《工業(yè)微生物》-第六章PPT課件

.,1,工業(yè)微生物,第六章微生物的遺傳變異和育種,.,2,第一節(jié)微生物遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ),微生物的遺傳物質(zhì)是核酸，核酸分為脫氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA),除少數(shù)病毒的遺傳物質(zhì)為RNA外，其余均為DNA。一、遺傳物質(zhì)在微生物細胞內(nèi)存在的方式核酸作為遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)，它具備兩個條件：首先能遺傳給子代，也就是說子代能從上代獲得遺傳物質(zhì)，并能自我復(fù)制；再則能指令生物體合成其他物質(zhì)，使所傳送的基因得以表達。那么，核酸是以怎樣的形式存在于細胞內(nèi)呢？下面從幾個方面來進行闡述。,.,3,第一節(jié)微生物遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ),（一）染色體染色體是遺傳信息的主要攜帶者，是由脫氧核糖核酸(DNA)和組蛋白組成。不論是真核細胞還是原核細胞，它們的大部分DNA都集中在細胞核或核區(qū)（核質(zhì)體）中。但真核細胞的細胞核有核膜包裹，形態(tài)固定的真核，核內(nèi)DNA與組蛋白結(jié)合在一起形成一種在光學(xué)顯微鏡下能見的核染色體；而原核細胞只有無核膜包裹的呈松散狀態(tài)存在的核區(qū)，其中的DNA呈環(huán)狀雙鏈結(jié)構(gòu)，不能與任何蛋白質(zhì),.,4,第一節(jié)微生物遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ),相結(jié)合。不論真核微生物的細胞核還是原核微生物細胞的核區(qū)都是該微生物遺傳信息的大本營和信息庫，因此被稱為核基因組、核染色體組或簡稱基因組。再從細胞內(nèi)的染色體數(shù)目來看，不同的微生物的染色體數(shù)目差別很大，真核微生物常有較多的染色體，如酵母菌屬中有的種有17條之多，而原核微生物中常只有一條裸露的環(huán)狀DNA大分子核酸，即一條染色體。,.,5,第一節(jié)微生物遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ),（二）核酸核酸是由數(shù)十個至數(shù)以萬計的單核苷酸聚合而成的生物大分子。在真核微生物中，DNA總是與纏繞的組蛋白同時存在的，而原核微生物的DNA都是單獨存在的。從核酸的組成、結(jié)構(gòu)和長度來看，不管是DNA還是RNA，絕大多數(shù)是雙鏈的。此外，同是雙鏈DNA，其存在狀態(tài)有的呈環(huán)狀（如原核微生物和部分病毒），有的呈線狀（如部分病毒），而有的則呈麻花狀（如細菌質(zhì)粒）。而對于DNA長度（基因組的大?。煌奈⑸锲浠蚪M大小的差別很大。一般可用bp（堿基對）、kb（千堿基對）和Mb（兆堿基對）作單位。,.,6,第一節(jié)微生物遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ),（三）基因和密碼子基因是生物體內(nèi)具有自主復(fù)制能力的最小遺傳功能單位?；虻膶嵸|(zhì)是一條具有特定核苷酸序列的核酸分子片段。染色體是由眾多基因所構(gòu)成的。每個基因大體在10001500bp的范圍，相對分子質(zhì)量約為6.7105。有關(guān)基因的概念和種類是遺傳學(xué)中內(nèi)容最豐富、發(fā)展最迅速的熱點之一。遺傳密碼是指DNA鏈上各個核苷酸的特定排列順序。遺傳密碼的信息單位是密碼子，每個密碼子是由三個核苷酸順序即1個三聯(lián)體所組成，它是負載遺傳信息的基本單位。,.,7,第一節(jié)微生物遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ),（四）核苷酸各種遺傳密碼子儲存著各自對應(yīng)的信息，而單個核苷酸或堿基則是密碼子的組成單位，是基因突變的最小單位。從絕大多數(shù)微生物的DNA組分來看，其分別由腺苷酸、胸苷酸、鳥苷酸和胞苷酸4種脫氧核苷酸組成。其上的堿基分別為腺嘌呤（A）、胸腺嘧啶（T）、鳥嘌呤（G）和胞嘧啶（C）。,.,8,第一節(jié)微生物遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ),二、DNA的結(jié)構(gòu)與復(fù)制（一）DNA的結(jié)構(gòu)1953年，Watson和Crick首先提出DNA的結(jié)構(gòu)模型，認為DNA是由兩條反向平行的多核苷酸組成的雙螺旋結(jié)構(gòu)，兩條多核苷酸鏈通過堿基間的氫鍵相結(jié)合。此結(jié)構(gòu)已經(jīng)掃描隧道顯微鏡所證實。,.,9,第一節(jié)微生物遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ),（二）DNA的復(fù)制在細胞分裂和傳代的過程中，作為微生物遺傳物質(zhì)的DNA必須準確無誤地復(fù)制，才能使子代細胞含有相同的遺傳信息，以保持物種的穩(wěn)定。1958年，Meselson和Stahl用15N標記的堿基培養(yǎng)大腸桿菌，并定時取樣分離DNA，進行密度梯度離心。研究結(jié)果證明，DNA是以獨特的半保留方式進行復(fù)制的，即每一子代DNA分子的一條鏈來自親代，另一條鏈是新合成的。,.,10,第一節(jié)微生物遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ),三、基因表達在所有的生物中，基因的主要功能是把遺傳信息轉(zhuǎn)變?yōu)樘囟ò被犴樞虻亩嚯模瑥亩鴽Q定生物性狀的過程，這一過程稱為基因表達?；虮磉_包括以下兩個步驟，首先以DNA為模板，通過RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄出mRNA（信使RNA），然后將mRNA的堿基順序翻譯成由相應(yīng)氨基酸順序組成的蛋白質(zhì)（圖6-1)。,.,11,第一節(jié)微生物遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ),.,12,第一節(jié)微生物遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ),由此可見，DNA是間接控制著蛋白質(zhì)的合成，即由信使RNA（mRNA）作中間媒介。mRNA是在核內(nèi)或核區(qū)中以DNA為模板，在依賴于DNA的RNA多聚酶的參與下合成的。mRNA全盤轉(zhuǎn)錄了DNA的全套信息。