【畢業(yè)學(xué)位論文】（Word原稿）調(diào)控大豆抗逆反應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子基因的分離與功能鑒定生物化學(xué)與分子生物學(xué)碩士論文

密級(jí)： 論文編號(hào)： 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 碩士 學(xué)位論文 調(diào)控大豆抗 逆 反應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子基因的 分離 與 功能鑒定 I 摘 要 非生物脅迫 對(duì)植物的生理代謝產(chǎn)生各種各樣的影響 ， 植物通過(guò)改變自身基因的表達(dá)而改變其體內(nèi)的代謝機(jī)制，從而對(duì)各種 非生物 環(huán)境 脅迫 進(jìn)行耐受和適應(yīng)。植物體內(nèi)基因表達(dá)的變化受到多種的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制的調(diào)控 ， 作為信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)重要組成部分的轉(zhuǎn)錄因子在調(diào)控脅迫相關(guān)的基因表達(dá)的過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。其中 轉(zhuǎn)錄因子是近年來(lái)研究 較 多，也最詳盡的一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子家族；作為其亞家族 ， 轉(zhuǎn)錄因子也成為植物分子生物學(xué)和植物抗旱分子機(jī)理研究的重要對(duì)象。 本 論文研究 中，根據(jù) 蛋白的 守域的氨基酸序列設(shè)計(jì)探針，通過(guò) 菌斑原位雜交技術(shù) 獲得兩個(gè)新的 全長(zhǎng)序列。利用特異性的引物，經(jīng) 得了 2 個(gè) 列，其 核苷酸 長(zhǎng)度分別為 477 816名為 別編碼含有 159 和 272 個(gè)氨基酸的蛋白 。經(jīng) 氨基酸 序列和蛋白結(jié)構(gòu)分析 ， 白 與在擬南芥中有過(guò)詳細(xì)報(bào)道的 族 轉(zhuǎn)錄因子 具有高 度 的同源性 ，其蛋白 結(jié)構(gòu)類(lèi)似于已經(jīng) 從 擬南芥 中分離的 錄因子， 推測(cè) 白 屬于 家族，在調(diào)控抗逆基因表達(dá)的過(guò)程中發(fā)揮轉(zhuǎn)錄因子的作用。 夠 在大腸桿菌中以 合 蛋白的形式表達(dá) ， 段具有較好的表達(dá)活性；純化融合蛋白 通過(guò)凝膠阻滯 技術(shù)研究了 合蛋白 與 野生型或突變型 件 特異性的 結(jié)合 。研究結(jié)果表明， 白與野生型 件核心序列 特異性結(jié)合，與 突變 型 件核心序列特異性相互作用 弱，其 影響 顯著 大于 件兩端堿基 。 通過(guò) 酵母單雜交技術(shù)研究了 酵母中 的轉(zhuǎn)錄激活作用 ， 活了 件調(diào)控下的 告基因的 高效 表達(dá)， 使得酵母在營(yíng)養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基 夠生長(zhǎng)， 證明了 因表達(dá)產(chǎn)物與 件的相互作用激活 了 件調(diào)控的下游基因的表達(dá)。 本論文首次 克隆 了 因 ，其 能夠 在原核 正確表達(dá)， 在酵母中 夠與 式作用元件特異 性 結(jié)合 ， 調(diào)控 游基因的表達(dá)。 此結(jié)論為提高 農(nóng) 作物 抗 脅迫 能力 奠定了理論技術(shù)基礎(chǔ)。 關(guān)鍵詞 抗旱 反應(yīng) ， 錄因子 ， of to to to of to or to of is of as an in of P/is of a an of In we by P2 as a of 77bp 16bp of P2 in of by RE . we be RE of of of of in as a RE to of as a in of to of 錄 第一章 緒論 .生物脅迫下植物中表達(dá)發(fā)生明顯變化的基因 . 1 與植物抗逆反應(yīng)的功能蛋白 . 2 控植物抗逆反應(yīng)的調(diào)節(jié)蛋白 . 