用衍射儀法。5.4 晶粒尺寸和點陣畸變的測定若多晶材料的晶粒無畸變、足夠大，理論上其粉末衍射花樣的譜線應特別鋒利，但在實際實驗中，這種譜線無法看到。這是因為儀器因素和物理因素等的綜合影響，使純衍射譜線增寬了。純譜線的形狀和寬度由試樣的平均晶粒尺寸、尺寸分布以及晶體點陣中的主要缺陷決定，故對線形作適當分析，原則上可以得到上述影響因素的性質和尺度等方面的信息。主要方法有傅里葉法、線形方差法和積分寬度法。5.5 單晶取向和多晶織構測定單晶取向的測定就是找出晶體樣品中晶體學取向與樣品外坐標系的位向關系。雖然可以用光學方法等物理方法確定單晶取向，但X衍射法不僅可以精確地單晶定向，同時還能得到晶體內部微觀結構的信息。一般用勞埃法單晶定向，其根據是底片上勞埃斑點轉換的極射赤面投影與樣品外坐標軸的極射赤面投影之間的位置關系。透射勞埃法只適用于厚度小且吸收系數小的樣品；背射勞埃法就無需特別制備樣品，樣品厚度大小等也不受限制，因而多用此方法 。多晶材料中晶粒取向沿一定方位偏聚的現象稱為織構，常見的織構有絲織構和板織構兩種類型。為反映織構的概貌和確定織構指數，有三種方法描述織構：極圖、反極圖和三維取向函數，這三種方法適用于不同的情況。對于絲織構，要知道其極圖形式，只要求出求其絲軸指數即可，照相法和衍射儀法是可用的方法。板織構的極點分布比較復雜，需要兩個指數來表示，且多用衍射儀進行測定 。6X射線晶體衍射分析的發(fā)展近些年，蛋白質X射線晶體學無論從結構測定的方法，還是從結構測定所用的儀器上都有了飛躍的發(fā)展?？勺儾ㄩL的同步輻射加速器的應用使高分辨率、高質量的衍射數據的獲得變得較為容易。低溫技術的廣泛應用使冷凍后的蛋白質晶體在衍射過程中所受的輻射損害大為減少，從而減低了對晶體的要求并提高了數據質量。各種形式的面探測器和CCD的出現大幅度提高了數據收集速度和精度。而各種計算機硬件和軟件的發(fā)展更為晶體學的發(fā)展提供了強有力到了計算工具。如今，在相當程度上，蛋白質晶體學已成為一種常規(guī)的技術手段，它可在原子或接近原子的水平上分析蛋白質的精細三維結構。另外，X射線晶體衍射結構分析正努力在第四維時間坐標上跟蹤、分辨和描述生物大分子的結構變化，即所謂四維晶體結構的測定。由于同步輻射所提供的X射線光源可以達到很高強度，因而可以在一秒計的時間范圍收集一套完整的衍射數據，使得在以秒計的時間范圍內的結構動態(tài)測定成為可能。參考文獻【1】顏真，張英起. 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