而在參與蛋白質(zhì)合成的翻譯過程中，則以信使RNA為模板，在核糖體上由tRNA攜帶特定氨基酸到核糖體上與其上所附著的mRNA分子的密碼子一一對號入座。從而將一個個氨基酸在核糖體上以信使RNA的信息翻譯成氨基酸的序列，直至終止密碼為止，多肽從核糖體上脫下來，形成具有活性的蛋白質(zhì)分子。,.,13,第二節(jié)菌種分離,自然界中微生物資源極其豐富，土壤、水、空氣、動植物及其腐敗殘骸都是微生物的主要棲居和生長繁殖場所。微生物種類之多，至今仍是一個難以估測的未知數(shù)。從微生物的營養(yǎng)類型和代謝產(chǎn)物及其能在各種極端環(huán)境條件（高熱、高壓、低溫、強堿、強酸及高滲透壓等）下生存的角度分析，微生物種類應(yīng)大大超過所有動植物之和。隨著微生物學(xué)研究工作的不斷深入，微生物菌種資源開發(fā)和利用的前景十分廣闊。新的微生物菌種需要從自然生態(tài)環(huán)境中混雜的微生物群中挑選出來，因此必須要有快速而準確的新種分離和篩選方法。典型的微生物新種分離篩選的具體過程大體可分為采樣、增殖、純化和性能測定等步驟。,.,14,第二節(jié)菌種分離,一、采樣采樣就是從自然界中采集含有目的菌的樣品。采樣應(yīng)根據(jù)篩選的目的、微生物分布情況、菌種的主要特征及其生態(tài)關(guān)系等因素，確定具體的時間、環(huán)境和目標物。土壤是微生物的大本營，土壤中微生物的數(shù)量和種類受土壤的營養(yǎng)環(huán)境、土壤表面的植被、溫度、濕度、通風(fēng)情況、養(yǎng)分、水分、酸堿度和光照等多種因素的影響，故在采樣時應(yīng)予以重視。,.,15,第二節(jié)菌種分離,土壤的營養(yǎng)環(huán)境影響微生物數(shù)量和種類的分布。一般菜園和耕作層土壤是有機質(zhì)較多的土層，常以細菌和放線菌為主；果園樹根土層中，酵母菌含量較高；動植物殘體及霉腐土層中，分布著較多的霉菌。此外，河流湖泊的淤泥中能分離到產(chǎn)甲烷菌；油田和煉油廠周圍土層中常見分解石油的微生物等。土壤的植被情況與微生物的類型有著一定的關(guān)系。如豆科植物根系土中，往往存在著根瘤菌；瓜田、果樹下的土壤中酵母菌較多。,.,16,第二節(jié)菌種分離,土壤的深度不同，其通風(fēng)、養(yǎng)分、水分、光照等情況就不同，表層土由于日光直接照射，水分較少，不利于微生物生長，所以微生物數(shù)量較少，一般離表層515cm深處的土層含微生物最多。季節(jié)和溫濕度對微生物的生長也有很大的影響。由于春秋季節(jié)溫度、濕度對微生物的生長繁殖最合適，因此，土壤中微生物數(shù)量最多，所以春秋兩季適合于采樣。,.,17,第二節(jié)菌種分離,采集土樣時，應(yīng)在選好適當?shù)牡攸c后，用不銹鋼采樣鏟去除表土，取離地面515cm處的土樣幾十克，盛于預(yù)先滅菌的牛皮紙袋、塑料袋或玻璃瓶中，密封好，并標明時間、地點和環(huán)境情況等，以備查考。各種水體也是工業(yè)微生物菌種的重要來源，許多具有光合作用能力的微生物及兼性或?qū)Ｐ詤捬跷⑸锒寄軓母鞣N水體中篩選得到。,.,18,第二節(jié)菌種分離,二、增殖在采集的樣品中，一般待分離的菌種在數(shù)量上并不占優(yōu)勢，為提高分離的效率，可以對采集到的樣品進行一次甚至多次增殖培養(yǎng)。增殖培養(yǎng)也稱富集培養(yǎng)，就是在培養(yǎng)基中投放和添加特殊的養(yǎng)分或抗菌物質(zhì)，使所需菌種的數(shù)量相對增加。其實質(zhì)是使天然樣品中的劣勢菌轉(zhuǎn)變?yōu)槿斯きh(huán)境中的優(yōu)勢菌，便于將它們從樣品中分離。,.,19,第二節(jié)菌種分離,三、純化增殖培養(yǎng)的結(jié)果并不能獲得微生物的純種。即使在增殖培養(yǎng)過程中設(shè)置了許多限制因素，但其他微生物并沒有死去，只是數(shù)量相對減少，一旦遇到適宜條件就會快速生長繁殖。故增殖后得到的微生物培養(yǎng)物仍是一個各類微生物的混合體。為了獲得某一特定的微生物菌種，必須進行微生物的純化即純培養(yǎng)。,.,20,第二節(jié)菌種分離,常用的菌種純化方法很多，大體可將它們分為二個層次：一個層次較粗放，一般只能達到“菌落純”的水平，從“種”的水平來說是純的，其方法有劃線分離法，涂布分離法和稀釋分離法。劃線分離法簡便而快速，即用接種針挑取微生物樣品在固體培養(yǎng)基表面劃線，適當條件下培養(yǎng)后，獲得單菌落；涂布分離法與劃線法類似，用涂布棒蘸取培養(yǎng)液，或先將少量培養(yǎng)液滴在固體培養(yǎng)基表面，再用涂布棒在固體培養(yǎng)基表面均勻涂布；稀釋分離法所獲得的單菌落更加分散均勻，獲得純種的機率較大。該法是將降至60左右的固體培養(yǎng)基與少量培養(yǎng)液混勻后，再澆注成平板以獲取單菌落。,.,21,第二節(jié)菌種分離,另一層次是較為精細的單細胞或單孢子分離法，它可達到細胞純即菌株純的水平。這種方法的具體操作方法很多，最簡便的方法是利用培養(yǎng)皿或凹玻片等分離小室進行細胞分離。也可以利用復(fù)雜的顯微操作裝置進行單細胞挑取。如果遇到不長孢子的絲狀菌，則可用無菌小刀切取菌落邊緣疏稀的菌絲尖端進行分離移植，也可用無菌毛細管插入菌絲尖端，以獲取單細胞。在具體的工作中，究竟采取哪種方法，應(yīng)視微生物的實際情況和實驗條件而定。為了提高分離篩選工作的效率，除增殖培養(yǎng)時，應(yīng)控制增殖條件外，在純種分離時，也應(yīng)控制適宜的培養(yǎng)條件，并選用特異的檢出方法和篩選方案。,.,22,第二節(jié)菌種分離,四、篩選篩選是對分離獲得的純培養(yǎng)菌株進行生產(chǎn)性能的測定，從中選出適合生產(chǎn)要求的菌株。在菌種純化過程中能獲得大量的目標菌株，它們都具備一些共性，但只有經(jīng)過進一步的篩選，才能確定哪些菌株更符合生產(chǎn)要求。篩選分為初篩和復(fù)篩兩步：初篩以量為主，對所有分離菌株進行粗略的生產(chǎn)性能測試；復(fù)篩以質(zhì)為主，對經(jīng)初篩所獲得的少量生產(chǎn)潛力較大菌株進行比較精確的生產(chǎn)性能測試。,.,23,第三節(jié)基因突變和誘變育種,微生物菌種的選育是建立在遺傳和變異基礎(chǔ)上的。基因突變是微生物變異的主要源泉。人工誘變又是加速基因突變的重要手段。以人工誘變?yōu)榛A(chǔ)的微生物誘變育種，具有速度快、收效大、方法簡單等優(yōu)點，它是菌種選育的一個重要途徑，在發(fā)酵工業(yè)菌種選育上具有卓越的成就，迄今為止國內(nèi)外發(fā)酵工業(yè)中所使用的生產(chǎn)菌種絕大部分是人工誘變選育出來的。誘變育種在抗生素工業(yè)生產(chǎn)上的作用更是無可比擬，幾乎所有的抗生素生產(chǎn)菌都離不開誘變育種的方法。我國微生物工業(yè)的發(fā)展，是與菌種的選育工作的發(fā)展緊密聯(lián)系的。