畢業(yè)論文全文模板.doc

哈爾濱工業(yè)大學(xué)學(xué)士學(xué)位論文工學(xué)學(xué)士畢業(yè)論文幾丁質(zhì)對海洋生防酵母(Rhodosporidium paludigenum)抑菌活性的影響及相關(guān)機(jī)理的研究路來風(fēng)哈爾濱工業(yè)大學(xué)2010年6月食品科學(xué)與工程工學(xué)學(xué)士畢業(yè)論文幾丁質(zhì)對海洋生防酵母(Rhodosporidium paludigenum)抑菌活性的影響及相關(guān)機(jī)理的研究 導(dǎo)師：闞光鋒 申請學(xué)位級別：工學(xué)學(xué)士 學(xué)科、專業(yè)：食品科學(xué)與工程 所在單位：海洋學(xué)院 答辯日期：2010年6月 授予學(xué)位單位：哈爾濱工業(yè)大學(xué)A Thesis for the Degree of B. Eng Impact and Mechanism of Chitin on the Marine Yeasts Antibacterial ActivityCandidate：Laifeng LuSupervisor：Guangfeng KanAcademic Degree Applied for：Bachelor of EngineeringSpecialty：Food Science and EngineeringDate of Oral Examination：June, 2010University：Harbin Institute of Technology哈爾濱工業(yè)大學(xué)學(xué)士學(xué)位論文 摘要摘 要生物防治是采用微生物菌株或抗菌素類物質(zhì)，通過噴灑或浸漬果實(shí)處理，以降低或防治果實(shí)采后病害的保鮮方法。本實(shí)驗(yàn)通過利用酵母細(xì)胞壁組分之一幾丁質(zhì)誘導(dǎo)培養(yǎng)本實(shí)驗(yàn)室分離得到的拮抗菌株海洋酵母Rhodosporidium paludigenum Fell & Tallman（經(jīng)英國國際微生物所菌種保存和鑒定中心CABI Bioscience Identification Services鑒定為Rhodosporidium paludigenum Fell & Tallman）以提高其采后果實(shí)病害生物防治效果。結(jié)果如下：（1）體內(nèi)試驗(yàn)結(jié)果表明，幾丁質(zhì)誘導(dǎo)后，R. paludigenum的果實(shí)采后青霉病害生物防治效果得到顯著提高。（2）幾丁質(zhì)誘導(dǎo)提高R. paludigenum生防效力的最佳誘導(dǎo)濃度為1.0%（w/v），最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)時間為3648 h。此外，試驗(yàn)結(jié)果表明，幾丁質(zhì)誘導(dǎo)培養(yǎng)與NaCl誘導(dǎo)培養(yǎng)之間并不存在協(xié)同增效作用。（3）機(jī)理實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，幾丁質(zhì)誘導(dǎo)培養(yǎng)后，R. paludigenum在蘋果、梨果實(shí)傷口處的生長速度顯著提高，菌體數(shù)量顯著增加。（4）幾丁質(zhì)誘導(dǎo)培養(yǎng)后，R. paludigenum的發(fā)酵上清液對蘋果果實(shí)傷口處擴(kuò)展青霉的侵染有一定抑制作用。而未經(jīng)誘導(dǎo)R. paludigenum 的發(fā)酵上清液對蘋果果實(shí)傷口處擴(kuò)展青霉的侵染沒有抑制作用，反而有促進(jìn)效果。（5）果實(shí)誘導(dǎo)抗性試驗(yàn)結(jié)果表明，R. paludigenum能激發(fā)蘋果果實(shí)對青霉病害的抗性，而經(jīng)NYCB誘導(dǎo)培養(yǎng)的酵母能進(jìn)一步增強(qiáng)這種對果實(shí)抗性的誘導(dǎo)作用。其機(jī)理可能與激發(fā)蘋果果實(shí)傷口處組織的POD酶活性有關(guān)。綜上所述，幾丁質(zhì)誘導(dǎo)可以提高R. paludigenum的產(chǎn)后果實(shí)生物防治效果，其機(jī)理可能與誘導(dǎo)培養(yǎng)后，能促進(jìn)R. paludigenum在果實(shí)傷口處的生長、刺激酵母分泌抑菌物質(zhì)和增強(qiáng)酵母對果實(shí)抗性的誘導(dǎo)有關(guān)。關(guān)鍵詞： Rhodosporidium paludigenum；幾丁質(zhì)；誘導(dǎo)；生物防治I 哈爾濱工業(yè)大學(xué)學(xué)士學(xué)位論文 外文摘要ABSTRACTBiological control is a method that using microbial strains or antibiotic substances, by spraying or dipping, to decrease postharvest decay of fruits. We planned to use chitin (one of the yeast cell wall components) to co-culture with Rhodosporidium paludigenum Fell & Tallman isolated by our laboratory Colleague in marine yeast (Identified by CABI Bioscience Identification Services as Rhodosporidium paludigenum Fell & Tallman) to enhance the effectiveness of its biological control of postharvest decays of fruits. (1) In vivo test results showed that R. paludigenum induced by chitin can increase its biological control of postharvest diseases (BCPD) effect significantly. (2) The optimal concentration for induction was 1.0% (w/v), the optimal time for induction was 3648 hours. There was no collaborative effect between chitin and NaCl on the BCPD of R. paludigenum.