【畢業(yè)學(xué)位論文】（Word原稿）農(nóng)用抗生素2-16高產(chǎn)菌株選育及發(fā)酵優(yōu)化組合研究植物病理學(xué)碩士論文

密級： 論文編號： 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 學(xué)位論文 農(nóng)用抗生素 2產(chǎn)菌株選育 及發(fā)酵優(yōu)化組合研究 F I 摘 要 農(nóng) 用 抗 生 素 2 從 不 吸 水 鏈 霉 菌 黃 山 變 種 （ 酵產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)的一種具有廣譜抗菌作用的抗生素。農(nóng)抗 2多種作物病原真菌有較強抑制作用，對 酵母菌及部分革蘭氏陽性細菌和革蘭氏陰性細菌也有一定的抑制作用。農(nóng)抗 2于防治油菜菌核病，防效大于 65%。在進行本研究之前農(nóng)抗 2發(fā)酵單位僅有2000u/相對較低。為提高農(nóng)抗 2生菌的單位效價，本研究通過四種誘變方法選育出一株農(nóng)抗 2高產(chǎn)菌株 515#，并利用 件提供的 計和響應(yīng)面分析法對該菌株的搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基進行了優(yōu)化組合。研究結(jié)果如下： #（效價 2000 u/次進行原生質(zhì)體再生處理、紫外線誘變、 變、低能碳離子 注入處理，每步篩選出高產(chǎn)菌株用于下一步誘變處理。原生質(zhì)體再生處理未獲得高產(chǎn)菌株，紫外線誘變獲得菌株 301#（效價 2317u/ 變獲得菌株 442#（效價 4084u/低能碳離子注入獲得菌株 515#（效價 6462u/最終獲得的目標菌株 515#效價較出發(fā)菌株 0#提高 四種誘變方法中，低能碳離子注入的誘變貢獻率最高，達到 之，達到 本研究中低能碳離子注入和 變的作用效率顯著高于紫外線誘變和原生質(zhì)體再生處理，是進行農(nóng)抗 2生菌誘變育 種的高效方法。 件中的 計和響應(yīng)面分析法對 515#菌株的搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基進行優(yōu)化組合，從九個考察因素中選出化合物 K 和化合物 F 為重要因素，通過響應(yīng)面分析法建立模型 Y=x2 測出在化合物 K 濃度為 化合物 F 濃度為 預(yù)測的最大響應(yīng)值為 8989 u/搖瓶發(fā)酵實驗證實此點的實測值為（ 8952 94） u/明模型是有效的， 并且存在極大值點。采用優(yōu)化培養(yǎng)基， 515#菌株效價較原始發(fā)酵培養(yǎng)基提高 3. 高效液相色譜分析發(fā)酵液組份表明 農(nóng)用抗生素 2要含有 A、 B 兩個組 份 ， B 組 份 含量高于 A 組 份 。 菌株 442#、 301#的 A 組份含量高于出發(fā)菌株 0#， B 組份含量低于出發(fā)菌株， 515#和 515#（優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基）的 B 組份含量高于出發(fā)菌株 0#， A 組份含量低于出發(fā)菌株。 B 組 份 的含量對效價的影響更大， B 組 份 是決定農(nóng)抗 2價高低的關(guān)鍵因素。 