隨著菌種選育取得重要的成就，發(fā)酵工業(yè)的生產(chǎn)也得以迅速的發(fā)展、擴大和提高。,.,24,第三節(jié)基因突變和誘變育種,一、基因突變基因突變是最基本的遺傳變異現(xiàn)象之一。由于微生物內(nèi)部因素和自然環(huán)境的影響，遺傳物質(zhì)在不斷地發(fā)生變異，同時微生物本身還具有對基因突變的修復(fù)能力，從而保持了物種的穩(wěn)定性。,.,25,第三節(jié)基因突變和誘變育種,（一）突變的概念基因突變簡稱突變，是變異的一類，泛指細胞內(nèi)（或病毒顆粒內(nèi)）遺傳物質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)或數(shù)量突然發(fā)生的可遺傳的變化。狹義的突變專指基因突變，也稱點突變；而廣義的突變分為染色體畸變和基因突變。突變的概率一般很低，約為10-610-9。從自然界分離到的菌株一般稱野生型菌株，簡稱野生型。野生型經(jīng)突變后產(chǎn)生的帶有新性狀的菌株稱突變型菌株，簡稱突變株、突變體或突變型。突變是工業(yè)微生物產(chǎn)生變種的根源，是選種育種的基礎(chǔ)，但也是菌種發(fā)生退化的主要原因。所以自然界形形色色的菌種是生物長期進化，即通過變異和自然選擇的結(jié)果。,.,26,第三節(jié)基因突變和誘變育種,（二）突變型的類型表型是指具有一定遺傳型的生物體，在特定環(huán)境條件下通過生長發(fā)育所表現(xiàn)出來的一切外表特征和內(nèi)在特性的總和。基因突變的類型很多，從篩選菌株的實用目的出發(fā)，按突變體表型特征的不同，可把突變分成以下幾種類型。,.,27,第三節(jié)基因突變和誘變育種,1形態(tài)突變型形態(tài)突變型是指由突變引起的個體形態(tài)或菌落形態(tài)的變異。如細菌的鞭毛、芽孢或莢膜的有無，霉菌或放線菌的孢子有無或顏色變化，菌落的大小，菌落表面的光滑、粗糙，以及噬菌斑的大小或清晰度等的突變。,.,28,第三節(jié)基因突變和誘變育種,2營養(yǎng)缺陷型野生型菌株因發(fā)生基因突變而喪失合成一種或幾種生長因子、堿基或氨基酸的能力，因而無法再在基本培養(yǎng)基上正常生長繁殖，只能在補充了相應(yīng)生長因子的補充培養(yǎng)基上或在含有天然營養(yǎng)物質(zhì)的完全培養(yǎng)基上才能生長的變異類型，稱為營養(yǎng)缺陷型。營養(yǎng)缺陷型突變株在遺傳學(xué)、分子生物學(xué)、遺傳工程和工業(yè)微生物育種等工作中有著重要的應(yīng)用。,.,29,第三節(jié)基因突變和誘變育種,3抗性突變型指野生型菌株因發(fā)生基因突變而產(chǎn)生的對某種化學(xué)藥物、致死物理因素或噬菌體具有抗性的變異類型。根據(jù)其抵抗的對象可分為抗藥性突變型、抗紫外線突變型或抗噬菌體突變型等。它們十分常見且極易分離，一般只需要在含抑制生長濃度的某藥物、相應(yīng)的物理因素或在相應(yīng)噬菌體平板上涂上大量的敏感細胞群體，經(jīng)一定時間培養(yǎng)后即可獲得?？剐酝蛔冃驮谶z傳學(xué)基本理論的研究中十分有用，它常作為選擇性標記菌株。,.,30,第三節(jié)基因突變和誘變育種,4致死突變型致死突變型是指由于基因突變而造成菌體死亡的突變類型。通?？煞譃轱@性致死和隱性致死，雜合狀態(tài)的顯性致死和純合狀態(tài)的隱性致死都會導(dǎo)致個體的死亡。在單倍體生物中兩種類型都會引起個體的死亡。,.,31,第三節(jié)基因突變和誘變育種,5條件致死突變型突變后的菌體在某種條件下可以正常地生長、繁殖并呈現(xiàn)其固有的表型，而在另一種條件下則發(fā)生死亡，這種突變型稱為條件致死突變型。溫度敏感突變型是最典型的條件致死突變型。有些菌體發(fā)生突變后對溫度變得敏感了，在較窄的溫度范圍內(nèi)才能存活，超出此溫度范圍則死亡。其原因是突變使某些重要蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生改變，以致會在某特定溫度下具有的功能，而在另一溫度下則無此功能。如有些大腸桿菌突變菌株能在37下生長，但不能在42下生長；噬菌體T4的幾個突變株在25下有感染力，而在37下則失去感染力。,.,32,第三節(jié)基因突變和誘變育種,6產(chǎn)量突變型通過基因突變而產(chǎn)生的在代謝產(chǎn)物產(chǎn)量上明顯有別于原始菌株的突變株稱為產(chǎn)量突變型。若產(chǎn)量顯著高于原始菌株的稱為正變株；而把產(chǎn)量顯著低于原始菌株的稱為負變株。篩選高產(chǎn)正變株的工作對生產(chǎn)實踐極為重要，但由于產(chǎn)量高低是由多個基因決定的，因此在育種實踐上，只有把誘變育種與重組育種和遺傳工程育種很好的結(jié)合起來，才能取得良好的效果。,.,33,第三節(jié)基因突變和誘變育種,（三）突變的類型根據(jù)突變涉及的范圍，可以把突變分為染色體畸變和基因突變。1染色體畸變?nèi)旧w畸變指的是染色體結(jié)構(gòu)的改變，包括缺失、重復(fù)、倒位和易位等。缺失指的是染色體片段的丟失；重復(fù)是指染色體片段的二次出現(xiàn)；倒位是指染色體的片段發(fā)生了180的位置顛倒；易位則是指一個染色體的一個片段連接到另一個非同源染色體上。如果是兩個非同源染色體之間相互交換了部分片段則稱相互易位。圖6-2中每組線的上面一條染色體是正常的，下面一條染色體是發(fā)生畸變的。,.,34,第三節(jié)基因突變和誘變育種,圖6-2常見的幾種染色體畸變1缺失；2重復(fù)；3倒位；4相互易位,.,35,第三節(jié)基因突變和誘變育種,2基因突變基因突變也稱點突變，指的是染色體局部點位內(nèi)的變化，涉及一對或少數(shù)幾對核苷酸的增加、減少或替換。（1）堿基置換在DNA鏈上的堿基序列中一個堿基被另一個堿基代替的現(xiàn)象稱為置換。堿基置換分為兩種類型：一類稱為轉(zhuǎn)換，是指DNA鏈中嘌呤與嘌呤（A與G）之間或嘧啶與嘧啶（T與C）之間發(fā)生互換；另一類為顛換，是指DAN鏈中一個嘌呤被一個嘧啶或一個嘧啶被一個嘌呤所替換（圖6-3）。,.,36,第三節(jié)基因突變和誘變育種,.,37,第三節(jié)基因突變和誘變育種,（2）移碼突變在DNA序列中由于一對或少數(shù)幾對核苷酸的插入或缺失而使其后全部遺傳密碼的閱讀框架發(fā)生移動，進而引起轉(zhuǎn)錄和翻譯錯誤的突變叫移碼突變（圖6-4）。由移碼突變所產(chǎn)生的突變株，稱為移碼突變株。移碼突變只屬于DNA分子的微小損傷，其結(jié)果只涉及有關(guān)基因中突變點后面的遺傳密碼閱讀框架發(fā)生錯誤。,.,38,第三節(jié)基因突變和誘變育種,.,39,第三節(jié)基因突變和誘變育種,（四）基因突變的機制基因突變的機制是多樣性的，按突變的條件和原因劃分，可分為自發(fā)突變和人工誘發(fā)突變兩大類。