(3) Data showed population and growth speed of R. paludigenum in wounds of apple and pear increased significantly.(4) Data showed that R. paludigenum cultured in medium with chitin had inhibitory effect to the decay of pears caused by Penicillium expansum， R. paludigenum cultured in NYDB has no inhibitory, but a promoting effect. (5) Through the induction of fruit resistance and associated biological control results showing that R. paludigenum could stimulate the resistance of fruits against the external infection. Meanwhile, chitin could improve their ability to inhibit the decay incidence and fruit resistance. The ability to stimulate fruits POD activity may be related.In conclusion, R. paludigenum induced by chitin could increase its BCPD effect. The promoting of R. paludigenums growth in fruit wounds, secreting of antimicrobial substances and induced resistance of fruit after being induced may be the mechanism.Key words: R. paludigenum; Chitin; Induction; BCPD哈爾濱工業(yè)大學(xué)學(xué)士學(xué)位論文 目錄目 錄摘 要ABSTRACT第一章 文獻(xiàn)綜述11.1 我國水果產(chǎn)業(yè)發(fā)展概述11.2 果蔬采后病害的侵染研究1 1.2.1 采后病原真菌的侵染方式1 1.2.2 采后病原真菌的致病機(jī)理21.3 果蔬采后病害的控制方法2 1.3.1 化學(xué)殺菌劑的使用3 1.3.2果實(shí)采后病害防治物理方法3 1.3.3果實(shí)采后病害生物防治41.4 采后拮抗酵母作用機(jī)制4 1.4.1營養(yǎng)和空間的競爭4 1.4.2重寄生作用5 1.4.3胞外活性物質(zhì)的產(chǎn)生5 1.4.4誘導(dǎo)抗性6 1.4.5抗生作用61.5 拮抗菌生理調(diào)控及機(jī)理的研究7 1.5.1逆境培養(yǎng)7 1.5.2拮抗物質(zhì)的分泌和積累8 1.5.3 基因工程技術(shù)的應(yīng)用81.6 本課題研究目的81.7 應(yīng)用前景和學(xué)術(shù)價值9第二章 海洋酵母R. paludigenum對果實(shí)采后真菌病害抑制效果研究102.1 前言102.2 實(shí)驗(yàn)材料和方法10 2.2.1 主要儀器10 2.2.2拮抗菌及其培養(yǎng)11 2.2.3 病原菌培養(yǎng)和孢子懸浮液的制備11 2.2.4 試劑11 2.2.5 果實(shí)選擇與預(yù)處理12 2.2.6 幾丁質(zhì)對R. paludigenum生防效果的影響12 2.2.7 數(shù)據(jù)處理分析與作圖132.3 結(jié)果13 2.3.1 不同濃度幾丁質(zhì)對R. paludigenum生防效力的影響13 2.3.2幾丁質(zhì)誘導(dǎo)后不同濃度R. paludigenum酵母的生防效果15 2.3.3 不同培養(yǎng)時間對幾丁質(zhì)誘導(dǎo)下R. paludigenum生防效力的影響17 2.3.4 幾丁質(zhì)與NaCl結(jié)合誘導(dǎo)對R. paludigenum生防效力的影響182.4 討論20第三章 海洋酵母R. paludigenum對果實(shí)采后真菌病害抑制機(jī)理研究223.1 前言223.2 實(shí)驗(yàn)材料和方法22 3.2.1 主要儀器22 3.2.2拮抗菌及其培養(yǎng)23 3.2.3 病原菌培養(yǎng)和孢子懸浮液的制備23 3.2.4 果實(shí)選擇與預(yù)處理23 3.2.5 幾丁質(zhì)對R. paludigenum生防機(jī)理的影響23 3.2.6 數(shù)據(jù)處理分析與作圖243.3 結(jié)果24 3.3.1幾丁質(zhì)對R. paludigenum在果實(shí)傷口處生長動態(tài)的影響24 3.3.2幾丁質(zhì)處理后R. paludigenum對果實(shí)誘導(dǎo)抗性的影響26 3.3.3幾丁質(zhì)處理后R. paludigenum發(fā)酵上清液的抑菌效果27 3.3.4 幾丁質(zhì)培養(yǎng)后R. paludigenum對果實(shí)POD酶活性的影響273.4 討論28第四章 結(jié)果與展望304.1 本論文的主要研究結(jié)果304.2 本實(shí)驗(yàn)的后續(xù)研究及展望30致謝32參考文獻(xiàn)33附 錄372哈爾濱工業(yè)大學(xué)學(xué)士學(xué)位論文 第一章 文獻(xiàn)綜述第一章 文獻(xiàn)綜述1.1 我國水果產(chǎn)業(yè)發(fā)展概述水果是維生素、礦物質(zhì)和膳食纖維的重要來源，是人們維持身體健康，增進(jìn)營養(yǎng)必不可少的主要食品，是世界上僅次于糧食的農(nóng)產(chǎn)品。