關(guān)鍵詞 ：農(nóng)用抗生素 2價，誘變， 件，培養(yǎng)基優(yōu)化 is an on of of on + to in 5%. is of 000u/In to in At a 15# By AS 15# as # (000u/by of + a as of No 01# (317u/by 42# (084u/TG 15# (462u/by + 15# in #. + to of TG . In TG + of of AS of 15# as a on SA Y=x2 of to 989 u/by 8952 94)u/15 #in of of of A in . in of 42# 01# of #, it to 15# 15# in in of 15# 15# in of #, on of , of 目 錄 第一章 引言 1 農(nóng)用抗生素概述 1 農(nóng)用抗生素產(chǎn)生菌及菌種選育 7 件的特點及其在微生物發(fā)酵條件優(yōu)化中的應(yīng)用 12 農(nóng)用抗生素 2究進展 13 第二章 農(nóng)用抗生素 2產(chǎn)菌株選育 15 材料與方法 15 結(jié)果與分析 20 結(jié)論與討論 28 第三章 農(nóng)用抗生素 2產(chǎn)菌株發(fā)酵優(yōu)化組合 31 材料與方法 31 結(jié)果與分析 34 結(jié)論與討論 39 第四章 結(jié)論 41 參考文獻 42 附圖 47 致 謝 51 作者簡歷 52 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 引言 1 第一章 引 言 用抗生素概述 抗生素是一個低分子量的代謝產(chǎn)物，分子量約在 150 5000 之間，由碳、氫、氧、氮、硫、磷或鹵族元素組成（王以光， 1998），是生物，包括微生物、植物、和動物在內(nèi)，在其生命活動過程中的所產(chǎn)生的（或由其它方法獲得的）能在低微濃度下有選擇地抑制或影響它種生物功能的有機物質(zhì)（顧覺奮等， 2001）。農(nóng)用抗生素是指由微生物生命活動過程中產(chǎn)生的對微生物、昆 蟲、螨類、線蟲、寄生蟲、植物等其他生物在很低濃度下顯示特異性藥理作用的天然有機化合物（周啟等， 1990），是抗生素在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域的應(yīng)用，根據(jù)其應(yīng)用范圍可分為殺菌劑、殺蟲劑、除草劑等。 抗生素的分類方法多種多樣，一般按照化學(xué)結(jié)構(gòu)分類，即把具有相同基本化學(xué)結(jié)構(gòu)的天然或化學(xué)半合成的抗生素分成一類，包括 內(nèi)酰胺類，如青霉素、頭孢霉素及它們的衍生物；氨基糖苷類，如鏈霉素、春雷霉素、井岡霉素、卡那霉素、慶大霉素；四環(huán)素類，如四環(huán)素、土霉素、金霉素；大環(huán)內(nèi)脂類，如四抗菌素、泰樂菌素、阿維菌素；多肽類，如放線菌素、多粘菌素；多醚類，如鹽霉素、莫能菌素；核苷類，如殺稻瘟菌素 S、多氧霉素、慶豐霉素。 農(nóng)用抗生素的抗菌作用機理大致可歸納為以下幾種：抑制病原菌細胞壁合成，如作用于真菌細胞壁合成的多氧霉素與幾丁質(zhì)合成酶的底物 乙酰葡萄糖胺結(jié)構(gòu)相似，能競爭性地和幾丁質(zhì)合成酶結(jié)合，從而抑制該酶活性，抑制真菌細胞壁的合成（ et 1974; 1991）。 干擾菌體細胞膜功能，作用方式又分為破壞細胞膜超微結(jié)構(gòu)，造成細胞內(nèi)成分流失和作為特異離子運載體影響細胞內(nèi)外離子的正常交換兩種（孫延忠等 ， 2003）。前者如多烯類抗生素制霉菌素（ 兩性霉素 B（ ）等，能選擇性地與真菌細胞膜中的麥角甾醇結(jié)合，導(dǎo)致細胞膜滲透性改變，引起細胞內(nèi)成分外滲（徐錚等， 2001）。后者如短桿菌肽 A（ ）等能結(jié)合并運轉(zhuǎn)特定的陽離子通過雙脂膜，充當(dāng)膜上的離子載體，影響細胞內(nèi)外離子的正常交換，導(dǎo)致細胞喪失調(diào)節(jié)滲透的能力（孫延忠等， 2003）。抑制蛋白質(zhì)合成， （ 過抑制稻瘟病菌（ 基轉(zhuǎn)移酶抑制肽鏈延伸而抑制菌體蛋白質(zhì)的合成（蔣細良等， 1994）。作用于能量代謝系統(tǒng)，抗霉素 A （ ）抑制細胞色素 b 與細胞色素 c 之間的電子傳遞，阻斷了呼吸鏈上的電子傳遞（ 1981）。