1自發(fā)突變自發(fā)突變是指微生物在無人工干預(yù)下自然發(fā)生的突變。引起自發(fā)突變的原因很多，一般有：（1）背景輻射和環(huán)境因素如宇宙間的短波輻射、紫外線及高溫、病毒等。這些因素多為環(huán)境中自然存在的一些低劑量的物理、化學(xué)誘變因素。隨著環(huán)境的惡化、臭氧層的減薄，這些因素的作用日漸加強。,.,40,第三節(jié)基因突變和誘變育種,（2）微生物自身有害代謝產(chǎn)物的誘變?nèi)邕^氧化氫是微生物的一種正常代謝產(chǎn)物，它對脈孢菌具有誘變作用。它可因同時加入過氧化氫酶而降低突變率，如果再同時加入過氧化氫酶抑制劑，則又可提高突變率。由此可說明過氧化氫可能是自發(fā)突變中的一種內(nèi)源誘變劑。除過氧化氫外，咖啡堿、硫氰化物、二硫化二丙烯、重氮絲氨酸等，微生物所產(chǎn)生的這些物質(zhì)同樣會作用于DNA分子，引發(fā)突變。,.,41,第三節(jié)基因突變和誘變育種,（3）由DNA復(fù)制過程中的堿基錯誤配對所引起據(jù)統(tǒng)計，在DNA分子的復(fù)制過程中，每個堿基錯誤配對發(fā)生的頻率為10-710-11，而一個基因的平均長度約為1000bp，故由于堿基錯誤配對引起的自發(fā)突變率約為10-410-8。因此，若對細菌做一般液體培養(yǎng)時，因其細胞濃度?？蛇_到108個/mL，故經(jīng)常會在其中產(chǎn)生自發(fā)突變株。,.,42,第三節(jié)基因突變和誘變育種,2誘發(fā)突變誘發(fā)突變簡稱誘變，是指通過人為的方法，利用物理、化學(xué)和生物因素處理微生物而引起的突變。將這些能使突變率提高到自發(fā)突變水平以上的物理、化學(xué)和生物因素統(tǒng)稱為誘變劑。誘發(fā)突變與自發(fā)突變在效應(yīng)上幾乎沒有差異，突變基因的表現(xiàn)型和遺傳規(guī)律在本質(zhì)上也是相同的。只是與自發(fā)突變相比，誘發(fā)突變速度快、時間短、突變頻率高。誘發(fā)突變在工業(yè)微生物菌種選育與改造方面已經(jīng)取得了驚人的效果。,.,43,第三節(jié)基因突變和誘變育種,（1）物理誘變利用物理因素引起基因突變的稱為物理誘變。物理誘變因素很多，有非電離輻射類的紫外線、激光和離子束等；有能夠引起電離輻射的X射線、射線和快中子等。誘變育種工作中常用的有紫外線和射線等。,.,44,第三節(jié)基因突變和誘變育種,紫外線是波長范圍為136390nm的射線，它是一種非電離輻射。紫外線波長雖較寬，但誘變有效范圍是200300nm，其中又以260nm左右效果最好。各種微生物對紫外線的敏感性是不相同的，有些甚至差異很大。一般誘變用15W低功率的紫外燈，而高功率紫外燈，由于放出的光譜分布比較均勻，范圍較寬，因此效果不如低功率的紫外燈。紫外線誘變育種已沿用多年，目前仍普遍使用，育種效果比較好，操作方便。例如糖化酶產(chǎn)生菌黑曲霉變異株的出發(fā)菌株產(chǎn)酶不到1000U/mL，經(jīng)過紫外線誘變選育后的突變株，產(chǎn)量提高到3000U/mL。,.,45,第三節(jié)基因突變和誘變育種,（2）化學(xué)誘變利用化學(xué)物質(zhì)對微生物進行誘變，引起基因突變的稱為化學(xué)誘變。通過對上千種化學(xué)物質(zhì)的誘變作用進行研究，發(fā)現(xiàn)從簡單的無機物到復(fù)雜的有機物，包括金屬離子、一般試劑、生物堿、生長刺激素、抗生素、農(nóng)藥、滅菌劑、色素、染料等，都可以誘發(fā)突變，但是誘變效果好的種類并不多。根據(jù)化學(xué)誘變劑對DNA作用方式的不同，可以將它們分為以下三類。,.,46,第三節(jié)基因突變和誘變育種,第一類是能夠改變DNA化學(xué)結(jié)構(gòu)的誘變劑，如亞硝酸和烷化劑等。亞硝酸具有氧化脫氨作用，它能使腺嘌呤(A)脫去氨基變成次黃嘌呤(H)，胞嘧啶(C)脫去氨基變成尿嘧啶(U)。在DNA分子第一次復(fù)制時，H與C配對，U與A配對。第二次復(fù)制時，C與G配對，A與T配對。于是，經(jīng)過兩次復(fù)制，原來的AT堿基對就變成了GC堿基對，而GC堿基對卻變成了AT堿基對。,.,47,第三節(jié)基因突變和誘變育種,常見的烷化劑有硫酸二乙酯、乙烯亞胺、甲基磺酸乙酯、亞硝基甲基脲等。烷化劑有一個或幾個不穩(wěn)定的烷基，能夠與DNA分子的堿基發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，置換其中某些基團的氫原子，從而改變堿基的化學(xué)結(jié)構(gòu)，使DNA分子復(fù)制時出現(xiàn)堿基配對的差錯，最終導(dǎo)致基因突變。,.,48,第三節(jié)基因突變和誘變育種,第二類是堿基類似物，是指與DNA的四種堿基A、T、G、C在化學(xué)結(jié)構(gòu)上相似的一類物質(zhì)。在DNA分子復(fù)制時，這些堿基類似物能夠作為DNA的組成成分加入到DNA分子中，從而引起基因突變。常見的堿基類似物有5溴尿嘧啶和5-溴脫氧尿核苷（是胸腺嘧啶結(jié)構(gòu)類似物），2氨基嘌呤（是腺嘌呤的結(jié)構(gòu)類似物）等。第三類是移碼誘變劑，它們可以插入DNA分子結(jié)構(gòu)中，使DNA分子在復(fù)制或轉(zhuǎn)錄時出現(xiàn)差錯而導(dǎo)致突變。如吖啶類化合物、溴化乙錠和一系列“ICR”類化合物。,.,49,第三節(jié)基因突變和誘變育種,（六）基因突變的特點由于所有微生物的遺傳物質(zhì)的化學(xué)本質(zhì)都是核酸，除部分病毒的遺傳物質(zhì)為RNA外，絕大部分為DNA。因此，在遺傳變異特性上都遵循著共同的規(guī)律，這在基因突變水平上非常明顯?；蛲蛔兙哂幸韵绿攸c：,.,50,第三節(jié)基因突變和誘變育種,1基因突變的自發(fā)性及不對應(yīng)性各種性狀的突變都可以在沒有任何人為誘變因素的作用下自發(fā)產(chǎn)生，這就是基因突變的自發(fā)性?；蛲蛔兊男誀钆c引起突變的因素之間無直接的對應(yīng)關(guān)系。就是說，在紫外線誘變下可以出現(xiàn)抗紫外線菌株，通過自發(fā)或其他誘發(fā)因素也可以獲得同樣的抗紫外線菌株。,.,51,第三節(jié)基因突變和誘變育種,2基因突變的稀有性雖然自發(fā)突變隨時都可能發(fā)生，但自發(fā)突變發(fā)生的概率是很低的，一般在10-610-9之間。3基因突變的獨立性突變對每個細胞是隨機的，對每個基因也是隨機的。每個基因的突變是獨立的，既不受其他基因突變的影響，也不會影響其他基因的突變。,.,52,第三節(jié)基因突變和誘變育種,4基因突變的可誘變性通過人為的誘變劑作用，可以提高菌株的突變率，一般可以將突變率提高10105倍。因為誘變劑僅僅是提高突變率，所以自發(fā)突變與誘發(fā)突變所獲得的突變株并沒有本質(zhì)區(qū)別。