血脂各個項目的不同測定方法.doc

血清脂類測定血漿中的脂類包括膽固醇、膽固醇脂、甘油三酯、磷脂和非酯化脂肪酸等。目前，對有關脂類代謝疾患的診斷和治療過程，均必須檢測血漿（清）中的脂類，通過其含量的變化，對臨床疾患提供協(xié)助診斷的依據(jù)。有關醫(yī)學科研工作，脂類的定量檢測也是一項必備的研究項目。1膽固醇測定血漿中膽固醇及其酯的含量檢測，從方法學上可分為兩大類：一類是化學法包括抽提法和直接測定法，這類方法目前仍在沿用；另一類是酶法測定，方法敏感特異快速，并能自動化分析，已常規(guī)應用?；瘜W測定法種類多，由于顯色反應的特異性不同，其結果有一定的差異。目前公認的參考方法是Abell-Kendall(L-B反應)法。另外，三氯化鐵-硫酸反應法（Zak法）具有顯色穩(wěn)定法、操作簡便、靈敏度約5倍于L-B反應法，膽固醇酯與游離膽固醇顯色程度比較接近等優(yōu)點，缺點是特異性差，干擾因素比L-B法多，如冰醋酸中含有的乙醛酸，血清樣品中的血紅蛋白，膽紅素以及硫酸的質量等因素均可影響Zak方法的準確性，Zak法更適合于科研使用。酶法測定血清膽固醇的方法已被廣泛采用，國產試劑已能滿足臨床的需要。膽固醇測定用的標準品，按美國國家標準局（NBS）出品純度達99.8%,是國際公認的參考物，國內李健齋等已純化制成符合這一要求的膽固醇純品，已供臨床檢測血清膽固醇使用。2甘油三酯測定血漿甘油三酯的測定，目前多以化學法和酶法定量?；瘜W法測定甘油三酯是以脂蛋白變性，水解成甘油，并以甘油為計算依據(jù)。酶法是以特異酶水解甘油三酯，除去脂肪酸，再測定甘油，方法特異，準確而快速，臨床廣為應用。目前甘油三酯測定的方法主要以定量甘油為依據(jù)，然而血清樣品中存在有游離甘油，如何從反應過程中的總甘油中減去游離甘油，多年來一直在研究討論這一問題。若不減去，其測定值將會高于血清樣品中的真值，如果要減去，就必須先測出血清樣品中的游離甘油，甘油三酯的測定方法將增加一個繁雜的步驟，實際工作中難以做到。有報道血清樣品中的游離甘油實際量是0.070.13mmol/L，相當于甘油三酯的0.56.0mmol/L，為此建議，實測的甘油三酯量減去一個校正系數(shù)即：甘油三酯（mmol/L）=0.98總甘油（mmol/L）-0.07（mmol/L）。這一校正系數(shù)也僅適用于健康人，對臨床病人并不一定適用。據(jù)報道，血清樣品的游離甘油一直是個未知數(shù)，無法測準。為此，目前臨床測定血清甘油三酯時，基本上未考慮游離甘油，因為其含量很少，暫且忽略不記。甘油三酯測定的參考物，推薦三油酸甘油酯和三軟脂酸甘油酯混合物（2：1，W/W），此參考物適用于化學法。在酶法測定中，仍以高純度的三油酸甘油酯為參考物。3磷脂測定血清磷脂包括卵磷脂、溶血卵磷脂、神經磷脂、腦磷脂和其他少量磷脂。如需要分別檢測各種磷脂，可以通過薄層層析法、柱層析法和高壓液相色譜法。目前，臨床僅測定血清磷脂總量。血清磷脂總量的測定方法有化學方法和酶法兩大類?；瘜W法是以磷脂中的磷為定量依據(jù)，因為每磷脂分子中都含有一個磷酸根，故將磷脂的磷稱為脂性磷。由于血清中磷脂大部分為卵磷脂，其分子量中磷約占4%，故將脂性磷換算成磷脂的系數(shù)，一般為25。由于化學法均需要抽提，再測抽提液中的磷脂的磷，血清中的磷酸鹽不可能混入抽提液中，因此血清中的磷酸鹽對磷脂測定的干擾很少。酶法是利用磷脂酶進行定量測定。生物體中磷脂酶包括磷脂酶A1、A2、C和D四種。磷脂酶D特異性差，均可水解卵磷脂、溶血卵磷脂和神經磷脂，三者約占血清總磷脂的95%，臨床多用含磷脂酶D 的試劑進行磷脂的定量測定。4游離脂肪酸測定游離脂肪酸屬于未酯化的一類脂肪酸，故又稱為非酯化脂肪酸，其量很少，采用方法必須是靈敏的方法，還需要避免脂肪水解產生脂肪酸的干擾。測定方法有：滴定法需要微量滴定裝置，因為要通過肉眼觀察顏色，難免會有主觀因素的影響，所以難以測定準確，很難用于常規(guī)；光度法，以銅皂法常用；酶法，主要采用特異性不強的脂肪酶D進行檢測，方法特異，快速準確，已常規(guī)應用于臨床。