中國是世界水果生產(chǎn)大國，總收獲面積和產(chǎn)量以及多種水果的產(chǎn)量均居世界首位。蔬菜、水果產(chǎn)業(yè)是我國國內(nèi)僅次于糧食產(chǎn)業(yè)的第二、第三大產(chǎn)業(yè)。2007年3月國家統(tǒng)計局發(fā)布的中華人民共和國2006年國民經(jīng)濟(jì)和社會發(fā)展統(tǒng)計公報顯示，2006年我國水果總產(chǎn)量為17050萬噸。據(jù)2010年初步統(tǒng)計，2009全國水果面積約1.6億畝，與上年基本持平，產(chǎn)量1.2億噸，同比增9。根據(jù)聯(lián)合國糧食組織對50多個國家的調(diào)查，發(fā)展中國家水果收獲后的平均損失率在30%以上。我國水果因采后處理技術(shù)落后，作為產(chǎn)量第一大國，水果腐爛損失也高居全球榜首。根據(jù)一般保守的估計，我國水果采后損失為20%30左右。據(jù)此估算，我國每年水果采后的經(jīng)濟(jì)損失將達(dá)到數(shù)百億元人民幣的水平。 導(dǎo)致果實(shí)采后損失的因素很多，主要包括：(1)由于采前栽培管理、采收和采后處理技術(shù)不當(dāng)而造成的損失；(2)由于果實(shí)采后水分和營養(yǎng)消耗造成的失重和枯萎等品質(zhì)劣變而引起的損失；(3)由于采后逆境造成的果實(shí)生理代謝失調(diào)而引起的損失；(4)由于采后成熟衰老造成果實(shí)組織結(jié)構(gòu)崩潰而引起的損失；（5）由于病原物侵染造成的腐爛損失等。 由各種病原物引起的植物病害每年都給各國經(jīng)濟(jì)造成重大的損失，其中又以真菌性病害最為嚴(yán)重。據(jù)估計，僅美國每年由真菌性病害造成的經(jīng)濟(jì)損失就達(dá)330億美元（Maor和Shirasu, 2005；Strange和Scott, 2005）。真菌也是引起采后果實(shí)病害的主要病原物（Sholberg和Conway，2004）。病原真菌不僅會造成果實(shí)數(shù)量上的巨大損失，而且許多病原真菌分泌產(chǎn)生的大量次生代謝產(chǎn)物還可能會引起嚴(yán)重的食品安全問題，如曲霉菌（主要是Aspergillums flavus和Aspergillums parasiticus等）產(chǎn)生的黃曲霉毒素、擴(kuò)展青霉（Penicillium expansum）產(chǎn)生的棒曲霉素（patulin）等（Martins et al., 2002；Sholberg和Conway, 2004；Dombrink-Kurtzman和Blackburn, 2005；Brodhagen和Keller，2006；Morales et al., 2007）。1.2 果蔬采后病害的侵染研究由真菌病害引起的果實(shí)采后的腐爛變質(zhì)是導(dǎo)致水果大量損失的主要原因之一。病原真菌不僅會造成果實(shí)數(shù)量上的巨大損失，而且許多病原真菌分泌產(chǎn)生的大量次生代謝產(chǎn)物還可能引起嚴(yán)重的食品安全問題。1.2.1 采后病原真菌的侵染方式采后病原真菌主要通過3種途徑或方式入侵果實(shí)：(1)通過機(jī)械傷或蟲害等造成的傷口；(2)通過自然開放的皮孔、氣孔、果實(shí)和花梗結(jié)合部位；(3)通過分泌寄主細(xì)胞壁水解酶等直接突破果實(shí)表皮的防御機(jī)制（Prusky和Lichter, 2007）。病原菌孢子一旦接觸傷口組織，侵染就開始了（Janisiewicz和Korsten, 2002；Prusky和Lichter, 2007）。而在沒有傷口等便利的入侵途徑的情況下，許多采后病原真菌的孢子可能會長時間潛伏在果實(shí)表面，直到果實(shí)成熟和衰老后才發(fā)起對果實(shí)的攻擊（Prusky和Lichter, 2007）。1.2.2 采后病原真菌的致病機(jī)理采后病原真菌具有眾多而且復(fù)雜的致病機(jī)理，但其最終目的都是成功的侵染寄主。病原真菌分泌產(chǎn)生的寄主細(xì)胞壁分解酶是研究較多、機(jī)理較為明確的重要致病因子，其主要包括多聚半乳糖醛酸酶（polygalacturonase）、果膠裂解酶（pectatelyase）、木聚糖酶（xylanases）、木糖苷酶（xylosidase）、蛋白酶（protease）、葡聚糖酶（glucanases）、漆酶（laccase）等(Snchez-Torres和Gonzlez-Candelas，2003；Akimitsu et al., 2004)。這些酶可能涉及病原真菌多方面的侵染機(jī)制和過程，如滲透、組織泡軟、營養(yǎng)獲得、改變寄主生理等（Snchez-Torres和Gonzlez-Candelas, 1996；Akimitsu et al., 2004）。1.2.2.1致病菌酸化果實(shí)組織P. expansum、P. digitatm 和P. italicum 等酸性病原真菌能產(chǎn)生檸檬酸和葡萄糖酸等有機(jī)酸，使寄主果實(shí)組織發(fā)生酸化，進(jìn)而促進(jìn)病原菌致病因子，如PG基因（pepgl）的表達(dá)（Prusky et al., 2004）。1.2.2.2致病因子CAT活性氧（Reactive Oxygen Species，ROS）在植物和微生物相互作用過程中具有重要作用（Torres et al., 2006)。最近，中科院植物所Qin等（2007）利用蛋白組學(xué)技術(shù)發(fā)現(xiàn)，硼酸鹽抑制擴(kuò)展青霉的機(jī)理與硼酸鹽抑制該真菌體內(nèi)參與清除ROS的過氧化氫酶（Catalase，CAT）及谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（Glutathione S-transferase）等有關(guān)，暗示擴(kuò)展青霉產(chǎn)生的CAT等可能也是該病原菌的一個致病因子。