5基因突變的穩(wěn)定性因為基因突變的原因是遺傳物質(zhì)的結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化，所以突變產(chǎn)生新的變異性狀是穩(wěn)定的，也是可遺傳的。6基因突變的可逆性由原始的野生型基因變異成為突變型基因的過程稱為正向突變，相反的過程稱為回復(fù)突變。實驗證明，任何遺傳性狀都可發(fā)生正向突變，也可發(fā)生回復(fù)突變。,.,53,第三節(jié)基因突變和誘變育種,二、誘變育種誘變育種是指利用物理或化學(xué)等因素處理微生物細胞，提高基因的隨機突變頻率，通過一定的篩選方法獲得所需要的高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)菌株。誘變育種在工業(yè)微生物育種上有多種用途。首先，通過誘變育種能提高產(chǎn)物的產(chǎn)量，即可以獲得高產(chǎn)突變株。其次，通過誘變育種可以改善菌種特性、提高產(chǎn)品質(zhì)量、擴大品種和簡化生產(chǎn)工藝，降低成本。由于誘變育種具有方法簡單、快速和收效顯著等特點，故仍是目前被廣泛使用的主要育種方法之一。,.,54,第三節(jié)基因突變和誘變育種,誘變育種的基本步驟包括：出發(fā)菌株的選擇，菌株的培養(yǎng)，菌懸液的制備，誘變處理，中間培養(yǎng)，突變株的分離與篩選等。1出發(fā)菌株的選擇誘變育種的目的是提高產(chǎn)物的產(chǎn)量，改進產(chǎn)品的質(zhì)量或改變原有的代謝途徑，產(chǎn)生新的代謝產(chǎn)物。那么，選好出發(fā)菌株對提高誘變效果有著極其重要的意義。用作誘變育種的出發(fā)菌株常有以下幾類。,.,55,第三節(jié)基因突變和誘變育種,從自然界分離的野生型菌株。這類菌株雖然產(chǎn)量較低，但對誘變因素敏感，變異幅度大，正突變率高。選取生產(chǎn)中由于自發(fā)突變或長期在生產(chǎn)條件下馴化而篩選得到的菌株，與野生型菌株較相象，容易達到較好的誘變效果。,.,56,第三節(jié)基因突變和誘變育種,選取每次誘變處理都有一定提高的菌株。這類菌株在育種工作中經(jīng)常采用。對于這類菌株，由于情況比較復(fù)雜，必須根據(jù)情況，區(qū)別對待。一般認為最合理的做法是在每次誘變處理后選取35個較高產(chǎn)的菌株作為出發(fā)菌株，繼續(xù)誘變。如果是產(chǎn)量特別高的菌株，可先行重組育種，再作為誘變的出發(fā)菌株，就有可能得到好的效果。總之，在誘變育種的實際工作中，如何選擇一個好的出發(fā)菌株，不僅要積累很多實際經(jīng)驗，而且還需要和誘變方法密切配合，才能得到好的結(jié)果。,.,57,第三節(jié)基因突變和誘變育種,2菌株的培養(yǎng)在誘變育種中，處理材料一般采用生理狀態(tài)一致的單倍體、單核細胞，即菌懸液的細胞應(yīng)盡可能達到同步生長狀態(tài)，這稱為同步培養(yǎng)。細菌一般要求培養(yǎng)至對數(shù)生長期，此時群體生長狀態(tài)比較同步，比較容易變異，重復(fù)性較好。如亞硝基胍誘變時作用于復(fù)制叉處，生長旺盛的細胞中復(fù)制叉點較多，堿基類似物也在此時期比較容易進入DNA鏈中。霉菌處理使用分生孢子，應(yīng)該將分生孢子在液體培養(yǎng)基中短時間培養(yǎng)，使孢子孵化，處于活化狀態(tài)，并恰好未形成菌絲體，易于誘變。,.,58,第三節(jié)基因突變和誘變育種,3菌懸液的制備為使每個細胞均勻接觸誘變劑并防止長出不純菌落，就要求作誘變的菌株必須以均勻而分散的單細胞懸液狀態(tài)存在。由于某些微生物細胞是多核的，即使處理其單細胞，也會出現(xiàn)不純菌落；又由于一般DNA都是以雙鏈狀態(tài)存在的，而誘變劑通常僅作用于某一單鏈的某一序列，因此，突變后的性狀往往無法反映在當代的表型上，而是要通過DAN的復(fù)制和細胞分裂后才表現(xiàn)出來，于是出現(xiàn)了不純菌落。上述兩類不純菌落的存在，也是誘變育種工作中初分離的菌株經(jīng)傳代后會很快出現(xiàn)生產(chǎn)性狀“退化”的原因之一。鑒于以上原因，用于誘變育種的細胞應(yīng)盡量選用單核細胞，如霉菌或放線菌的分生孢子或細菌的芽孢等。,.,59,第三節(jié)基因突變和誘變育種,菌懸液是直接供誘變處理的，其質(zhì)量的好壞將直接影響誘變效果。菌懸液一般可用生理鹽水或緩沖溶液配制，如果是用化學(xué)誘變劑處理，因處理時pH會變化，必須要用緩沖溶液。除此之外，還應(yīng)注意分散度，方法是先用玻璃珠振蕩分散，再用脫脂棉或濾紙過濾，經(jīng)處理，分散度可達90以上。這樣，可以保證菌懸液均勻地接觸誘變劑，獲得較好誘變效果。最后制得的菌懸液，霉菌孢子或酵母菌細胞的濃度大約為106107個mL，放線菌和細菌的濃度大約為108個mL。菌懸液的細胞數(shù)可用平板計數(shù)法、血球計數(shù)板或光密度法測定，但以平板計數(shù)法較為準確。,.,60,第三節(jié)基因突變和誘變育種,4誘變處理誘變處理包括誘變劑的選擇和使用劑量的確定。各種誘變劑都有其各自作用的特殊性，但由于目前對絕大多數(shù)微生物所呈現(xiàn)各種性狀的相應(yīng)基因了解的還很不夠，所以在選擇誘變因素的時候，需作大量的預(yù)備性試驗。在實際的工作中，一般都先采用一些效果好的誘變劑，如化學(xué)因素中的甲基磺酸乙酯，用它處理棒桿菌和枯草桿菌，處理時間延長至18h，在存活率為1.010-7時，突變率達82.7%；處理黑曲霉67h，存活率在0.01%以下時，營養(yǎng)缺陷型多達3%以上。就物理誘變因素而言，目前使用較多的是紫外線和射線等。,.,61,第三節(jié)基因突變和誘變育種,要確定一個合適的劑量，通常要經(jīng)過多次試驗，就一般微生物而言，誘變頻率往往隨劑量的增大而增大，但達到一定劑量后，再提高劑量會使誘變頻率下降。根據(jù)對紫外線、射線及乙烯亞胺等誘變劑誘變效應(yīng)的研究，發(fā)現(xiàn)正突變較多地出現(xiàn)在較低的劑量中，而負突變則較多地出現(xiàn)在高劑量中，同時還發(fā)現(xiàn)經(jīng)多次誘變而提高產(chǎn)量的菌株中，高劑量更容易出現(xiàn)負突變。因此，在誘變育種工作中，目前較傾向于采用較低劑量。,.,62,第三節(jié)基因突變和誘變育種,在誘變育種時，有時可根據(jù)實際情況，采用多種誘變劑復(fù)合處理的辦法。復(fù)合處理方法主要有三類：a.兩種或多種誘變劑先后使用；b.同一種誘變劑的重復(fù)使用；c.兩種或多種誘變劑的同時使用。如果能使用不同作用機制的誘變劑來做復(fù)合處理，可能會取得更好的誘變效果。誘變劑的復(fù)合處理常呈現(xiàn)一定的協(xié)同效應(yīng)，這對誘變育種的工作是很有價值的。