4 控基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子的研究進(jìn)展 . 6 賴(lài)非生物脅迫信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑 . 8 依賴(lài)非生物脅迫信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑 . 9 物抗逆基因工程的研究進(jìn)展 . 12 能基因的應(yīng)用 . 12 迫反應(yīng)相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子基因的克隆和應(yīng)用 . 13 題意義、依據(jù) . 13 術(shù)路線(xiàn) . 14 第二章 調(diào)控抗逆基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子 因的克隆 . . 15 料與方法 . 15 料 . 15 驗(yàn)方法 . 15 果與分析 . 20 斑原位雜交篩選 庫(kù) . 20 標(biāo)基因片段的獲得及基因結(jié)構(gòu)分析 . 21 標(biāo)片段的 T 載體重組體構(gòu)建 . 22 組體的篩選和鑒定 . 23 標(biāo)基因序列的獲得 . 25 標(biāo)基因序列分析及蛋白功能預(yù)測(cè) . 28 第三章 因功能分析 .料與方法 . 31 料 . 31 法 . 31 果與分析 . 38 大豆基因組內(nèi)拷貝數(shù)分析 . 38 大豆中的表達(dá)特征 . 39 錄因子與 件特異性結(jié)合 . 41 酵母中的轉(zhuǎn)錄激活 . 45 第四章 因功能分析 .料與方法 . 49 料 . 49 法 . 49 果與分析 . 56 因在基因組內(nèi)拷貝數(shù)分析 . 56 因的表達(dá)特征 . 56 錄因子與 件特異性結(jié)合 . 58 酵母中的轉(zhuǎn)錄激活 . 61 第五章 結(jié)果與討論 .果 . 63 論 . 64 參考文獻(xiàn) . 謝 . 者 簡(jiǎn) 歷 .國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 英文縮略表 0 英文縮略表 英文縮寫(xiě) 英文全稱(chēng) 中文名稱(chēng) 水應(yīng)答元件 水應(yīng)答元件結(jié)合蛋白 烯應(yīng)答元件結(jié)合蛋白 胎后期豐富蛋白 化分裂素的蛋白激酶 離子依賴(lài)蛋白激酶 落酸應(yīng)答元件 落酸應(yīng)答元件結(jié)合因子 定位信號(hào) 氧化物歧化酶 胱苷肽 S轉(zhuǎn)移酶 氧化物酶 氨酸脫氫酶 5C 脫氫酶 咯碄 5羧酸脂 性螺旋環(huán)螺旋結(jié)構(gòu) 性亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu) 醇三磷酸 超敏感型 落酸 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 緒論 1 第一章 緒論 干旱、低溫和高鹽是全球性的影響植物生長(zhǎng)，限制作物產(chǎn)量的非生物脅迫因子。復(fù)雜的氣候條件給 我國(guó)乃至全球的農(nóng)作物生產(chǎn)帶來(lái)了嚴(yán)重?fù)p失。我國(guó)大部分地區(qū)處于東亞季風(fēng)區(qū)，氣候復(fù)雜，是世界上氣候脆弱區(qū)之一，也是受氣象災(zāi)害影響最嚴(yán)重的國(guó)家之一。干旱是我國(guó)最常見(jiàn)、對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)影響最大的氣候?yàn)?zāi)害，干旱受災(zāi)面積占農(nóng)作物總種植面積的一半以上（廣東氣象數(shù)據(jù)）。因此，培育耐旱、高產(chǎn)、質(zhì)優(yōu)的農(nóng)作物新品種已經(jīng)成為我國(guó)農(nóng)業(yè)育種工作者的重要任務(wù)。 我國(guó)是具有悠久歷史的農(nóng)業(yè)大國(guó)。長(zhǎng)期以來(lái)，人們一直關(guān)注農(nóng)作物對(duì)環(huán)境影響因子，如干旱、高鹽和低溫等的反應(yīng)，致力于 篩選抗逆性好、產(chǎn)量高的農(nóng)作物新品系。