1.2.2.3病原菌破壞植物自身防御機(jī)制植物在遭到病原菌侵染時，通過體內(nèi)木質(zhì)素和羥脯氨酸糖的沉積，植物抗菌素的積累，蛋白質(zhì)酶抑制劑和溶菌酶的合成來增強(qiáng)細(xì)胞壁的保衛(wèi)反應(yīng)。另一方面，病原真菌在侵染過程中能誘導(dǎo)激發(fā)果實(shí)組織的形態(tài)和生理、分子水平發(fā)生顯著變化（Kim et al., 2001; Snchez-Torres and Gonzlez-Candelas, 2003）。目前的一些研究顯示，病原菌能夠刺激果實(shí)SOD、PAL、POD等與抗病性密切相關(guān)的酶活性，分解果實(shí)自身抗菌物質(zhì)，誘導(dǎo)果實(shí)幾丁質(zhì)酶和b-1,3-葡聚糖酶活性，以及刺激相關(guān)基因的表達(dá)（Yakoby et al., 2001）。1.3 果蔬采后病害的控制方法果蔬貯藏保鮮是果蔬生產(chǎn)減損、保值和增值的關(guān)鍵因素。特別是當(dāng)果蔬受到機(jī)械損傷后，病原菌更容易進(jìn)入傷口，導(dǎo)致病害的發(fā)生，所以有必要利用一些防治手段保護(hù)這些損傷位點(diǎn)，防止果蔬在儲運(yùn)過程中進(jìn)一步的腐爛變質(zhì)。根據(jù)國內(nèi)外的研究報道，控制采后病害非殺菌劑的方法主要可分為生物學(xué)方法、物理方法和化學(xué)方法 3 大類。1.3.1 化學(xué)殺菌劑的使用目前，化學(xué)殺菌劑是防治果蔬采后真菌病害的主要手段之一?；瘜W(xué)殺菌劑在全世界范圍廣泛使用，在歐洲和亞洲占農(nóng)藥市場的26%，但在美國只占6%。隨著國家經(jīng)濟(jì)發(fā)展和消費(fèi)水平的提高，人們對食品安全和環(huán)境保護(hù)意識的增強(qiáng)，化學(xué)殺菌劑的使用范圍越來越受到限制。有許多研究報道，化學(xué)殺菌劑具有一定的毒副作用。美國國家科學(xué)院（NAS）的報道（1987）指出，殺菌劑的應(yīng)用造成了人類健康的危害性，全美9種致瘤化合物的銷售量占所有殺菌劑的90%左右，在用于食品的全部農(nóng)藥中，殺菌劑構(gòu)成60%的致癌危險。這一報道導(dǎo)致了幾種殺菌劑如克菌丹（Captan）和苯菌靈（Benomyl）等被美國環(huán)保機(jī)構(gòu)所禁用，并部分或全部的自動退出采后應(yīng)用市場。此外由于長期使用殺菌劑，病原菌進(jìn)化并產(chǎn)生了大量抗藥性菌種。因此，找到一種新的安全的可以替代化學(xué)殺菌劑，控制果蔬采后病害的新方法具有非常重要的意義。1.3.2果實(shí)采后病害物理防治果蔬采后病害防治物理方法主要有：熱處理；低溫冷藏；微波處理；氣調(diào)；輻射處理；低壓處理。低溫冷藏技術(shù)已經(jīng)在部分地區(qū)得到實(shí)際運(yùn)用，熱殺菌和輻照殺菌也是目前報道比較多的方法。低溫冷藏是一種常用的保鮮技術(shù)。近幾年來，低溫冷藏技術(shù)又有新的發(fā)展，采用臨界點(diǎn)低溫高濕存儲，即控制在物料冷害點(diǎn)溫度以上0.51和相對濕度為9098的環(huán)境中存儲保鮮果蔬。果蔬果實(shí)在不發(fā)生冷害的前提下，采用盡可能低的溫度可以有效地控制果蔬果實(shí)在貨架期內(nèi)的呼吸強(qiáng)度，使某些容易腐爛的果實(shí)處于休眠狀態(tài)；其次采取相對高濕的環(huán)境可有效降低果蔬水分蒸發(fā)而減少失重（劉憶冬等，2005）。冷藏技術(shù)最大的局限性在于低溫只能抑制病原菌，不能根除，而且一些熱帶、亞熱帶果蔬果實(shí)在低溫下冷害情況嚴(yán)重（任紅等，2007）。由于低溫貯藏、輻照處理和熱處理等物理方法都需要特定的設(shè)備，這些方法在執(zhí)行起來受到成本、產(chǎn)地、運(yùn)輸條件等限制。目前，在經(jīng)濟(jì)發(fā)達(dá)地區(qū)，低溫貯藏鏈結(jié)合化學(xué)殺菌劑是比較成熟的商業(yè)采后處理技術(shù)。1.3.3果實(shí)采后病害生物防治從可持續(xù)發(fā)展的角度出發(fā)，開發(fā)新型、高效且安全的有機(jī)、綠色的保鮮劑具有重大的社會意義和廣闊的應(yīng)用前景。例如在美國，有機(jī)產(chǎn)品的產(chǎn)值已從1997年的35.7億美元增長到了2005年145億美元（Prange et al., 2006）。利用安全且有拮抗病原菌活性的微生物進(jìn)行生物防治的方法近10年來已經(jīng)取得了突破性的進(jìn)展，被認(rèn)為是最有希望替代化學(xué)殺菌劑的方法之一（Janisiewicz和Korsten,2002）。目前已經(jīng)有4個基于拮抗微生物的生物防腐劑產(chǎn)品：Aspire（基于拮抗酵母Candida oleophila，美國），Yield Plus（基于拮抗酵母Cryptococcus albidus，南非），Bio-Save 10LP（基于拮抗細(xì)菌Pseudomonas syringae strain，美國）和Avogreen（基于拮抗細(xì)菌Bacillus subtilis，南非）（Janisiewicz和Korsten，2002；Fravel，2005）。利用拮抗酵母進(jìn)行水果采后病害的生物防治具有許多其他方法無法比擬的優(yōu)點(diǎn)：如遺傳穩(wěn)定，抑菌譜廣，效價高；一般不產(chǎn)生對人和寄主有害的代謝產(chǎn)物，安全性高；對營養(yǎng)要求低，生長快；對多種脅迫、逆境具有較強(qiáng)的耐受力，對大多數(shù)殺菌劑不敏感，能與多種化學(xué)和物理方法相容等（Janisiewicz和Korsten, 2002；Spadaro和Gullino, 2004）。它對于保護(hù)生態(tài)環(huán)境、減少食品農(nóng)藥殘留、保障公眾健康具有重要意義，因此成為當(dāng)前國內(nèi)外的研究熱點(diǎn)。