,.,63,第三節(jié)基因突變和誘變育種,5中間培養(yǎng)對于剛經(jīng)誘變劑處理過的菌株，有一個表現(xiàn)遲滯的過程，需3代以上的繁殖才能將突變性狀表現(xiàn)出來。據(jù)此應(yīng)讓變異處理后細胞在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)幾小時，使細胞的遺傳物質(zhì)復(fù)制，繁殖幾代，以得到純的變異細胞。這樣，穩(wěn)定的變異就會顯現(xiàn)出來。若不經(jīng)液體培養(yǎng)基的中間培養(yǎng)，直接在平皿上分離就會出現(xiàn)變異和不變異細胞同時存在于一個菌落內(nèi)的可能，形成混雜菌落，以致造成篩選結(jié)果的不穩(wěn)定和將來的菌株退化。,.,64,第三節(jié)基因突變和誘變育種,6突變株的分離和篩選經(jīng)過中間培養(yǎng)，分離出大量的較純的單個菌落，接著，要從幾千萬個菌落中篩選出幾個所謂性能良好的正突變菌株，這將要花費大量的人力和物力。怎樣設(shè)計才能花費較少的工作量達到最好的效果，這是篩選工作中的一條原則。一般采用一些方法加以簡化，如利用形態(tài)突變直接淘汰低產(chǎn)變異菌株，或利用平皿反應(yīng)直接挑取高產(chǎn)變異菌株等。平皿反應(yīng)是指每個變異菌落產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物與培養(yǎng)基內(nèi)的指示物在培養(yǎng)基平板上作用后表現(xiàn)出一定的生理效應(yīng)，如變色圈、透明圈、生長圈、抑菌圈等，這些效應(yīng)的大小表示變異菌株生產(chǎn)活力的高低，以此作為篩選的標志。常用的方法有紙片培養(yǎng)顯色法、透明圈法、瓊脂塊培養(yǎng)法等。,.,65,第四節(jié)基因重組和雜交育種,微生物變異是由于遺傳物質(zhì)的成分和結(jié)構(gòu)的改變引起的。遺傳物質(zhì)的這些改變，可以通過突變發(fā)生在一個細胞內(nèi)部，也可以通過兩個細胞間遺傳物質(zhì)的重組而實現(xiàn)。將二個不同性狀個體內(nèi)的基因轉(zhuǎn)移到一起，經(jīng)過重新組合后，形成新的遺傳型個體的過程稱為基因重組。基因重組是生物體在未發(fā)生突變的情況下，產(chǎn)生新的遺傳型個體的現(xiàn)象。,.,66,第四節(jié)基因重組和雜交育種,雜交育種一般是指人為利用真核微生物的有性生殖、準性生殖，或原核微生物的接合、轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)化等過程，促使兩個具有不同遺傳性狀的菌株發(fā)生基因重組，以獲得性能優(yōu)良的生產(chǎn)菌株。盡管一些優(yōu)良菌種的選育主要是采用誘變育種的方法，但是某一菌株長期使用誘變劑處理后，其生活能力一般要逐漸下降，如生長周期延長、孢子量減少、代謝減慢、產(chǎn)量增加緩慢、誘變因素對產(chǎn)量基因影響的有效性降低等。因此，需采用雜交育種的方法進一步優(yōu)化菌株；另外，由于雜交育種是選用已知性狀的供體和受體菌種作為親本，因此不論在方向性還是自覺性方面，都比誘變育種前進了一大步，所以它是微生物菌種選育的一種重要的方法。,.,67,第四節(jié)基因重組和雜交育種,一、原核微生物的基因重組原核微生物缺乏有性生殖系統(tǒng)，在進行基因重組時，它們的兩個親本細胞并不給子代提供等量的遺傳信息，彼此間能互相交換小部分的遺傳信息，通常稱提供交換DNA的原核微生物為供體，而獲得DNA的原核微生物為受體。原核微生物的基因重組可以通過轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)和接合等方式進行。以下主要介紹轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)導(dǎo)兩種重組方式。,.,68,第四節(jié)基因重組和雜交育種,1轉(zhuǎn)化受體細胞從周圍介質(zhì)中吸收來自供體細胞的DNA片段（常稱為轉(zhuǎn)化因子），并把它整合到自己的基因組中，從而獲得新的遺傳性狀的現(xiàn)象，稱轉(zhuǎn)化。經(jīng)轉(zhuǎn)化所得的供體性狀的子代叫轉(zhuǎn)化子。轉(zhuǎn)化主要通過3個步驟完成，如圖6-5所示。,.,69,第四節(jié)基因重組和雜交育種,.,70,第四節(jié)基因重組和雜交育種,（1）感受態(tài)細胞的建立只有處于感受態(tài)的細胞才能作為轉(zhuǎn)化的受體。所謂的感受態(tài)是指細胞能夠從周圍環(huán)境中吸收DNA分子片段進行轉(zhuǎn)化的生理狀態(tài)。感受態(tài)的出現(xiàn)與菌株的遺傳特性和培養(yǎng)條件等因素有關(guān)。不同的菌株感受態(tài)持續(xù)的時間也不同，如枯草芽孢桿菌可持續(xù)幾個小時，而肺炎雙球菌只能持續(xù)幾分鐘?，F(xiàn)在人們也可以用人工的方法提高受體菌感受態(tài)的水平，如用cAMP處理嗜血桿菌細胞群體可使其感受態(tài)水平提高1萬倍。,.,71,第四節(jié)基因重組和雜交育種,（2）轉(zhuǎn)化因子的吸附和吸收首先是供體雙鏈DNA與受體細胞壁上的吸附位點相結(jié)合。對于不同的受體細胞而言，其細胞壁上的吸附位點數(shù)是不同的，而且對轉(zhuǎn)化因子吸附的專一性也不同。如肺炎雙球菌上的位點數(shù)有3080個，而且肺炎雙球菌對于轉(zhuǎn)化因子的吸附?jīng)]有專一性；流感嗜血桿菌上的位點數(shù)則有410個，并且具有高度的專一性，只能吸附同種不同菌株的DNA，不能吸附大腸桿菌的DNA。隨后其中一條DNA鏈被細胞表面上的核酸酶降解，降解產(chǎn)生的能量協(xié)助把另一條DNA鏈推進受體細胞。到目前為止，亦發(fā)現(xiàn)有完整的雙鏈被攝取的情況，如革蘭氏陰性菌嗜血桿菌。,.,72,第四節(jié)基因重組和雜交育種,（3）轉(zhuǎn)化因子的整合與轉(zhuǎn)化子的形成當單鏈轉(zhuǎn)化因子DNA進入受體細胞后，便與雙鏈結(jié)構(gòu)的受體染色體DNA同源片段配對，接著受體染色體DNA上的相應(yīng)單鏈片段被切除，并被轉(zhuǎn)化因子DNA交換、整合和替換。被替換下來的受體染色體DNA片段被酶所降解，缺口部分被修復(fù)合成及連接，形成部分雜合雙鏈，再通過DNA復(fù)制和細胞分裂即得重組子代，經(jīng)選擇性培養(yǎng)基分離可獲得轉(zhuǎn)化子。,.,73,第四節(jié)基因重組和雜交育種,能夠發(fā)生轉(zhuǎn)化的微生物有許多，如肺炎鏈球菌屬、嗜血桿菌屬、芽孢桿菌屬、假單胞桿菌屬、奈瑟氏球菌屬、葡萄球菌屬和根瘤菌屬等。轉(zhuǎn)化性狀也多樣，如形態(tài)、莢膜物質(zhì)、糖發(fā)酵、耐藥性、抗原性、致病力、代謝產(chǎn)物、營養(yǎng)需要等性狀的變化。