然而，環(huán)境影響因子的復(fù)雜性及其與 植物 之間相 互作用 的多樣性，使得我們?cè)谵r(nóng)作物的脅迫反應(yīng)方面的 研究較為困難 ，延緩了 與非生物脅迫抗性相關(guān)的 育種工作。雖然有新品系的培育成功，但作物抗逆品系的培養(yǎng)依然是提高我國(guó)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)力的必需。隨著現(xiàn)代生物科學(xué)的發(fā)展和人們對(duì)作物抗逆反應(yīng)機(jī)理的認(rèn)識(shí)的深入，從分子水平提高作物抗逆性必將成為未來(lái)農(nóng)業(yè) 育種工作 發(fā)展的重要發(fā)展方向。 當(dāng)前，植物抗逆分子生物學(xué)的研究取得了 重 大的進(jìn)展，人們對(duì)抗逆反應(yīng)中發(fā)揮直接作用的功能基因和調(diào)控抗逆反應(yīng)的蛋白及其調(diào)控機(jī)理方面對(duì)植物脅迫耐受性有了較好的了解。 生物脅迫下植物中表達(dá)發(fā)生明顯變化的基因 植物體內(nèi)的大量基因可以被非生物脅迫誘導(dǎo)表達(dá) (et 1996;1997; 1994; et 1996; 1997; 2003)。這些基因根據(jù)其編碼蛋白產(chǎn)物的功能可以分為兩類(lèi)：一類(lèi)稱(chēng)為功能基因，編碼一些直接保護(hù)生物大分子和膜結(jié)構(gòu)、保持水分在膜間運(yùn)動(dòng)的功能蛋白，如 白、滲調(diào)素、分子伴侶和 合蛋白以及其他一些保持植物在脅迫條件下正常生理生化變化所需的蛋白等。而另一類(lèi)主要是指編碼涉及脅迫信 號(hào)傳導(dǎo)和脅迫反應(yīng)基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子（如 ），蛋白激酶（包括 酶和 酶，受體蛋白激酶，核糖體蛋白激酶以及轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白激酶等）和蛋白酶（如磷酸酯酶和磷脂酶 C 等）等的基因 (et 1998)。這兩類(lèi)基因在植物的保衛(wèi)反應(yīng)和脅迫應(yīng)答過(guò)程中起到重要作用。 后來(lái)的研究表明這兩類(lèi)基因在脅迫處理后的不同時(shí)間表達(dá)，推測(cè)在脅迫處理早期，與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的蛋白激酶及蛋白酶和基因表達(dá)調(diào)控相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子基因在短時(shí)間內(nèi)表達(dá)，其表達(dá)產(chǎn)物對(duì)功能基因進(jìn)行誘導(dǎo)激活，從而使功能基因表達(dá)，改變 植物的生理生化或代謝狀態(tài)，從而對(duì)外界脅迫作出反應(yīng)。 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 緒論 2 圖 1物體內(nèi)抗逆基因編碼蛋白產(chǎn)物分類(lèi) of in in et 1998)修改。 與植物抗逆反應(yīng)的功能蛋白 功能蛋白是一類(lèi)直接參與植物細(xì)胞抗逆反應(yīng)的蛋白，他們?cè)谀婢趁{迫下保護(hù)植物細(xì)胞免受脅迫的破壞，保持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的平衡，維持細(xì)胞的正常生理生化功能。 蛋白 細(xì)胞是組成生物體的基本結(jié)構(gòu)單元，植物對(duì)脅迫環(huán)境的反應(yīng)根本上就是細(xì)胞針對(duì)外界脅迫條件做出的細(xì)微調(diào)整的宏觀(guān)效應(yīng)。而細(xì)胞膜是外界環(huán)境與胞內(nèi)原生質(zhì)體之間的媒介，可以快速的感受外界的環(huán)境條件變化，迅速而有效地將外界脅迫信號(hào)通過(guò)特異的途徑傳遞到細(xì)胞內(nèi)組分，通過(guò)特異的中間分子，如細(xì)胞內(nèi)第二信使分子，轉(zhuǎn)錄因子等調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)離子濃度和組分的變化。 膜蛋白作為細(xì)胞膜的重要組成成分，在維持細(xì)胞膜的流動(dòng)性，胞內(nèi)外物質(zhì)的流動(dòng)，保持細(xì)胞膜兩側(cè)的滲透平衡等方面起著重要的作用。 