作用于核酸合成，研究表明灰黃霉素（ 抑制 14擾真菌細胞 合成，從而抑制真菌生長（ 1989）。 提高植物抗病力，井岡霉素 A（ ）能增加水稻體內(nèi)過氧化物酶和苯丙氨酸解氨酶活性，降低海藻糖活性，過氧化物酶和苯丙氨酸解氨酶活性高低與井岡霉素防治水稻紋枯病的效果 呈正相關(guān) ，與海藻糖活性 呈負相關(guān)（張穗， 2001） 。這類抗生素通過提高植株自身的免疫抗病能力而起到防病作用。 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 引言 2 日本是世界上第一個大規(guī)模生產(chǎn)農(nóng)用抗生素的國家，在農(nóng)用抗生素的研究和應(yīng)用方面一直處于世界前列。國際上農(nóng)用抗生素研究比較有特色的 5 個機構(gòu)中，日本占 3 家，分別是明治制藥、北里研究所 和 理化研究所（朱昌雄等， 2000）。二十世紀五十至六十年代后期，日 本率先研制成功了用于防治水稻三大病害（稻瘟病、紋枯病、白葉枯?。┑目股?殺稻瘟菌素 S、春日霉素、多氧霉素和有效霉素，并實現(xiàn)了產(chǎn)品的工廠化生產(chǎn)，推動了世界農(nóng)用抗生素的發(fā)展。此后研制出的滅粉霉素、奈良霉素、滅孢素、四抗菌素、米爾比霉素及雙丙氨膦在工業(yè)化生產(chǎn)中都獲得了成功。 美國從 二十世紀六十年代開始在食用動物的飼料中添加抗生素，到九十年代作為飼料添加劑的農(nóng)用抗生素已超過其它各種類型的農(nóng)用抗生素，與醫(yī)用抗生素產(chǎn)量持平。青霉素、四環(huán)素、泰樂菌素、鏈霉素、螺旋霉素等都曾作為飼料添加劑而使用 ,此后又將多種抗生素用于 植物保護（ 1986）。 我國的農(nóng)用抗生素研究起步于二十世紀五十年代。尹莘耘先生 1953 年從陜西涇陽分離到對棉花黃萎病有一定作用的“ 5406”菌株，揭開了我國農(nóng)用抗生素研究的序幕。 20 世紀 70 年代開發(fā)出防治水稻紋枯病的井岡霉素， 20 多年來經(jīng)久不衰，近幾年來年產(chǎn)量達 3000，防治對象也擴大到小麥、玉米等作物的紋枯?。ㄉ蛞?， 1996）。此后相繼開發(fā)和應(yīng)用了農(nóng)抗 120、公主嶺霉素、多效霉素等農(nóng)用殺菌抗生素。進入 20 世紀 90 年代后，抗生素的研究開發(fā)進入一個新的研究發(fā)展高潮，中生菌素、武夷菌素 、寧南霉素等一大批抗菌素得到開發(fā)，殺蟲抗生素的研究開發(fā)也得到迅速發(fā)展，先后成功開發(fā)了瀏陽霉素、華光霉素、阿維菌素。 縱觀農(nóng)用抗生素發(fā)展的歷史，有三件里程碑性質(zhì)的事件。殺稻瘟菌素 S（ 發(fā)現(xiàn) 是 農(nóng) 用 抗生 素 發(fā)展過 程 中 的 第一 塊 里程碑 。 產(chǎn) 生 菌為 灰 色鏈霉 菌 （ , 1958 年由日本 人研制成功， 1961 年大面積用于稻瘟病的防治，取代了化學(xué)農(nóng)藥有機汞制劑在防治稻瘟病上的應(yīng)用（蔣細良，謝德齡， 1994）。殺稻瘟菌素 S 的發(fā)現(xiàn)和工業(yè) 化使農(nóng)用抗生素的開發(fā)研究進入新時期。 1967 年莫能菌素（ 發(fā)現(xiàn)是農(nóng)抗發(fā)展史上的第二塊里程碑（ et 1979）。產(chǎn)生菌為肉桂地鏈霉菌（ , 由 莫能菌素對雞的球蟲病有很強的抑制作用， 1978 年經(jīng)美國 準作為畜用抗生素大量生產(chǎn)，也是目前歐共體批準的可用于飼料添加劑的四個抗生素之一。 20 世紀 70年代末至 80 年代初阿維菌素（ 發(fā)現(xiàn)是抗生素在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域應(yīng)用的第三個里程碑。