1.4 采后拮抗酵母作用機(jī)制根據(jù)已有的研究結(jié)果顯示，微生物對病原菌有直接作用和間接作用兩種方式，直接作用包括抗生作用和重寄生作用，間接作用包括營養(yǎng)和空間的競爭，胞外活性物質(zhì)的產(chǎn)生和誘導(dǎo)抗性等。生防通常是一個以上的機(jī)制共同作用的結(jié)果。1.4.1營養(yǎng)和空間的競爭為了抑制病原菌的侵染, 拮抗菌必須在病原菌到達(dá)以前或到達(dá)以后的很短時間內(nèi)在果實(shí)表面侵染部位占據(jù)優(yōu)勢。拮抗菌與病原菌爭奪的營養(yǎng)物質(zhì)主要是碳水化合物、氮源等。Filonow（1998）用14C標(biāo)記的果糖、葡萄糖、蔗糖檢驗(yàn)在蘋果傷口處的拮抗菌羅倫隱球酵母（C. laurentii）、擲抱酵母（S. roseus）與病原菌灰葡萄孢孢子在營養(yǎng)利用上的差別，發(fā)現(xiàn)拮抗菌攝取和利用14C果糖的量越大，對分生孢子萌發(fā)的抑制作用越強(qiáng)，說明營養(yǎng)競爭是重要的生防機(jī)制。在對E. herbicola B66和B90抑制蘋果青霉病和灰霉病的研究中發(fā)現(xiàn)，在稀釋的蘋果汁中，B66和B90能抑制灰葡萄孢和擴(kuò)展青霉分生孢子的萌發(fā)并溶解其萌發(fā)管（Sobiczewski et al, 1996），但在未稀釋的蘋果汁里這些反應(yīng)并不明顯，說明營養(yǎng)競爭在這里起到了非常重要的作用。在國內(nèi)，范青等的研究也發(fā)現(xiàn)將季也蒙畢赤酵母（P. guilliermondii）接種到桃果實(shí)的傷口上，在有病菌存在時該拮抗酵母菌的數(shù)量一天內(nèi)可以猛增200多倍，這種高速的繁殖活動反映出拮抗菌與病原菌之間的營養(yǎng)競爭。Janisiewicz等（1992）報道在蘋果等果實(shí)傷口處，糖類營養(yǎng)物質(zhì)非常豐富，而作為氮源的氨基酸等則相對貧乏，成為競爭的焦點(diǎn)，通過向蘋果傷口加入拮抗菌容易利用而病原菌難以利用的L-天冬氨酸和L-脯氨酸能顯著提高拮抗效果。此外，酵母分泌的胞外多糖也能促進(jìn)果實(shí)表面的粘結(jié)作用從而在空間競爭上占據(jù)優(yōu)勢(Andrews et al., 1994)。已有的研究結(jié)果顯示，生防菌在果實(shí)傷口處接種越早，其對果蔬采后病原菌的抑制效果越好（Chand-Goyal and Spotts, 1997; Fan and Tian, 2001）。這也反映了營養(yǎng)與空間的競爭可能是海洋酵母抑制致病原菌的重要機(jī)理之一。營養(yǎng)和空間的競爭還被認(rèn)為對病原真菌的次級代謝有作用（Bjornberg and Schnurer, 1993; Chand-Goyal and Spotts, 1996）。環(huán)境營養(yǎng)對病原菌的次級代謝，包括真菌毒素的產(chǎn)生具有重要影響（Luchese and Harrigan, 1996）。這可能是一些酵母拮抗菌能在體外試驗(yàn)中抑制霉菌菌絲生長的原因之一。比如Petersson和Schnurer（1995）發(fā)現(xiàn)P. anomala能在體外試驗(yàn)中減少P. roquefortii和亮白曲霉(Aspergillums candidus)的數(shù)量。1.4.2重寄生作用許多酵母拮抗菌可以分泌胞外水解酶（幾丁酶，-1,3-葡聚糖酶等），從而分解病原菌的細(xì)胞壁或菌絲體。Gravese等（1998）報道P. anomala K對抑制蘋果灰霉病非常有效，因?yàn)榛移咸焰呒?xì)胞壁能誘導(dǎo)其在蘋果傷口上分泌的胞外-1,3-葡聚糖酶的量增加3倍。出芽短梗霉（A. pullulans）能顯著抑制蘋果等水果采后多種病原菌，Castoria R和Ippolito A等（2001）在出芽短梗霉（A. pullulans）處理過的蘋果傷口上檢測到了濃度更高的-1,3-葡聚糖酶和幾丁酶活性。拮抗菌的快速定植和水果本身酶的誘導(dǎo)作用可能導(dǎo)致了胞外溶解酶的數(shù)量增加。但需要進(jìn)一步研究這些酶的來源及其在生物防治中的作用。某些酵母菌還可以附著在病原菌上，形成對病原菌的直接寄生作用。Arras（1996）用電鏡觀察到拮抗菌無名假絲酵母(C. famata)可以在病菌菌絲上定植，并促使菌絲裂解。EI-Ghaouth（2000）發(fā)現(xiàn)拮抗菌C. saitoana在蘋果傷口處可以緊緊吸附在灰葡萄孢的菌絲上。這些吸附現(xiàn)象不能完全說明在拮抗菌與病原菌之間有重寄生作用，但可以肯定這種現(xiàn)象與拮抗菌的生理活動緊密聯(lián)系，因?yàn)榻?jīng)過熱殺死的拮抗菌不再有吸附現(xiàn)象發(fā)生。1.4.3胞外活性物質(zhì)的產(chǎn)生一些研究結(jié)果顯示，拮抗菌與病原菌互作時, 在果實(shí)傷口部位生長的酵母細(xì)胞外圍有大量的新生物質(zhì)。這些胞外活性物質(zhì)可能參與了拮抗菌與病原菌之間的相互作用（表1.1）。抗生素名稱產(chǎn)生菌株針對病原菌蒿屬香豆素、東莨菪亭無名假絲酵母(C. famata)指狀青霉毒性蛋白(killer protein)畢赤酵母屬(Pichia sp.)抗細(xì)菌物質(zhì)羅倫隱球酵母（C. laurentii）熒光假單胞菌、Staphylococcus aureus揮發(fā)性物質(zhì)乳酸克魯維酵母(Kluyveromyces lactis)擴(kuò)展青霉表1.1 主要產(chǎn)胞外物質(zhì)菌株1.4.4誘導(dǎo)抗性近5年來，拮抗菌誘導(dǎo)采后果實(shí)抗性成為了生物防治的研究熱點(diǎn)。已有的大量研究表明，多種生防菌，包括出芽短梗霉（A. pullulans）、C. saitoana、C. oleophila、膜醭畢赤酵母（P. membranefaciens）和羅倫隱球酵母（C. laurentii）等均能誘導(dǎo)多種果實(shí)的抗性及抗性相關(guān)反應(yīng)，提高果實(shí)自身抗性，減少采后腐爛（表1.2）（Filonow, 1999, 2001; Ippolito et al., 2000）。