目前對(duì)膜蛋白中的水通道蛋白和膜上的運(yùn)輸?shù)鞍?的研究較多。 通蛋白 水通道蛋白是一類(lèi) 膜內(nèi)在蛋白，廣泛存在于動(dòng)植物、酵母和細(xì)菌中，是在細(xì)胞膜上 形成 水 轉(zhuǎn)運(yùn) 通道的蛋白質(zhì) 。植物通過(guò)調(diào)控水通道蛋白來(lái)改變細(xì)胞與外界的信息和物質(zhì)交流，從而實(shí)現(xiàn)滲透調(diào)節(jié)，增強(qiáng)植物的抗旱性。這類(lèi)蛋白到上世紀(jì)九十年代才得到鑒定，并廣泛的在動(dòng)物細(xì)胞中進(jìn)行研究。 但至今沒(méi)有發(fā)現(xiàn)植物細(xì)胞膜上水通道蛋白的存在 。 解毒酶 (功能蛋白 調(diào)節(jié)蛋白 膜蛋白 (水通道蛋白，運(yùn)輸?shù)鞍?) 蛋白酶 (細(xì)胞質(zhì)，葉綠體中 ) 蛋白因子 (分子伴侶， 白 ) 滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)合成相關(guān)酶 (脯氨酸 ,甜菜堿類(lèi) ,糖 ) 轉(zhuǎn)錄因子 (蛋白激酶 (蛋白磷酸化酶 (磷脂代謝相關(guān)酶類(lèi) (, 非生物脅迫 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 緒論 3 最早人們觀(guān)察到水在滲透壓或液壓存在時(shí)進(jìn)入血紅細(xì)胞膜的速度明顯的高于水在細(xì)胞膜的擴(kuò)散速度，因此，人們提出細(xì)胞膜上有水孔存在的假設(shè)（ et 1953; et 1957; et 1957; et 1960）。后來(lái)通過(guò)對(duì)細(xì)胞膜進(jìn)行 試劑的處理，而使的水分子通過(guò)細(xì)胞膜受阻（ et 1984），從而證明了這些水孔是由蛋白組成的通道（ et 1991）。意識(shí)到水通道蛋白的存在后，人們開(kāi)始試圖純化并鑒定這些蛋白。爪蟾卵細(xì)胞成為研究顯微注射的 能的重要工具（ et 1991; et 1992）。早期人們都是通過(guò)從高水通透性的細(xì)胞膜中分離 射入卵細(xì)胞后觀(guān)察水通道的形成的方法研究的（ et 1990）。 研究表明， 水通道蛋白的孔隙中都具有對(duì)水分子高度選擇的結(jié)構(gòu)：它們都有 六次 跨膜 螺旋 結(jié)構(gòu)域，這些跨膜結(jié)構(gòu)域之間通過(guò)疏水性的環(huán)連接起來(lái)。 這些跨膜螺旋選擇性的允許水和其他不帶電荷的小分子物質(zhì)順滲透壓梯度進(jìn)入細(xì)胞膜（ et 2006）。 在細(xì)胞膜外的疏水多肽環(huán)上的兩個(gè)高度保守的基序被認(rèn)為與通道 的選擇性有關(guān)（ et 1994）。 s 實(shí)驗(yàn)室于 2000 年成功的利用 液中的水通道蛋白 的立體結(jié)構(gòu) 。 研究發(fā)現(xiàn)這個(gè)結(jié)構(gòu)能促進(jìn)大腸桿菌對(duì)甘油的吸收，命名為水 是說(shuō)這個(gè)通道可以允許小分子直鏈糖類(lèi)如甘油等通過(guò) （ et 2005） 。 水通道蛋白能夠 快速的改變細(xì)胞內(nèi)外滲透壓，對(duì)于保持細(xì)胞內(nèi)水分的平衡具有重要作用。 輸?shù)鞍?細(xì)胞膜兩側(cè)物質(zhì)的交換通過(guò)擴(kuò)散、主動(dòng)運(yùn)輸和被動(dòng)運(yùn)輸三種方式進(jìn)行。而主動(dòng) 和被動(dòng) 運(yùn)輸?shù)倪^(guò)程需要膜上蛋白的參與，這類(lèi)蛋白稱(chēng)為運(yùn)輸?shù)鞍住?生物膜上的運(yùn)輸?shù)鞍卓梢苑譃橥ǖ赖鞍缀洼d體蛋白。通道蛋白作為一種選擇性的孔徑，受某些化學(xué)或電生理刺激而開(kāi)放，允許一些溶質(zhì)通過(guò)一定的電化學(xué)梯度而進(jìn)入細(xì)胞或流到細(xì)胞外。 而 載體蛋白通常利用一定的能量而將 物質(zhì)逆濃度梯度運(yùn)輸。還有一類(lèi)活化運(yùn)輸?shù)鞍淄ㄟ^(guò)物質(zhì)的順濃度梯度運(yùn)輸而運(yùn)輸另一種物質(zhì)。 輸?shù)鞍祝?用 分解將各種底物運(yùn)到膜內(nèi)或膜外。