阿維菌 素是由阿維鏈霉菌（ 生的一組結(jié)構(gòu)相似的大環(huán)內(nèi)脂類抗生素，原始菌株由日本從日本靜岡縣的土樣中分離出，該菌株后被送到美國默克公司（ 發(fā)。阿維菌素對螨類有很高的殺蟲活性，對許多危害作物的昆蟲也有殺蟲活性，殺蟲范圍廣（ 1991）。 殺稻瘟菌素 S 研制成功后，幾十年來研究開發(fā)了很多農(nóng)用抗生素，據(jù)朱昌雄等（ 2000）， 1983中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 引言 3 至 1996 年報道的新農(nóng)用抗生素專利共有 150 多種。以下三個表格（表 分別列出了近年來發(fā)展的主要殺菌抗生素、殺蟲抗生素及除草抗生素。 表 菌抗生素 生素 產(chǎn)生菌 作用對象 化學(xué)結(jié)構(gòu)類型 研制人 文獻來源 殺稻瘟菌素 S 稻稻瘟病 嘧啶核苷類 細良，謝德齡，1994 春日霉素 日鏈霉菌 S. 稻稻瘟病 川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)藥研究所， 1972 多氧霉素 可鏈霉菌阿蘇變種 S 稻紋枯病 啶核苷類 川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)藥研究所， 1972 井岡霉素 水鏈霉菌井岡變種 S 稻紋枯病 基 糖苷類 上海農(nóng)藥研究所 沈寅初， 1998 滅粉霉素 . 粉病 核苷類 et 1978 中生菌素 紫灰鏈霉菌海南變種 S. 果綸紋病(白菜軟腐病 (水稻白葉枯病(中國農(nóng)科院生防所 朱昌雄等， 1996 武 夷菌素 吸水鏈霉菌武夷變種 瓜白粉病 苷類 中國農(nóng)科院植保所 曾洪梅等， 1995 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 引言 4 表 蟲抗生素 生素 產(chǎn)生菌 作用對象 化學(xué)結(jié)構(gòu)類型 研制人 文獻來源 殺螨素 色鏈霉菌 S. 類 大環(huán)內(nèi)脂類 et et 971 阿維菌素 維鏈霉菌 S. 翅目、鞘翅目、半翅目、雙翅目、同翅目及膜翅目害蟲，螨類 大環(huán)內(nèi)脂類 日本北里研究所和美國默克公司 1991 米爾比霉素類和蚜蟲，柑橘紅蜘蛛、棉花紅蜘蛛 大環(huán)內(nèi)脂類 et 1980 華光霉素類和真 菌 核苷肽類 西德拜爾公司 趙永貴， 1995 莫能菌素美爾球蟲 聚醚類 . et 979 殺蚜素 淺灰鏈霉菌杭州變種 S. 蚜、煙蚜、棉紅蜘蛛、蘋果紅蜘蛛 浙江農(nóng)科院 陳傳盈等 ,1980 韶關(guān)霉素 淺黃鏈霉菌韶關(guān)變種 類和蚜蟲 上海農(nóng)科院 匡開源等， 1983 瀏陽霉素色鏈霉菌瀏陽變種 S. 類 大環(huán)內(nèi) 脂類 上海農(nóng)藥研究 所 謝立貴 ,1993 表 草抗生素 生素 產(chǎn)生菌 作用對象 化學(xué)結(jié)構(gòu)類型 研制人 文獻來源 雙丙氨膦水鏈霉菌 子葉和雙子葉雜草 三肽化合物 橘邦隆等 張玉芬，黃興盛，1987 除草霉素水鏈霉菌 子葉和雙子葉雜草 安莎族類 張玉芬，黃興盛，1987 目前我國登記注冊的農(nóng)用抗生素品種有 20 種（表 產(chǎn)品 170 個，生產(chǎn)廠家達 253 家，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 引言 5 年產(chǎn)量約 67 萬噸（顧寶根，姜輝， 2000；朱昌雄，蔣細良， 2000）。 表 國登記注冊的農(nóng)用抗生素品種 品名 產(chǎn)生菌 防治對象 井岡霉素 稻紋枯病 井岡霉素 A 稻紋枯病 農(nóng)抗 120 瓜白粉病、西瓜枯萎病、碳疽病等 春雷霉素 稻稻瘟病、黃瓜黃萎病 多氧霉素 茄早疫病 滅瘟素 稻稻瘟病 農(nóng)用鏈霉素 菌性病害 公主嶺霉素 麥黑穗病 赤霉素 長調(diào)節(jié)作用 赤霉素 A 長調(diào)節(jié)作用 梧寧霉素 11371 蘋果腐爛病 中生菌素 果綸紋病、白菜軟腐病、水稻白葉枯病 武夷菌素 瓜白粉病 寧南霉素 草花葉病毒病 放線菌酮 云紋枯病 華光霉素 楂葉螨 瀏陽霉素 螨類 阿維菌素 S 翅目，鞘翅目昆蟲，螨類 雙丙氨膦 S. 