,.,74,第四節(jié)基因重組和雜交育種,2轉(zhuǎn)導(dǎo)通過完全缺陷或部分缺陷噬菌體為媒介，把供體細胞的DNA片段攜帶到受體細胞中，通過交換與整合，從而使后者獲得前者部分遺傳性狀的現(xiàn)象，稱為轉(zhuǎn)導(dǎo)。獲得部分新性狀的受體細胞，稱為轉(zhuǎn)導(dǎo)子。轉(zhuǎn)導(dǎo)可分為普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)和局限性轉(zhuǎn)導(dǎo)兩種類型。在普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)中，噬菌體可以轉(zhuǎn)導(dǎo)供體染色體的任何部分到受體細胞中；而在局限性轉(zhuǎn)導(dǎo)中，噬菌體總是攜帶同樣的片段到受體細胞中。,.,75,第四節(jié)基因重組和雜交育種,二、真核微生物的基因重組在真核微生物中，基因重組的方式很多，主要有有性雜交和準性雜交兩種。1有性雜交雜交是指在細胞水平上進行的一種遺傳重組方式。有性雜交，一般是指不同遺傳型的兩性細胞間發(fā)生的接合和隨之進行的染色體重組，進而產(chǎn)生新的遺傳型后代的一種育種方式。凡能產(chǎn)生有性孢子的酵母菌或霉菌都有與動植物類似的有性雜交現(xiàn)象。現(xiàn)以工業(yè)上常用的釀酒酵母為例來加以介紹。,.,76,第四節(jié)基因重組和雜交育種,釀酒酵母有其完整的生活史（圖6-6）。從自然界分離到的或在工業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用的菌株，一般都是雙倍體細胞。把不同生產(chǎn)性狀的甲、乙兩個親本菌株（雙倍體）分別接種到產(chǎn)孢子培養(yǎng)基斜面上，使其產(chǎn)生子囊孢子（單倍體）。經(jīng)洗滌、去壁和涂布而得到單倍體菌落。把來自不同親本、不同性別的單倍體細胞通過離心等方式使之密集地接觸，就有更多的機會出現(xiàn)種種雙倍體的有性雜交后代。它們的雙倍體細胞和單倍體細胞有明顯的差別，易于識別（表6-1）。在這些雙倍體雜交子代中，通過篩選，就可以選到優(yōu)良性狀的雜種。,.,77,第四節(jié)基因重組和雜交育種,.,78,第四節(jié)基因重組和雜交育種,.,79,第四節(jié)基因重組和雜交育種,2準性雜交準性生殖是部分真菌中存在的不通過減數(shù)分裂而產(chǎn)生低頻率的基因重組的特殊方式。它包括異核體的形成、體細胞雙倍體的產(chǎn)生和細胞在有絲分裂過程中的染色體交換與單倍體化，這三個過程在準性生殖過程中是相互關(guān)聯(lián)的，各階段的發(fā)生與產(chǎn)物形成的頻率都對基因重組有很大影響。準性生殖對一些沒有有性生殖過程但有重要生產(chǎn)價值的半知菌類育種工作來說，提供了一個雜交育種的手段?，F(xiàn)將灰黃霉素生產(chǎn)菌蕁麻青霉的準性雜交育種方法簡介如下（圖6-7）。,.,80,第四節(jié)基因重組和雜交育種,.,81,第四節(jié)基因重組和雜交育種,（1）選擇親本由于蕁麻青霉不產(chǎn)生有性孢子，只有在極個別的體細胞間才發(fā)生菌絲聯(lián)結(jié)，而且聯(lián)結(jié)后的細胞在形態(tài)上并無顯著的特征可尋，因此，必須借助于營養(yǎng)缺陷型這類絕好的選擇性標記作為準性雜交親本的篩選指標，如圖6-7中的A-B+和A+B-。（2）強制異合用人為的方法強制A-B+和A+B-菌株所產(chǎn)生的分生孢子（約106107）混合形成異核體。用基本培養(yǎng)基-來檢測由A-B+和A+B-體細胞聯(lián)結(jié)所形成的異核體或雜合二倍體菌落。,.,82,第四節(jié)基因重組和雜交育種,（3）移單菌落將平板上長出的單菌落移種到基本培養(yǎng)基-的斜面上。（4）驗測穩(wěn)定性利用夾層法檢測獲得的菌株的穩(wěn)定性。（5）促進變異把穩(wěn)定菌株產(chǎn)生的孢子用紫外線、射線等理化因子進行處理，以促使其染色體發(fā)生重組交換，經(jīng)一系列生產(chǎn)性狀的測定，就能篩選出優(yōu)良的準性雜交菌株。,.,83,第四節(jié)基因重組和雜交育種,三、基因工程基因工程是指在基因水平上的遺傳工程，它是用人為方法將所需要的某一供體生物的遺傳物質(zhì)DNA提取出來，在離體條件下用適當?shù)拿高M行切割后，把它與載體DNA分子連接起來形成具有自我復(fù)制能力的DNA分子復(fù)制子，并將它轉(zhuǎn)移到宿主細胞中擴增和表達?；蚬こ淌?0世紀70年代初誕生的一門嶄新的生物技術(shù)科學(xué)?；蚬こ膛c當前發(fā)展的蛋白質(zhì)工程、酶工程和細胞工程共同構(gòu)成了當代新興的學(xué)科領(lǐng)域生物技術(shù)工程。生物技術(shù)工程的興起為現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)發(fā)展和工農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥衛(wèi)生事業(yè)的進步提供了巨大潛力。基因工程操作過程大致可歸納為以下主要步驟：目的基因的獲得；載體的選擇；目的基因與載體DNA的體外重組；重組載體導(dǎo)入受體細胞以及重組菌的篩選與鑒定（圖6-8）。,.,84,第四節(jié)基因重組和雜交育種,.,85,第四節(jié)基因重組和雜交育種,1目的基因的獲得利用各種不同的限制性內(nèi)切酶切割下人們所需要的基因，也就是某些DNA片段。那里面含有一種或幾種遺傳信息的全套遺傳密碼。目的基因的獲得是基因工程操作的關(guān)鍵。,.,86,第四節(jié)基因重組和雜交育種,2載體的選擇載體是攜帶目的基因并將其轉(zhuǎn)移至受體細胞內(nèi)復(fù)制和表達的運載工具。作為載體DNA分子，應(yīng)具備以下幾個條件。是一個有自我復(fù)制能力的復(fù)制子。能在受體細胞內(nèi)大量繁殖，即有較高的復(fù)制率。載體上最好只有一個限制性內(nèi)切核酸酶的切口，使目的基因能固定地整合到載體DNA的一定位置上。載體上必須具有可供選擇的遺傳標記。,.,87,第四節(jié)基因重組和雜交育種,3目的基因與載體DNA的體外重組目的基因用DNA連接酶連接到合適的載體上是DNA重組技術(shù)的關(guān)鍵。采用限制性內(nèi)切核酸酶處理含有酶切點的目的基因DNA分子和載體DNA分子，可使兩種DNA分子上產(chǎn)生相同的黏端。所以當兩者混合時，凡是與黏端堿基互補的片段，就會因氫鍵的作用而彼此吸引，重新形成雙鏈。這時，在外界連接酶的作用下，目的基因的DNA與載體的DNA片段之間進行共價連接，形成一個完整的有復(fù)制能力的環(huán)狀重組載體。