通過(guò) X射線(xiàn)已經(jīng)獲得的六個(gè)不同的運(yùn)輸?shù)鞍?，包括兩個(gè) 輸?shù)鞍椎母叻直媛嗜唤Y(jié)構(gòu)圖。這些結(jié)構(gòu)圖驗(yàn)證了之前的生物化學(xué)和生物學(xué)研究，并且對(duì)新的功能機(jī)制的研究提供了材料。這些運(yùn)輸?shù)鞍锥季哂锌缒さ穆菪Y(jié)構(gòu) ，并且具有不規(guī)則的折疊或彎曲，這些結(jié)構(gòu)保證了運(yùn)輸?shù)鞍自谖镔|(zhì)運(yùn)輸過(guò)程中可以通過(guò)構(gòu)象的變化而促進(jìn)物質(zhì)的運(yùn)輸（ et 2004）。 運(yùn)輸?shù)鞍资羌?xì)胞內(nèi)外離子和物質(zhì)交換的重要媒介，因此膜 運(yùn)輸?shù)鞍讓?duì)于膜兩側(cè)離子的平衡和細(xì)胞對(duì)物質(zhì)的吸收起著重要的作用。 白酶 蛋白酶對(duì)于維持細(xì)胞內(nèi)組分的平衡和生理平衡狀態(tài)是必需的。蛋白酶類(lèi)關(guān)系到脅迫信號(hào)的感受，傳導(dǎo)，和解除，對(duì)植物的生理生化過(guò)程進(jìn)行實(shí)時(shí)的調(diào)控。 白 白是指胚胎發(fā)生后期種子中大量積累的一類(lèi)蛋白質(zhì)。 白廣泛存在于高等植物。白質(zhì)植物細(xì)胞中可以保護(hù)生物大分子，維持特定細(xì)胞結(jié)構(gòu)，緩解干旱、高鹽和低溫等環(huán)境脅迫的作用。 伴隨著干旱過(guò)程產(chǎn)生的一類(lèi)的分子量蛋白，大部分在 10 30間，少部 分在 30上（ et 1989），這類(lèi)蛋白與種子的耐脫水性密切相關(guān)，在種子成熟脫水過(guò)程中期保護(hù)組織免受傷害的作用。 1985）最早檢測(cè)并得到了 因并得到其編碼中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 緒論 4 產(chǎn)物。后來(lái)人們相繼從小麥（ et 1993）、番茄（ et 1997）和大豆（ et 1995）等多種植物中檢測(cè)到此類(lèi)蛋白的存在，說(shuō)明 白在許多植物中可以表達(dá)。 干旱脅迫等也能有到它的表達(dá)，如黎豆（ 利用高鹽脅迫和水脅迫等誘導(dǎo)了此類(lèi)蛋白的產(chǎn)生（ et 1996）。同樣在 誘導(dǎo)下，此類(lèi)蛋白的表達(dá)量也增加（ et 1999）。 白高親水性，保證了植物在干旱條件下細(xì)胞結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定，避免了 細(xì)胞 膜結(jié)構(gòu)的破壞。 透調(diào)節(jié)物質(zhì)合成相關(guān)的酶 干旱條件下，植物細(xì)胞內(nèi)會(huì)積累大量的有機(jī)分子、可溶性溶質(zhì)和小分子物質(zhì)，用于維持細(xì)胞內(nèi)外的滲透壓平衡。如脯氨酸、甜菜堿以及一些小分子糖類(lèi)。 脯氨酸累積是植物針對(duì)干旱脅迫的保護(hù)措施。研究發(fā)現(xiàn)，脯氨 酸可以保護(hù)蛋白在缺水時(shí)不變性，其親水基團(tuán)與蛋白質(zhì)的親水殘基相互作用，而使得蛋白的穩(wěn)定性提高 (992)。同時(shí)，脯氨酸還可以協(xié)助清除體內(nèi)自由基，調(diào)節(jié)細(xì)胞 止酶變性和細(xì)胞質(zhì)酸化等作用。脯氨酸的合成和降解分別受 成酶和 原酶以及脯氨酸脫氫酶和 氫酶（ (et 1997)。如此則保證了脅迫條件下脯氨酸含量的快速增加，并使得在脅迫解除后，脯氨酸的迅速降解。 而甜菜堿可能是作為植物主要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)外滲透壓的平衡。植物體內(nèi)甜菜堿的 合成是由甜菜堿醛脫氫酶 (膽堿脫氫酶（ 個(gè)基因共同作用的結(jié)果 (et 1998; et 2000)。脅迫條件下，膽堿被上述兩種酶類(lèi)氧化為甜菜堿，并在細(xì)胞質(zhì)中大量積累，使得細(xì)胞內(nèi)外的滲透壓保持平衡，從而提高了植物的脅迫耐受性。 et 2000)將甜菜堿醛脫氫酶和膽堿脫氫酶基因轉(zhuǎn)入煙草而提高了植株中甜菜堿的含量，提高了轉(zhuǎn)基因植株的脅迫耐受性。 