子葉和雙子葉雜草 菜喜 菜蛾、甜菜夜蛾、薊馬 產(chǎn)水平過低限制了農(nóng)用抗生素的產(chǎn) 業(yè)化水平 農(nóng)用抗生素主要應(yīng)用于防治農(nóng)作物的病蟲草害，產(chǎn)品要投放市場，因此必須要考慮投入產(chǎn)出比。幾十年來，人們研究開發(fā)了很多的農(nóng)用抗生素，我國篩選到的農(nóng)抗菌種超過 100 多種，其中完成室內(nèi)測定和田間小區(qū)實驗的品種有 50 多種。但是很多農(nóng)用抗生素的生產(chǎn)化水平太低或成本太高，無法與眾多的性質(zhì)優(yōu)良、價格低廉的化學(xué)農(nóng)藥相競爭。 我國生產(chǎn)農(nóng)用抗生素的企業(yè) 200 多家，除少數(shù)生產(chǎn)井岡霉素、阿維菌素的企業(yè)有一定規(guī)模外，絕大部分為小企業(yè)，生產(chǎn)設(shè)備和條件差，資金和技術(shù)力量不足，產(chǎn)品質(zhì)量差，市場份額小，難于進一步發(fā)展。農(nóng)用抗生素為微生 物發(fā)酵產(chǎn)品，產(chǎn)品質(zhì)量受菌株及各種發(fā)酵條件的影響。部分工廠的發(fā)酵工藝技術(shù)還比較落后，造成不同批次產(chǎn)品質(zhì)量存在差異，達不到市場要求。 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 引言 6 此外在農(nóng)用抗生素研究開發(fā)的過程中，工作側(cè)重于菌種選育、發(fā)酵實驗、防效改進，而對于中間環(huán)節(jié)的工業(yè)發(fā)酵工藝和農(nóng)藥制劑加工技術(shù)研究重視不足，造成研究發(fā)現(xiàn)的具有應(yīng)用前景的農(nóng)抗很多，但成功實現(xiàn)商品化的不多，而已商品化的制劑產(chǎn)品的理化指標和穩(wěn)定性也存在問題，如含水偏高、顆粒粒度大、懸浮率低、穩(wěn)定性差等（顧寶根，姜輝， 2000）。 由上海農(nóng)藥研究所研制的井岡霉素是為數(shù)不多的在產(chǎn)業(yè)化過程中取得成 功的農(nóng)抗品種之一。從二十世紀七十年代問世以來，年產(chǎn)量穩(wěn)定在 30004000 噸，年應(yīng)用面積約 2 億畝，占我國農(nóng)藥殺菌劑（每年 5 萬噸原藥）總量的 8%左右（沈寅初 ,1996）。高產(chǎn)菌株的選育成功和高溫短周期發(fā)酵工藝，大幅度的提高了產(chǎn)生菌的效價，降低了生產(chǎn)成本和應(yīng)用成本。高效、經(jīng)濟、安全，長期來無抗藥性發(fā)現(xiàn)，使井岡霉素成為我國農(nóng)藥中最安全、有效、價廉的品種之一。 藥性菌株的出現(xiàn)降低了農(nóng)用抗生素的安全性 農(nóng)用抗生素作為生物農(nóng)藥具有安全、易分解、無殘留、不污染環(huán)境的優(yōu)點。但另一方面，也和化學(xué)農(nóng)藥一樣是具 有一定分子量的化學(xué)物質(zhì)，也有安全性及與環(huán)境相容性的問題。農(nóng)用抗生素的對象是農(nóng)作物，人或其他生物都可能直接或間接的攝入，開發(fā)和應(yīng)用時必須綜合考慮作用對象、植物、動物、人類及環(huán)境等各個方面的因素。 抗生素在臨床上的廣泛使用和不合理的使用導(dǎo)致致病菌產(chǎn)生了廣泛的耐藥性，不僅降低了抗生素的使用效率，也嚴重威脅了人類的健康。