生防菌作為激發(fā)子，具有生物可降解和性價比高等優(yōu)良特點(diǎn)，因此具有良好的應(yīng)用前景。1.4.5抗生作用通過拮抗菌產(chǎn)生抗生素抑制病原菌作用是人們最早發(fā)現(xiàn)的一種拮抗機(jī)理，也是大多數(shù)拮抗細(xì)菌最主要的機(jī)制之一（表1.3）（Janisiewicz and Roitman, 1988; Janisiewicz et al., 1991）。但是，在體外試驗(yàn)中能產(chǎn)生抗生素的菌株中很大一部分不能在體內(nèi)試驗(yàn)中產(chǎn)生抑菌效果，這是由兩方面的原因造成的：有些細(xì)菌只能在“in vitro”環(huán)境中產(chǎn)生抗生素，而在“in vivo”則不產(chǎn)生抗菌素；一些細(xì)菌不適應(yīng)寄主傷口的環(huán)境，不能存活或生命力下降，因此不能產(chǎn)生很好的拮抗效果。而且能在寄主上保持拮抗能力的細(xì)菌仍具有兩個弊病：首先，抗生素有可能誘導(dǎo)病原菌產(chǎn)生抗性，從而逐步降低拮抗菌對病害的控制效果；其次，拮抗菌產(chǎn)生的抗生素對食用者也可能產(chǎn)生不利影響。因此進(jìn)入20世紀(jì)90年代以后，拮抗菌的研究重點(diǎn)逐步從拮抗細(xì)菌轉(zhuǎn)向了拮抗酵母。表1.2 采后拮抗菌對果實(shí)抗性的誘導(dǎo)及對抗性相關(guān)反應(yīng)的刺激果實(shí)拮抗菌備注蘋果出芽短梗霉C. saitoana刺激果實(shí)幾丁質(zhì)酶、葡聚糖酶和POD誘導(dǎo)抗性，并刺激果實(shí)幾丁質(zhì)酶、b-1,3-葡聚糖酶分泌b-1,3-葡聚糖酶柚子柑橘C. oleophila誘導(dǎo)抗性，并刺激果實(shí)乙烯、PAL, 幾丁質(zhì)酶、b-1,3-葡聚糖酶、積累植保素等刺激果實(shí)硫還原蛋白基因表達(dá)刺激幾丁質(zhì)酶cDNA的表達(dá)刺激b-1,3-內(nèi)葡聚糖酶基因表達(dá)草莓出芽短梗霉誘導(dǎo)抗性櫻桃番茄膜醭畢赤酵母刺激果實(shí)POD，降低CAT和SOD，提高總蛋白，增強(qiáng)33和47kDa 蛋白刺激果實(shí)幾丁質(zhì)酶、b-1,3-葡聚糖酶桃、梨、棗、蘋果羅倫隱球酵母誘導(dǎo)果實(shí)抗性；刺激果實(shí)幾丁質(zhì)酶、b-1,3-葡聚糖酶、POD和PAL活性刺激果實(shí)b-1，3-葡聚糖酶基因表達(dá)表1.3 主要產(chǎn)抗生素菌株抗生素名稱產(chǎn)生菌株作用對象病原菌伊枯草菌素枯草芽孢桿菌B-3核果類水果M. fructicola吡咯菌素洋蔥假單胞菌(P. cepacia) LT-4-12W梨果、柑橘核果類水果擴(kuò)展青霉、灰葡萄孢丁香霉素E丁香假單胞桿菌ESC-10和ESC-11（BioSave）檸檬吡喃酮木霉草莓、蘋果灰葡萄孢1.5拮抗菌生理調(diào)控及機(jī)理的研究近年來，隨著拮抗菌和病原菌之間的細(xì)胞學(xué)、生物化學(xué)和分子生物學(xué)研究的不斷深入發(fā)展，研究者發(fā)現(xiàn)通過調(diào)節(jié)采后拮抗酵母的生理代謝機(jī)制可能是增強(qiáng)其拮抗能力的有效途徑之一（Janisiewicz和Korsten, 2002）。根據(jù)有限的已發(fā)表資料，關(guān)于采后拮抗菌生理調(diào)控及機(jī)理的研究可概括為以下三個方面：1.5.1逆境培養(yǎng)Teixid等（1998）研究表明通過低水分活度培養(yǎng)Candida sake后其在采前使用時生長數(shù)量明顯增加并增強(qiáng)了酵母的拮抗效力，其機(jī)理與積累糖醇和海藻糖有關(guān)；Bonaterra 等（2005）報道在培養(yǎng)基中添加NaCl后能提高P. agglomerans EPS125在不同濕度貯藏條件下的生防效力，作用機(jī)制也與拮抗菌體內(nèi)海藻糖等物質(zhì)的積累有關(guān)。西班牙XaRTA-postharvest實(shí)驗(yàn)室的研究者發(fā)現(xiàn)經(jīng)鹽脅迫誘導(dǎo)培養(yǎng)的P. agglomerans CPA-2在冷凍干燥或噴霧干燥后，細(xì)胞的存活率比未經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)的菌株有顯著的提高，且凍干粉單獨(dú)使用或結(jié)合佐劑Fungicover使用，對果實(shí)病害的抑制效果均顯著高于未經(jīng)脅迫的新鮮酵母。1.5.2拮抗物質(zhì)的分泌和積累阿根廷學(xué)者發(fā)現(xiàn)粘紅酵母（Rhodotorula glutini)產(chǎn)生的一種酸（rhodotorulic acid）能抑制許多病原真菌，而且發(fā)現(xiàn)整合使用rhodotorulic acid和該粘紅酵母能增強(qiáng)其對果實(shí)病害的控制（Calvente et al., 2001；Sansone et al., 2005）。Li等（2006，2007）報道通過海藻糖培養(yǎng)羅倫隱球酵母（C. laurentii）后能在該酵母細(xì)胞內(nèi)積累較高水平的海藻糖，并發(fā)現(xiàn)經(jīng)過這種處理后羅倫隱球酵母控制蘋果青霉病的效力顯著增強(qiáng)，同時發(fā)現(xiàn)這種處理還能提高該酵母在凍干后的存活率。1.5.3基因工程技術(shù)的應(yīng)用利用分子生物學(xué)和基因工程的手段研究拮抗菌的遺傳背景并開展相應(yīng)分子水平的改造是生物防治領(lǐng)域的一個研究熱點(diǎn)，通過基因工程技術(shù)轉(zhuǎn)化具有抑制病原真菌活性的蛋白和代謝產(chǎn)物也是提高拮抗酵母效力的重要途徑（Janisiewicz和Korsten，2002），但其前提是拮抗微生物遺傳背景的明確、轉(zhuǎn)化方法的建立和轉(zhuǎn)化目標(biāo)的確定等。近年來國際上已有研究采后拮抗酵母的分子特征和利用基因工程改造采后生物防治酵母的研究報道，但總體上成功的報道還很有限。