,.,88,第四節(jié)基因重組和雜交育種,4重組載體導(dǎo)入受體細胞上述由體外操縱手續(xù)構(gòu)建成的重組載體，只有將它導(dǎo)入受體細胞內(nèi)，才能使其中的目的基因獲得增殖和表達。把重組載體導(dǎo)入受體細胞有多種途徑。如若以重組質(zhì)粒作為載體時，可以用轉(zhuǎn)化的手段；若以噬菌體作為重組載體時，可以用轉(zhuǎn)導(dǎo)的途徑將重組載體導(dǎo)入受體細胞。只是含目的基因的DNA與噬菌體載體的重組DNA分子導(dǎo)入受體細胞，一般先需用噬菌體的蛋白質(zhì)外殼對重組載體進行體外包裝。,.,89,第四節(jié)基因重組和雜交育種,5重組受體細胞的篩選和鑒定受體細胞經(jīng)轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)處理后，真正獲得目的基因并能有效表達的重組受體細胞一般來說只是一小部分，而絕大部分仍是原來的受體細胞或者是不含目的基因的重組受體細胞。為了得到真正的重組受體細胞，需要對其進行篩選和鑒定。經(jīng)過篩選所獲得的受體細胞就是所謂的“工程菌”。,.,90,第四節(jié)基因重組和雜交育種,基因工程育種技術(shù)為動植物和微生物間進行任意、定向和超遠緣的分子雜交提供了有效方法，從而大大加快了育種的速度。基因工程在工業(yè)微生物育種應(yīng)用中的設(shè)想很多，例如通過設(shè)計增加控制代謝產(chǎn)物產(chǎn)量的基因拷貝數(shù)來大幅度提高產(chǎn)量；將動植物或某些微生物特有產(chǎn)物的控制基因經(jīng)轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)導(dǎo)植入細菌細胞而大規(guī)模地進行微生物的發(fā)酵生產(chǎn)；同時利用“工程菌”在清除污染及以非糧物質(zhì)為原料進行發(fā)酵生產(chǎn)等方面也出現(xiàn)了可喜的突破。,.,91,第四節(jié)基因重組和雜交育種,除此以外，基因工程在食品、化工、環(huán)保、采礦、冶煉、能源和材料等眾多領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用，必將在人類實踐中發(fā)揮重大作用和貢獻。當然，它也和其他所有新生事物一樣，在它給人們帶來巨大利益的同時也面臨著嚴峻的挑戰(zhàn)。基因工程與傳統(tǒng)生物技術(shù)的最根本的區(qū)別就在于前者是在基因水平上進行操作，改變已有的基因甚至創(chuàng)造新的物種，這是一項前無古人的嶄新工作。因此，基因工程是否具有潛在的危害性，特別是轉(zhuǎn)移至人體的基因是否會激活原癌基因，基因工程是否會導(dǎo)致出現(xiàn)新型病原生物等問題必然也成為人們關(guān)心和爭議的焦點。但有一點可以肯定，人們既然能發(fā)明一種新技術(shù)，必然也將會有能力掌握這門新技術(shù)，使它朝著有利于人類進步的方向發(fā)展。,.,92,第五節(jié)菌種的保藏技術(shù),菌種是微生物工作的重要研究對象和材料，是工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的寶貴資源。因此，通過各種技術(shù)手段得到的具有優(yōu)良生產(chǎn)性狀的菌種，還必須通過各種保藏技術(shù)使其在一定時間內(nèi)不丟失重要的生物學(xué)性狀，防止其退化、死亡、被其他微生物污染，或發(fā)生變異，使其能長期使用，為人類造福。,.,93,第五節(jié)菌種的保藏技術(shù),一、菌種的退化與復(fù)壯（一）菌種的退化與防止1菌種退化的現(xiàn)象菌種的退化是指由于自發(fā)突變的結(jié)果，而使某物種原有的一系列生物學(xué)性狀發(fā)生量變或質(zhì)變的現(xiàn)象。菌種退化的具體表現(xiàn)有以下幾個方面。,.,94,第五節(jié)菌種的保藏技術(shù),形態(tài)方面，包括分生孢子減少或顏色改變等。如放線菌和霉菌在斜面上多次傳代后產(chǎn)生“光禿”現(xiàn)象，從而造成生產(chǎn)上用孢子接種的困難。生產(chǎn)速度變慢。代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)能力下降，即出現(xiàn)負突變。如黑曲霉的糖化力、放線菌抗生素的發(fā)酵單位的下降，所有這些都對生產(chǎn)不利。致病菌對宿主侵染能力的下降，如白僵菌對寄主致病能力的降低。對外界不良環(huán)境條件（抗噬菌體、抗低溫和抗高溫等）抵抗能力的下降等。,.,95,第五節(jié)菌種的保藏技術(shù),2菌種退化的原因菌種退化的原因是多方面的，但是在生產(chǎn)實踐中，必須將由于培養(yǎng)條件的改變導(dǎo)致菌種形態(tài)和生理上的變異與菌種退化區(qū)別開來。因為優(yōu)良菌株的生產(chǎn)性能是和發(fā)酵工藝條件緊密相關(guān)的。如果培養(yǎng)條件發(fā)生變化，如培養(yǎng)基中缺乏某些元素，會導(dǎo)致產(chǎn)孢子數(shù)量減少，也會引起孢子顏色的改變；溫度、pH的變化也會使發(fā)酵產(chǎn)量發(fā)生波動等。所有這些，只要條件恢復(fù)正常，菌種原有性狀就能恢復(fù)正常，因此這些原因引起的菌種變化不能稱為菌種退化。菌種退化的原因主要有以下幾個方面：,.,96,第五節(jié)菌種的保藏技術(shù),（1）基因突變菌種退化的主要原因是有關(guān)基因的負突變。當控制產(chǎn)量的基因發(fā)生負突變，就會引起產(chǎn)量下降；當控制孢子生成的基因發(fā)生負突變，則使菌種產(chǎn)孢子的性能下降等。一般而言，菌種的退化是一個從量變到質(zhì)變的逐步演變過程。開始時，在群體中只有個別細胞發(fā)生負突變，這時如不及時發(fā)現(xiàn)并采用有效措施，就會造成群體中負突變個體的比例逐漸增高，最后發(fā)展成為優(yōu)勢群體，從而使整個群體表現(xiàn)出嚴重的退化現(xiàn)象。因此，突變在數(shù)量上的表現(xiàn)依賴于傳代，即菌株處于一定條件下，群體多次繁殖，可使退化細胞在數(shù)量上逐漸占優(yōu)勢，于是退化性狀的表現(xiàn)就更加明顯，逐漸成為一株退化了的菌體。,.,97,第五節(jié)菌種的保藏技術(shù),同時，對某一菌株的特定基因來講，突變頻率比較低，因此群體中個體發(fā)生生產(chǎn)性能的突變不是很容易的，但就一個經(jīng)常處于旺盛生長狀態(tài)的細胞而言，發(fā)生突變的機率比處于休眠狀態(tài)的細胞大得多。因此，細胞的代謝水平與基因突變關(guān)系密切，應(yīng)設(shè)法控制細胞保藏的環(huán)境，使細胞處于休眠狀態(tài)，從而減少菌種的退化。,.,98,第五節(jié)菌種的保藏技術(shù),（2）分離現(xiàn)象通過遺傳育種獲得的多核（或是單核）菌種，由于其