同樣的，關(guān)于植物病原微生物對抗生素的耐藥性已經(jīng)有不少的報道，殺稻瘟菌素 S、春日霉素、多氧霉素、鏈霉素等農(nóng)抗都發(fā)現(xiàn)有抗藥性的菌株產(chǎn)生，雖然田間還沒有發(fā)現(xiàn)耐藥性病原菌的大規(guī)模發(fā)生，但是可以 估計隨著抗生素的實際應(yīng)用的規(guī)模擴大耐藥性的菌株的出現(xiàn)必將成為引起注意的一個問題?？股啬退幮缘脑黾右笤谘芯块_發(fā)以及使用農(nóng)用抗生素時，在保證有效的基礎(chǔ)上對其安全性進行評價，詳盡的研究對環(huán)境的影響和耐藥性菌株的產(chǎn)生速率。因此，大大提高了農(nóng)用抗生素的研究開發(fā)難度。為了防止、延緩耐藥性菌株的形成，一方面要尋找不易產(chǎn)生耐藥性菌株的抗生素，另一方面可以采用混合使用兩種抗生素或抗生素與化學(xué)農(nóng)藥混合使用的方法，可以顯著降低耐藥菌的出現(xiàn)速度。 選新的農(nóng)用抗生素品種 通過大量的 篩選抗生素產(chǎn)生菌，開發(fā)出具有新型結(jié)構(gòu)的抗生素。樣本采集范圍從土壤微生物擴展到海洋微生物，同時采用新的篩選方法和篩選模型以篩選各種抗菌、殺蟲、除草的抗生素。 育高產(chǎn)菌株 抗生素發(fā)酵單位是其能否實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)關(guān)鍵，選育高產(chǎn)菌株是提高生長能力的重要手段，是商業(yè)化發(fā)酵發(fā)展的基石，而且伴隨整個發(fā)酵開發(fā)的全過程。菌株選育方法包括自然選育和誘變育種。由于自然突變的頻率低，突變的幅度不大，單純依靠自然選育有很大的局限性。誘變育種中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 引言 7 則具有突變頻率高，變異幅度大，高效的優(yōu)點。上海農(nóng)藥研究所在選出井岡霉素之初，發(fā)酵 效價不到 100 單位，經(jīng)過反復(fù)誘變育種，目前發(fā)酵效價已達 30000 單位，工廠生產(chǎn)穩(wěn)定在 20000 單位以上，成本大幅降低，使用面積逐年擴大（曾廣然， 1989）。誘變方法除傳統(tǒng)的物理和化學(xué)誘變外，基因重組技術(shù)（包括原生質(zhì)體融合、轉(zhuǎn)化和結(jié)合等）以及基因工程等現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于菌種的選育。 化發(fā)酵過程 微生物發(fā)酵過程的生產(chǎn)水平不僅取決于生產(chǎn)菌種本身的性能，還要賦以合適的環(huán)境條件。在選育高產(chǎn)菌株的基礎(chǔ)上，必須了解生產(chǎn)菌在發(fā)酵過程中的代謝變化規(guī)律，及與發(fā)酵有關(guān)的參數(shù)及其影響，找到與之配套的培 養(yǎng)基、培養(yǎng)溫度、 氧等發(fā)酵條件，優(yōu)化發(fā)酵工藝，使生產(chǎn)菌種處于產(chǎn)物合成的優(yōu)化環(huán)境中，提高發(fā)酵單位。四川抗菌素工業(yè)研究所褚以文（ 1999）通過對多種多因素發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化方法的分析比較和運用，選擇 、限制性隨機平衡法、響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計法、均勻設(shè)計法和改良單純型優(yōu)化法研制出了微生物培養(yǎng)基優(yōu)化程序 件。張嗣良等（ 2002）在研究反應(yīng)器物料流與微生物細胞代謝流的相關(guān)特性后，提出了以細胞代謝流為核心的生物反應(yīng)工程學(xué)的觀點及基于參數(shù)相關(guān)的發(fā)酵過程多水平問題研究的優(yōu)化技術(shù)，并成功應(yīng)用 在青霉素、紅霉素、金霉素、鏈霉素等發(fā)酵產(chǎn)品中。 