1.6 本課題研究目的近年來，采后生物保鮮劑的發(fā)展遇到了瓶頸。現(xiàn)在全球只有幾種基于拮抗酵母的生物保鮮劑。而原有的兩種基于酵母的生防制劑Aspire TM（Ecogen，US）和YieldPlus（South Africa）已經(jīng)退出了生物保鮮劑的市場。拮抗酵母生防制劑商品化發(fā)展緩慢主要有兩個原因。一是拮抗酵母單獨(dú)作用時，效果還無法與化學(xué)殺菌劑相比，二是采后貯藏是一個長期的過程，酵母制劑的生防效果和貨架壽命受到了采收、處理、包裝和銷售等多個環(huán)節(jié)諸多因素的影響（Janisiewicz et al., 2002；Spadaro et al., 2004）。本試驗(yàn)?zāi)康氖墙鉀Q瓶頸問題之一，探討通過在培養(yǎng)基中添加幾丁質(zhì)等培養(yǎng)酵母R. paludigenum提高其拮抗效力的可行性，以提高酵母的生防效果。研究幾丁質(zhì)誘導(dǎo)后R. paludigenum對蘋果、梨采后主要真菌病害擴(kuò)展青霉（P. expansum）體內(nèi)的抑制效果，篩選出最佳誘導(dǎo)劑量及誘導(dǎo)時間，并結(jié)合其他誘導(dǎo)因子為蘋果、梨采后病害提供一種安全、經(jīng)濟(jì)有效的防治方法，并對可能存在的相關(guān)機(jī)理，包括促進(jìn)酵母菌生長、分泌抗菌物質(zhì)和誘導(dǎo)抗性等進(jìn)行系統(tǒng)研究。1.7應(yīng)用前景和學(xué)術(shù)價值利用拮抗酵母對水果采后病害進(jìn)行生物防治是目前國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)，其對于保護(hù)生態(tài)環(huán)境、減少食品農(nóng)藥殘留、保障公眾健康具有重要意義。但是要實(shí)現(xiàn)拮抗酵母的商業(yè)化推廣應(yīng)用，迫切需要解決的問題是提高其生物學(xué)效力。利用病原真菌細(xì)胞壁制品是研究采后拮抗酵母機(jī)理的重要方法之一，特別是對拮抗酵母分泌幾丁質(zhì)酶和-l,3-葡聚糖酶等水解酶機(jī)理的研究（Saligkarias et al., 2002；Bar-Shimon et al., 2004），這暗示著可以通過細(xì)胞壁的組分來刺激、誘導(dǎo)酵母分泌這些水解酶，從而提高其拮抗效力。本實(shí)驗(yàn)的順利實(shí)施，可為系統(tǒng)全面地提高拮抗酵母的生防活性提供一個新的有效途徑，促進(jìn)其進(jìn)一步邁向商業(yè)化推廣應(yīng)用。同時通過減少果實(shí)的腐爛，降低資源浪費(fèi)，減少經(jīng)濟(jì)損失，通過拮抗酵母代替化學(xué)殺菌劑的使用，促進(jìn)農(nóng)村和農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)向環(huán)境友好、生態(tài)健康的方向發(fā)展，因此本項(xiàng)目不僅具有廣闊的經(jīng)濟(jì)應(yīng)用前景，而且具有巨大的社會效益和生態(tài)效益。為通過幾丁質(zhì)及其衍生物等酵母細(xì)胞壁組分誘導(dǎo)拮抗酵母，提高其拮抗效力建立理論基礎(chǔ)。38哈爾濱工業(yè)大學(xué)學(xué)士學(xué)位論文 第二章 海洋酵母R. paludigenum對果實(shí)采后真菌病害抑制效果研究第二章 海洋酵母R. paludigenum對果實(shí)采后真菌病害抑制效果研究2.1 前言生物防治是采用微生物菌株或抗菌素類物質(zhì)，通過噴灑或浸漬果實(shí)處理，以降低或防治果實(shí)采后病害的保鮮方法。近年來，果蔬采后病害生物防治的研究重點(diǎn)是酵母菌。酵母菌與其他生防菌相比，具有以下優(yōu)點(diǎn)：（1）不產(chǎn)生抗菌素，長期使用不會使病原菌對抗菌素產(chǎn)生抗性而降低生物防治效果，還可以避免某些抗生素對人體潛在的不良影響；（2）酵母菌能在貧乏營養(yǎng)環(huán)境中快速增殖，干燥情況下可在果蔬表面定殖并存活相當(dāng)長的時間，能耐受低溫等不良環(huán)境；（3）大多數(shù)酵母菌可與一些食品添加劑（鈣鹽、鈉鹽、EDTA等）結(jié)合使用，并且能夠耐受一些低劑量化學(xué)殺菌劑（涕必靈等），從而減少化學(xué)殺菌劑的使用量，提高生防效果。幾丁質(zhì)（Chitin），又稱甲殼素，廣泛分布于蝦蟹殼、軟體動物的外殼與內(nèi)骨骼，節(jié)肢動物的外骨骼及真菌、酵母菌等微生物細(xì)胞壁中。幾丁質(zhì)不僅資源豐富，而且具有多種重要的生物學(xué)特性，因此幾丁質(zhì)的開發(fā)利用深受國內(nèi)外的關(guān)注（Synowiecki和Al-Khateeb,2003；Prashanth和Tharanathan, 2007）。 本實(shí)驗(yàn)中所用到的生防酵母為，從中國東海近海海域中分離篩選到的一株對果蔬采后病害具有較好抑制效果的海洋酵母，經(jīng)英國國際微生物所菌種保存和鑒定中心（CABI Bioscience Identification Services）鑒定為Rhodosporidium paludigenum Fell & Tallman （1984）。用R. paludigenum干粉制劑進(jìn)行了食品級小鼠急性經(jīng)口毒性實(shí)驗(yàn)，初步確定該制劑屬于實(shí)際無毒類。本實(shí)驗(yàn)主要研究幾丁質(zhì)誘導(dǎo)后R. paludigenum對蘋果、梨采后主要真菌病害擴(kuò)展青霉（P. expansum）體內(nèi)的抑制效果，篩選出最佳誘導(dǎo)劑量及誘導(dǎo)時間，并結(jié)合其他誘導(dǎo)因子為蘋果、梨采后病害提供一種安全、經(jīng)濟(jì)有效的防治方法。2.2 實(shí)驗(yàn)材料和方法2.2.1 主要儀器TH-3560全自動滅菌鍋 造鑫(TSAO HSIN)企業(yè)有限公司 SW-CJ-1F超凈工作臺 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司SIGMA 3K-15離心機(jī) 德國希格瑪（SIGMA）公司QYC-211全溫空氣搖床 上海?