第一節(jié) 膽固醇測定血清中膽固醇包括CE和FC，酯型的CE占70%，F(xiàn)C占30%。CE中的C3的-OH在LCAT作用下，可分別結合亞油酸（43%）、油酸（24%）、軟脂酸（10%）、亞麻油酸（6%）、花生四烯酸（6%）、硬脂酸（3%）等脂肪酸結合而成。血清中膽固醇在LDL中最多，其次是HDL和VLDL、CM最少。血清總膽固醇測定方法分為化學法和酶法兩大類。1化學法化學法一般包括：抽提；皂化；毛地黃皂苷沉淀純化；顯色比色四個階段。代表性的方法有Sperry-Webb法，通過步驟操作過程。常規(guī)操作中多采用省去了、?；蛘哂檬∪?、步驟的Zak-Henly法及省去步驟的Abell-Kendall法，現(xiàn)將此法作為標準參考方法予以引用。2酵法測定CE在膽固醇酯酶（cholesterol esterase）作用下水解成FC和NFFA，TC再經膽固醇氧化酶（cholesterol oxidase,COD）氧化成4膽甾烯酮和H2O2。再分別定量O2的消耗或者H2O2的生成量，或者4膽甾烯酮生成量,以作為TC的定量依據(jù)。該法是目前常規(guī)的應用方法，快速準確，標本用量少，便于自動生化分析儀作批量測定。一、Abell-Kendall改良法1原理血清加入醇溶性氫氧化鉀，使膽固醇從脂蛋白中分離出來，同時使膽固醇酯加水分解成游離膽固醇，加石油醚振搖、抽提，使膽固醇移入石油醚層，分離并取一定量的石油醚層，蒸發(fā)至干，再進行Liebermann-Burchard 顯色反應，620nm比色定量。該法可用于基本功訓練及組織細胞膽固醇的提取定量。2試劑組成代號種類濃度組 成貯存28有效時間R1乙醇優(yōu)質純R2石油醚沸點68，特級純R3水醋酸分析純R4無水醋酸膽固醇分析用，不含HCIR5濃硫酸分析純R6KOH液33%(W/W)KOH10g+H2O 20mlR7乙醇性KOH液R194ml+R66ml臨用前配制R8Liebermann配制后BurchardR420體積+R51體積+R310體積1h試劑*內用完R9膽固醇標準液5.17mmol/L膽固醇標準品200mg+R1100ml0*：在三角燒瓶內，加入無水醋酸，于冰水中冷至10以下，再慢慢加入濃硫酸，混合，靜置10min，又加冰醋酸混勻，備用。3操作 圖15-1 血清膽固醇（Abell法）測定操作圖4計算標準總膽固醇濃度=ESA/EST5.17(mmol/L)二、酶法（CEH、COD-POD法）首先將血清中膽固醇酯在膽固醇酯酶（CEH）水解為游離膽固醇和脂肪酸，膽固醇在膽固醇氧化酶（COD）作用下，生成4-膽甾烯酮和H2O2，再H2O2經過氧化物酶（POD）作用在4-氨基安替比林（4-AA-P）及N-乙基-N-（3-磺基醋酸）-3甲氧基苯胺（N-ethyl-N-(3-sulfopropyl)-manisidine,ESPAS）參與下，生成紅色醌亞胺色素。H2O2+ESPAS+4-氨基安替比林紅色醌亞胺色素（一）手工測定法1試劑組成代號種類濃度組成貯28有效時間Na2HPO450mmol/LNa2H2PO450mmol/L膽酸鈉3mmol/L4-氨基安替比林0.82mmol/LR1*ESPAS14mmol/L24hCarbowax-60000.17mmol/LCEH33U/LCOD117U/LPOD6700U/LR2標準液5.17mmol/L用異丙醇溶解膽固醇*混勻，調pH至6.700.10(25)，或購買試劑盒。酶以活性單位表示。2操作按圖15-2操作。3計算標準總膽固醇濃度=ESA/EST5.17(mmol/L)（二）自動化分析儀測定以CL-7200型全自動生化分析儀檢測為例。1試劑組成A液：CEH、POD、抗壞血酸氧化酶等。B液：COD、4-氨基安替比林等。圖15-2 血清膽固醇測定（酶法）操作圖2上機參數(shù)項 目參 數(shù)方 法終點法波 長雙波長（540nm，700nm）反應溫度3