造農(nóng)用抗生素的結(jié)構(gòu) 通過化學(xué)方法改造已知的農(nóng)用抗生素的結(jié)構(gòu)或者以已知的農(nóng)用抗生素為先導(dǎo)化合物合成出新的農(nóng)抗品種。如阿維菌素改造為伊維菌素、氨甲基或乙酰氨基阿維菌素，使其藥效提高，毒性降低（ et 1993）。以 先導(dǎo)化合物，英國捷利康公司開發(fā)出了 國巴斯夫公司開發(fā)出 本鹽野義制藥公司開發(fā)出 華公司開發(fā)出亞羅， 1999）。 1. 2 農(nóng)用抗生素產(chǎn)生菌及菌種選育 自然界已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的近萬種抗生素中，約有 70%是由鏈霉菌產(chǎn)生的（ 1996）。我國從 50年代至今先后研制的井岡霉素、春雷霉素、中生菌素等二十多個主要農(nóng)用抗生素品種，幾乎全部是由鏈霉菌產(chǎn)生的抗生素，都是鏈霉菌在生命活動中產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物。 鏈霉菌是一種放線菌，革蘭氏染色陽性。細胞結(jié)構(gòu)與細菌相近，沒有真菌所含的纖維素和幾丁質(zhì)，細胞核沒有核膜，核糖蛋白的的亞單位也是 30S 和 50S，因此和細菌一樣均屬原核生物界。鏈霉菌屬具有分枝狀菌絲 并產(chǎn)生分生孢子，這又和真菌很相似。鏈霉菌的孢子遇到合適的環(huán)境后中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 引言 8 開始萌發(fā)，產(chǎn)生芽孢管，并逐步形成基質(zhì)菌絲。菌落生長 12 天后開始向上生長出松散的氣生菌絲，基質(zhì)菌絲的許多細胞開始溶解死亡。隨著菌落的生長，菌絲的生長變慢，次級代謝開始進行。當(dāng)氣生菌絲延伸結(jié)束后，菌絲形成橫隔將菌絲分裂為大小相近的小室，一個小室形成一個孢子。這樣的數(shù)十個孢子形成孢子鏈，最終形成成熟的孢子，由孢子鏈釋放出的單個孢子在合適的條件下萌發(fā)，又進入下一個生命周期（ 1993）（圖 圖 藍色鏈霉菌的生命周期圖 （譚華容， 1993） 鏈霉菌抗生素生物合成基因的結(jié)構(gòu)特點 抗生素生物合成一般包括幾十步生化反應(yīng)，涉及幾十個基因，這些基因在染色體上成簇排列，包括結(jié)構(gòu)基因、調(diào)控基因與抗性基因。一個或多個生物合成基因緊密連鎖，有的在結(jié)構(gòu)基因之間，有的在結(jié)構(gòu)基因的外部（ 989）。絕大多數(shù)鏈霉菌的抗生素生物合成基因都在染色體上，極少數(shù)在質(zhì)粒上，如天藍色鏈霉菌的次甲基霉素（ 生物合成基因 就在其巨型的線性質(zhì)粒 （ 1985）。 結(jié)構(gòu)基因編碼抗生素生物合成過程中一系列的酶，每種抗生素各不相同。調(diào)控基因調(diào)控結(jié)構(gòu)基因表達與否；抗性基因使產(chǎn)生抗生素的微生物避免自殺?？股禺a(chǎn)生菌通過以下機制使自身免受所產(chǎn)抗生素的毒害作用（ 1989）： 對所產(chǎn)抗生素進行酶促修飾，如 1992； et 1992）、 et 1991），使其在體內(nèi)失效； 修飾自身的 某個位點而對自身所產(chǎn)抗生素不敏感； 通過改變膜的通透性或通過一些膜上的運輸?shù)鞍准皶r把產(chǎn)生的抗生素排出體外。 鏈霉菌的各種菌種選育方法無不通過改變基因組中的 列，改造生物機能，獲得高產(chǎn)中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 引言 9 或擁有理想特性的突變株。突變的方法不盡相同，包括誘變育種，遺傳重組育種和基因工程育種。 變育種 以突變和篩選為中心的傳統(tǒng)誘變育種技術(shù)在農(nóng)用抗生素工業(yè)化生產(chǎn)的過程中始終起著重要作用。