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司Sartrious電子天平 北京賽多利斯天平有限公司200 ml、1000 ml、5ml移液器 德國Eppendorf 公司 血球計數(shù)板（2516） 上海醫(yī)用光學(xué)儀器廠光學(xué)顯微鏡 日本奧林巴斯有限公司LRH-250生化培養(yǎng)箱 上海一恒科技有限公司2.2.2拮抗菌及其培養(yǎng)2.2.2.1 拮抗菌Rhodosporidium paludigenum，分離自中國東海近海海域，并經(jīng)英國國際微生物所菌種保存和鑒定中心（CABI Bioscience Identification Services）鑒定。菌種在4下保存于NYDA（葡萄糖10 g，牛肉浸膏8 g，酵母粉5 g，瓊脂20 g，定容至1000 ml蒸餾水中，121下滅菌20 min）斜面培養(yǎng)基中。2.2.2.2酵母誘導(dǎo)培養(yǎng)保存的酵母菌種首先在NYDA斜面培養(yǎng)基中進(jìn)行活化，劃線接種后置于培養(yǎng)箱中28培養(yǎng)48 h，重復(fù)傳代兩次；活化好的酵母用接種環(huán)挑取一菌環(huán)接入NYDB種子培養(yǎng)基中，在200 rpm、28條件下培養(yǎng)24 h；將2 ml上述種子培養(yǎng)基分別接入NYDB和加入一定量幾丁質(zhì)粉末的NYDB培養(yǎng)基中（記為NYCB），在200 rpm、 28 條件下培養(yǎng)一定時間；發(fā)酵液在4000 rpm條件下離心510 min收集酵母細(xì)胞，并用無菌水洗滌2次以充分除去培養(yǎng)基，上清液用0.45 m微孔濾膜過濾除菌后備用。2.2.3 病原菌培養(yǎng)和孢子懸浮液的制備2.2.3.1 病原菌病原菌為擴(kuò)展青霉（Penicillium expansum），購買自中國科學(xué)院微生物研究所菌種保藏中心，菌種在4下保存于PDA（去皮馬鈴薯200 g，加水煮沸20 min，過濾后在濾液中加入葡萄糖20 g、瓊脂20 g，定容至1000 ml蒸餾水中，121下滅菌20 min）斜面培養(yǎng)基中。2.2.3.2 病原菌菌懸液的制備從病原菌保存斜面中挑取適量的霉菌孢子，在PDA斜面上劃線，置于培養(yǎng)箱中，在28培養(yǎng)7 d后，用接種環(huán)在培養(yǎng)好的霉菌試管斜面上刮取適量孢子，轉(zhuǎn)移到適量0.05吐溫-20（tween-20）溶液中，用血球計數(shù)板計數(shù)，并用0.05吐溫-20溶液調(diào)整至5104個/ml，待用(Zhang et al., 2003; Feng and Zheng, 2007)。2.2.4 試劑幾丁質(zhì)（Chitin）為生化純試劑，使用前先研磨，并用100目篩網(wǎng)過濾后備用。2.2.5 果實(shí)選擇與預(yù)處理試驗(yàn)所用果實(shí)為正常商業(yè)成熟度的蘋果 (Malus domestica)果實(shí)，品種為紅富士；梨（Pyrus pyrifolia Nakai）果實(shí)，品種為水晶。選取外觀飽滿，無機(jī)械傷口、無病蟲害、無感染，大小和成熟度均勻一致的果實(shí)進(jìn)行試驗(yàn)，用0.1%次氯酸鈉溶液浸泡消毒12 min、用自來水沖洗、并在室溫下放干（2025）后備用。2.2.6 幾丁質(zhì)對R. paludigenum生防效果的影響2.2.6.1 不同濃度幾丁質(zhì)對拮抗酵母生防活性的影響酵母活化和液體培養(yǎng)、菌體收集同2.2.2.2，幾丁質(zhì)濃度取0.1%、0.2%、1.0%和2.0%（w/v），二代液體培養(yǎng)時間為24 h，所得酵母細(xì)胞懸浮液用血球計數(shù)板計數(shù)后配制成所需濃度備用。在試驗(yàn)果實(shí)的表面用無菌打孔器制造大小和深度統(tǒng)一的傷口（大約直徑為5 mm，深度為3 mm），每個傷口處分別加入50 l下述液體（1）無菌水（作為對照）；（2）在NYDB中培養(yǎng)的R. paludigenum懸浮液（1108 cells/ml）；（3）在幾丁質(zhì)濃度分別為0.1%、0.2%、1.0%和2.0%（w/v）的NYCB中培養(yǎng)的R. paludigenum懸浮液（1108 cells/ml）。2 h后，在每個傷口處加入30 l的P. expansum孢子懸浮液，濃度為1104 cells/ml。用PE塑料膜密封作保濕處理，并在室溫（2025）下貯藏，每天定時記錄病害發(fā)生情況和病斑直徑，結(jié)果以發(fā)病率（%）和病斑直徑（mm）表示。每處理3個平行，每平行包括12個果實(shí)。2.2.6.2 幾丁質(zhì)誘導(dǎo)后不同濃度R. paludigenum酵母的生防效果用消過毒的打孔器在每個果實(shí)表面形成統(tǒng)一大小和深度的傷口。每個傷口處等量（50 l）加入：（1）NYDB 培養(yǎng)基培養(yǎng)的 R. paludigenum 懸浮液（106、107、108 cells/ml）；（2）NYDB 培養(yǎng)基中添加幾丁質(zhì)培養(yǎng)的 R. paludigenum 懸浮液（106、107、108cells/ml）；（3）無菌水（作為對照）。2 h后在每個傷口加入等量（30 l）的 P. expansum 孢子懸浮液，濃度為1104 spores/ml。處理完畢后在常溫下（20-25）貯藏，并用 PE 塑料膜密封作保濕處理。每天定時對果實(shí)傷口處病害發(fā)生和發(fā)展情況進(jìn)行觀察和記錄，結(jié)果以平均病害發(fā)生率（%）和平均病斑直徑（mm）表示。每處理重復(fù)3次，每個重復(fù)12個果實(shí)。整個實(shí)驗(yàn)重復(fù) 2 次以上。2.2.6.3 不同培養(yǎng)時間對幾丁質(zhì)誘導(dǎo)拮抗酵母生防活性的影響酵母活化和液體培養(yǎng)、菌體收集同2.2.2.2，幾丁質(zhì)濃度取1.0%（w