性氧清除酶類(lèi) 環(huán)境脅迫條件可以導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)活性氧含量的增加， 對(duì)細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)分子和組成成分造成破壞，從而在細(xì)胞內(nèi)形成超氧化環(huán)境，對(duì)植物造成損害 ，引起一系列的衰亡反應(yīng) 。植物體內(nèi)含有多種活性氧清除酶類(lèi)，如超氧化物歧化酶（ 過(guò)氧化氫酶 （ 、過(guò)氧化物酶（ 谷胱甘肽 它們協(xié)同抵抗脅迫誘導(dǎo)的氧化傷害 。脅迫條件下， 細(xì)胞內(nèi) 活性明顯提高，表明 這些 酶在 植物的 脅迫反應(yīng)過(guò)程中發(fā)揮作用。 另外，植物體內(nèi)還含有大量的分子伴侶，保證脅迫條件下多肽折疊的正確性，以及促進(jìn)變性蛋白的降解。近年研究較熱的磷脂酶類(lèi)也對(duì)植物細(xì)胞的脅迫耐受性具有重要影 響。 控植物抗逆反應(yīng)的調(diào)節(jié)蛋白 植物中的抗逆相關(guān)的調(diào)節(jié)蛋白主要參與脅迫信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)和基因表達(dá)的調(diào)控過(guò)程。包括一些與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)的蛋白酶類(lèi)、調(diào)控基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子等。 控基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子 轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控是基因特異性表達(dá)的主要調(diào)控環(huán)節(jié)。 轉(zhuǎn)錄因子通過(guò)與順式作用元件相互作用而調(diào)控下游基因的表達(dá)。轉(zhuǎn)錄因子又稱(chēng)反式作用因子，是指能夠與順式作用元件特異性結(jié)合，激活下游基因表達(dá)的蛋白因子。轉(zhuǎn)錄因子一般由 合域、轉(zhuǎn)錄控制域、寡聚化位點(diǎn)及核定位信中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 緒論 5 號(hào)等組成。一些轉(zhuǎn)錄因子也通過(guò)與其他的轉(zhuǎn)錄因子 相互作用而起到調(diào)控基因表達(dá)的作用。 合域決定了轉(zhuǎn)錄因子與 列的結(jié)合特異性，而轉(zhuǎn)錄控制域調(diào)控基因的表達(dá)；核定位信號(hào)是指蛋白序列中的一些富含精氨酸和賴(lài)氨酸殘基的區(qū)域，是蛋白合成后正確定位所必需的；而寡聚化位點(diǎn)可能是轉(zhuǎn)錄因子之間相互作用的功能域，可以與 成一定的空間構(gòu)象（ et 2000）。 植物對(duì)脅迫環(huán)境的反應(yīng)是特異的脅迫反應(yīng)基因的表達(dá)的結(jié)果。植物通過(guò)一系列的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑激活轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，進(jìn)而激活特異的脅迫反應(yīng)基因的表達(dá)。植物的非脅迫反應(yīng)過(guò)程是受多基因控制的，因此，近年來(lái)，非生 物脅迫反應(yīng)調(diào)控機(jī)理的研究成為植物分子生物學(xué)研究的重點(diǎn)，而作為抗逆反應(yīng)基因表達(dá)調(diào)控因子的轉(zhuǎn)錄因子的研究對(duì)于揭示非生物脅迫反應(yīng)的調(diào)控機(jī)理具有重要的意義。按照蛋白的結(jié)構(gòu)組成分類(lèi)，目前研究的轉(zhuǎn)錄因子主要有： 白，最早由 et (1997)在 白中發(fā)現(xiàn)， 守域是由 60 個(gè)左右的氨基酸殘基組成的 1 個(gè) 螺旋和 3 個(gè) 折疊構(gòu)成；鋅指蛋白，由 1 個(gè)富含堿性殘基的 合域和與其相鄰的鋅指二聚體結(jié)構(gòu)組成；類(lèi) 白，由三個(gè)不完全重復(fù)組成的螺旋 螺旋組成；類(lèi) 白，含有基本的螺旋 螺旋結(jié)構(gòu)域，有兩個(gè)分別可與 合和與 成而具體的結(jié)構(gòu)域組成。 