誘變育種使用各種理化因子誘導(dǎo) 變，通過大量的篩選工作發(fā)現(xiàn)理想的突變菌株。不同的誘變因 素分別從亞細胞、分子或基因水平對抗生素產(chǎn)生菌的遺傳物質(zhì)發(fā)生作用，通過堿基置換、移碼突變或染色體畸變來改變菌種的特性。但是突變劑大多缺乏特異性的靶標，導(dǎo)致大多數(shù)的突變是有害的，正向突變率低，篩選工作量大。但與其他的育種方法相比，誘變育種具有操作簡便，速度快、使用范圍廣，無需菌株背景知識等優(yōu)點 , 誘發(fā)突變結(jié)合發(fā)酵篩選仍然是最常用最直接有效的菌種選育手段。 誘變因素有物理、化學(xué)兩大類。物理誘變因素很多，有紫外線、 中子、 年來還發(fā)展了激光輻射誘變及離子注入誘發(fā)突變 。激光輻射已用于金霉素產(chǎn)生菌（吳振倡， 1992），紅霉素產(chǎn)生菌（陳五嶺等， 1998）等。離子注入技術(shù)是 20世紀 80 年代興起的一種材料表面處理技術(shù)，中科院等離子物理研究所余增亮等人首先把離子注入技術(shù)用于作物品種改良和生物效應(yīng)研究， 1998 年以來離子束開始應(yīng)用于微生物育種（袁成凌，余曾亮， 2003）。使用離子束注入技術(shù)，單寧酶、麥角甾醇的效價分別提高 289、 60（龔加順等， 1999；王紀等， 1998）。在農(nóng)用抗生素研究中，離子注入技術(shù)現(xiàn)已用于之江菌素，利福霉素等的誘變育種（余增亮等， 1991）?；瘜W(xué)誘變劑包 括堿基類似物，如 55 88；烷化劑類，如氮芥、硫酸酯或磺酸酯、亞硝基化合物、重氮烷等；移碼突變劑類，如丫啶黃，丫啶橙、溴乙啶等。硫酸二乙酯（ 氮芥、 N較為有效的誘變劑，在適當(dāng)條件下，能以較小的死亡率得到較大的變異率。其中 每一細胞有誘發(fā)一次至多次突變的效力，有突出的誘變效應(yīng)而被稱為超誘變劑（章名春， 1984）。 不同的誘變因素作用機制和作用效率不同（胡海峰等， 2002），同一種誘變因素對一種微生物有較強的作用 ，一般對其它微生物效應(yīng)也較強，但由于不同微生物對誘變劑的細胞透性可能不同，對同一種誘變劑可能表現(xiàn)不同作用。所以在選育特定菌株時要正確選擇誘變因素。圖 出了幾種典型誘變劑的作用機制（顧覺奮等， 2001；周俊初， 1998）。 H 3 3 2 8 0 n 0 n C H 3 線 劑N 2 C H 2 N C H 2 C H 2 C 3N 3 配 對 錯 誤 配 對G C G T: :. . 圖 外線作用下胸腺嘧啶二聚體的形成 圖 化導(dǎo)致鳥嘌呤與胸腺嘧啶錯誤配對 V 國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 引言 10 r 5 B u A 烯 醇 式 5 B u G: :. H 2 O 5入后引起 轉(zhuǎn)換 圖 胺誘發(fā)的單方面轉(zhuǎn)換 T C O 2 N O 2圖 硝酸誘發(fā) 轉(zhuǎn)換 T C 了獲得更好的誘變效果，常將誘變因素復(fù) 合處理，從而可以起到一定協(xié)同作用。復(fù)合處理有以下幾類：（ 1）兩種或多種誘變因素先后使用。（ 2）同一種誘變因素連續(xù)重復(fù)使用，即一次處理后的菌株培養(yǎng)繁殖后再數(shù)次處理，反復(fù)多次篩選誘變；（ 3）兩種或多種誘變因素同時使用。 傳重組育種 采用結(jié)合、轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)和原生質(zhì)體融合等遺傳重組手段獲得具有多組合優(yōu)良性狀的菌種，在抗生素產(chǎn)生菌育種工作中占有重要的地位。 結(jié)合是由質(zhì)粒性因子介導(dǎo)的遺傳物質(zhì)的單向傳遞，目標比較明確，缺點是應(yīng)用范圍小，頻率低。轉(zhuǎn)化可適用于非相關(guān)菌株間的遺傳物質(zhì)傳遞，由細胞直接吸收外源供體細 胞的 段，適合鏈霉