與細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的蛋白激酶 環(huán)境脅迫作用于植物細(xì)胞表面受體，引發(fā)細(xì)胞內(nèi)一系列的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，最終通過(guò)激活特異的功能基因的表達(dá)改變植物生理生化狀態(tài)，從而對(duì)脅迫作出適應(yīng)。研究表明，蛋白激酶在信號(hào)的感知和轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中都具有重要作用（ hu et 2002, 005）。 對(duì)擬南芥的基因組分析結(jié)果表明，其中約有 600 多個(gè)基因編碼蛋白 激酶（ 003）。目前已研究的與植物非生物脅迫反應(yīng)相關(guān)的蛋白激酶主要有四類(lèi)：受體蛋白激酶、促分裂原活化蛋白激酶（ 核糖體蛋白激酶和轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白激酶等。這些蛋白激酶通過(guò)影響細(xì)胞內(nèi)組分的磷酸化 /去磷酸化、羥基化 /去羥基化、還原 /氧化等狀態(tài)，而改變各種蛋白或信號(hào)分子的構(gòu)象，或存在狀態(tài)：或聚合 /解聚、或失活 /趨活等，調(diào)節(jié)信號(hào)分子或蛋白的活性，影響了細(xì)胞內(nèi)的代謝，從而對(duì)環(huán)境條件作出適應(yīng)性反應(yīng) (2000)。 體蛋白激 酶 受體蛋白激酶可以感知各種外界脅迫信號(hào)并將信號(hào)向胞內(nèi)傳遞，引發(fā)一系列的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程(003)。典型的受體激酶是由胞外結(jié)合域、跨膜域和胞內(nèi)催化結(jié)構(gòu)域三部分組成 (001)能與區(qū)分不同的信號(hào)有關(guān) (et 2004)，而胞內(nèi)部分同源性較高，可以達(dá)到 40%，因此依據(jù)不同的胞外域，我們將受體蛋白激酶分為 15 類(lèi) (001, 2003)。從擬南芥中分離出的蛋白激酶基因可以受干旱、高鹽和低溫的快速誘導(dǎo)，推測(cè)該蛋白激酶可能在環(huán)境脅迫信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中發(fā)揮作用 (et 1997)。最近在多種植物中發(fā)現(xiàn)的雙組分系統(tǒng)就是一種干旱脅迫反應(yīng)感受器，含有一個(gè)組氨酸激酶作為感受器和一個(gè)依賴(lài)于磷酸化作用的反應(yīng)調(diào)節(jié)器(997;et 1998, 2000;et 2001)。 分裂原活化蛋白激酶 促分裂原活化蛋白激酶 (聯(lián)反 應(yīng)是一種在 酵母 細(xì)胞中了解比較清楚地信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑（ 22） 。 人們希望 在植物中 也能找到一條類(lèi)似的滲透脅迫信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的途徑。酵母中的滲透脅迫調(diào)控途徑首先以含有 構(gòu)域的膜蛋白或雙組分組氨酸激酶開(kāi)始，通過(guò)激活 酶信號(hào)通路，最中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 緒論 6 終引起滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的合成和累積（ 22）。盡管植物中也積累可溶性的滲調(diào)物質(zhì)來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞的滲透壓，它們是否具有相同的膜上信號(hào)感應(yīng)器和 酶級(jí)聯(lián)調(diào)控滲調(diào)物質(zhì)的合成還不清楚（ 2006） 。 最近 在植物中鑒定了一些受滲透脅迫或其他脅迫誘導(dǎo)的蛋白激酶。 植物中存在許多受滲 透脅迫激活的 酶，如在紫花苜蓿中發(fā)現(xiàn)的 et 1998）。有趣的是 滲透壓超過(guò)一定范圍（ 750就不再激活，反而是另一個(gè)更小的激酶被活化，表明這兩個(gè)蛋白激酶在不同的滲透壓范圍發(fā)揮作用。煙草細(xì)胞中的 高滲透壓誘導(dǎo)激活（ et 2000）。 在煙草中 過(guò)量 表達(dá) et 2000)，最近報(bào)道的 過(guò)度表達(dá)還增強(qiáng) 了轉(zhuǎn)基因玉米的脅迫耐受性 (et 2004a, 2004b)。 糖體蛋白激酶 核糖體蛋白激酶是一類(lèi)通過(guò)增加某些蛋白的合成而使植物對(duì)脅迫反應(yīng)的蛋白激酶。 生物化學(xué)分析表明植物細(xì)胞內(nèi)蛋白的磷酸化參與了植物環(huán)境信號(hào)、代謝、病原體和激素（ et 1987; et 1991）反應(yīng)。遺傳分析發(fā)現(xiàn)蛋白激酶的在自身不相容性（ et 1993; et 1993）和乙烯信號(hào)（ et 1993）轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮作用。這些結(jié)果表明可逆性蛋白磷酸化在植物細(xì)胞調(diào)控中具有重要作用。 如擬南芥中發(fā)現(xiàn)的 糖蛋白激酶基因就被認(rèn)為對(duì)植物的生長(zhǎng)和發(fā)育具有重要調(diào)節(jié)作用（ et 1994）。 錄調(diào)控蛋白激酶 轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白激酶參與調(diào)控與 生物生長(zhǎng)發(fā)育、細(xì)胞周期和染色體活動(dòng)以及生命物質(zhì)的合成的等多種與 生命活動(dòng)相關(guān)的基因的表達(dá) ，同時(shí)也通過(guò)其激酶活性影響轉(zhuǎn)錄因子的活性。 控基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子的研究進(jìn)展 干旱，高鹽和低溫是影響植物生長(zhǎng)，限制作物產(chǎn)量 的主要的環(huán)境脅迫因子。植物在分子水平、細(xì)胞水平和生理生化水平對(duì)這些脅迫條件進(jìn)行適應(yīng)，從而使它們能夠耐受或抵抗這些脅迫條件，在惡劣的環(huán)境中生存下來(lái)。人們已經(jīng)對(duì)許多植物中的脅迫誘導(dǎo)基因的表達(dá)進(jìn)行了研究（ et 1996;et 1997;1999）。這些基因的表達(dá)產(chǎn)物不光在脅迫耐受過(guò)程發(fā)揮作用，而且在植物的基因表達(dá)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中發(fā)揮作用（ et 1998; et 2005; et 2003; et 2002）。 植物激素 干旱脅迫條件誘導(dǎo)產(chǎn)生，在植物對(duì)干旱和高鹽脅迫的反應(yīng)過(guò)程中發(fā)揮重要作用。外用 以誘導(dǎo)大量的干旱和低溫反應(yīng)基因的表達(dá)（ et 2003;et 2004）。然而，對(duì)于 如何調(diào)控 低溫脅迫反應(yīng)基因的表達(dá)還不是很清楚。同時(shí)有一些報(bào)道描述了受干旱和低溫誘導(dǎo)的基因，但并不受外源 誘導(dǎo)（ et 2003，et 1994； et 2002）。這表明植物體內(nèi)有 賴(lài)和 過(guò)對(duì) 脅迫誘導(dǎo)基因 動(dòng)子元件的分析發(fā)現(xiàn)了依賴(lài)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的順式元件的存在（ et 2003; 國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 緒論 7 2005）。 植物對(duì)非生物脅迫的反應(yīng)過(guò)程是受多基因控制的，因此它的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑也相當(dāng)復(fù)雜（ 2000， 2002， 2006）。通過(guò) 交 ,基因芯 片和定量 試驗(yàn) ,對(duì)擬南芥中的干旱 ,高鹽和低溫誘導(dǎo)的基因的表達(dá)進(jìn)行了分析 (et 2002; et 2002; et 2002; et 2005),發(fā)現(xiàn)超過(guò) 300 多個(gè) 基因的表達(dá)受脅迫