軍團菌及其檢測方法VIP

軍團菌及其檢測技術,武漢市疾病預防控制中心微生物檢驗科趙瀅博士Email：hustzy4012014年11月,軍團菌的發(fā)現(xiàn),1976年7月在美國費城，參加退伍軍人大會的人員中爆發(fā)了一種癥狀相同，原因不明的細菌性肺炎，有221人感染疾病，其中死亡34人。初步的流行病學分析顯示，致病的微生物可能通過空氣傳播，采集標本，分離病原體革蘭氏陰性桿菌嗜肺軍團菌（L.pneumophila）軍團菌病(已知的首次爆發(fā)),PartI：軍團菌及軍團菌病,軍團菌,革蘭陰性桿菌,淺紅色的短桿菌，直徑0.30.5m，長約1.25m或更長，菌體一端有鞭毛.在含L-半胱氨酸和焦磷酸鐵的BCYE瓊脂培養(yǎng)基上生長，通常需要在375%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)2-10天。生長形成的菌落一般呈白色，也可能會從紫色變?yōu)樗{色，或是灰綠色。,初步在BCYE瓊脂培養(yǎng)基上生長的菌落為刻花玻璃樣，具有多型性.,軍團菌科、屬、種、血清型,軍團菌科(Legionellaceae）Legionella/Fluoribacterbozemanii/Tatlockiamicdadei軍團菌屬：16srRNA分析表明，在蛋白細菌系亞群中，軍團菌科只有一個軍團菌亞群。與引起Q熱病的coxiellaburneti(貝氏克斯體）親緣關系最近，二者具有同樣的細胞內(nèi)生活方式，可以利用共同的基因感染宿主細胞。軍團菌種：現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)50個種（species），70多個血清型（serogroups)，至少有20個種可引起人感染。,軍團菌種,軍團菌病,PartII：樣本的采集與運輸,哪些環(huán)境中存在軍團菌？,標本的種類,環(huán)境水標本：空調(diào)冷卻塔水、冷凝水,溫泉水,淋浴水,加濕器水；病人組織標本:如痰,支氣管灌洗液,胸水,血液等標本。,環(huán)境標本采集原則,最初流出的水標本：打開水龍頭或裝置后立即采集水樣，該水樣即代表設備內(nèi)的水。過后流出的水標本：最初流出的水標本收集以后，讓設備內(nèi)的水流掉后再采集水樣。此水代表供給設備的水。,環(huán)境標本采集,有殺生物劑時的采樣：水樣中含有氯或其它氧化性殺生物劑時，向采樣瓶中添加適量硫代硫酸鉀使其滅活。對于其它的生物劑，加入普通的中性試劑是無效的。注意：樣本采集到濃縮，以及樣本采集到濃縮培養(yǎng)的間隔時間控制在14天以內(nèi)。樣本的來源，數(shù)量，有無殺蟲劑都要登記，并同標本一起送到實驗室。不知來源或不知道處理過程的水標本是不予進行試驗的。,常見幾種系統(tǒng)采集部位,冷水系統(tǒng)的采集：進水系統(tǒng)蓄水池與每個蓄水池相連的下水道的排出口蓄水池最遠的下水道的排出口對每一個裝置來說，收集500ML最初流出的水標本，讓水持續(xù)流，并在流水中放一只溫度計，待溫度穩(wěn)定后，收集500ML過后流出的水標本。,熱水系統(tǒng)加熱器的排出口：選用保護性的橡膠手套和其它的保護性裝備關掉離加熱器最近的冷水系統(tǒng)。避免冷熱水混合加熱器的排水口可用火焰或酒精棉球消毒干燥排水口連接一根干凈的硅膠管采樣方式：打開開關采集最初流出的水標本。讓水排掉至溫度穩(wěn)定為止。再采一份過后流出的標本，并關閉開關,淋浴器,收集最初流出的水標本如果淋浴器有一個大的蓮蓬頭式噴嘴，用一個干凈的未用過的塑料袋，該裝置包裹起來，切掉一個角，將該切口處置于接取標本容器的開口處,冷卻塔,警告：為安全起見，采樣前，負責供水系統(tǒng)的工作人員應關掉冷卻塔的鼓風機。戴一副齊肘的橡膠手套，從池內(nèi)舀水，由于機器繼續(xù)運行而不能關閉冷卻塔時，則需要采樣人員做出專門的安排，這種情況下，應佩戴安全護目鏡和呼吸道防護裝備。在塔的入口處采樣：將干凈的硅膠管插入瓶內(nèi)，通過虹吸作用吸取頂部蓄水池的水。先用水充滿管子并夾住其一端，以防止管子空了。管的一端放在蓄水池里，另一端放在采樣瓶里，使瓶內(nèi)管的一端低于蓄水池管的一端。松開夾子，水開始流出，取夠所需的量，停止虹吸，將管從蓄水池內(nèi)取出。,進水口遠處采集池塘內(nèi)的水：用勺子采取冷卻塔，池塘表淺部位的粘泥（深度20cm)，用虹吸管采取池子深處的粘泥。采集位于該系統(tǒng)內(nèi)濾器的水，沉淀物，碎礫等。注意：所需樣品的數(shù)量取決于該系統(tǒng)內(nèi)的大小和地理位置。如果蓄水池和水塔之間的管道短，那么只需采集一份標本。,標本的運輸和相關生物安全要求,在周圍環(huán)境溫度下運送水樣標本,不必冷凍,但要防止受熱和陽光,標本要盡可能快或最好在兩天內(nèi)送到實驗室,室溫下(21+3)貯藏在實驗室或其他地方。對于臨床標本，最好立即做預期實驗，如不能馬上進行，應放在-20凍存?zhèn)溆谩?軍團菌操作生物安全性,應用的試劑須符合有毒物質(zhì)操作要求和相關規(guī)定。生物安全級實驗室，最好在安全柜中操作。操作人員培訓。菌種保存。,可感染人類的高致病性病原微生物菌（毒）種或樣本運輸管理規(guī)定,PartIII：軍團菌的分離與檢測,水樣標本中軍團菌的分離方法,檢測依據(jù):公共場所集中空調(diào)通風系統(tǒng)衛(wèi)生規(guī)范中的集中空調(diào)通風系統(tǒng)冷卻水、冷凝水中嗜肺軍團菌的檢驗方法見附錄B。適用于各種環(huán)境標本軍團菌檢測，包括：飲用水、工業(yè)用水、天然水以及一些如沉積物、沉淀物、軟泥等物質(zhì)。,標本,肺組織、支氣管灌洗液、血液、痰、胸水、胸腔引流物,水樣,血清,水樣處理與制備,血清學檢測方法：*間接熒光抗體染色法*試管凝集試驗*ELISA法,接種軍團菌BCYE培養(yǎng)基,接種軍團菌選擇性GVPC培養(yǎng)基,37，5%CO2，培養(yǎng)3-14天,挑可疑菌落革蘭氏染色涂片鏡檢,37,5%CO2,培養(yǎng)3-14天,革蘭氏染色陰性桿菌,革蘭氏染色陽性桿菌,純培養(yǎng),棄去,確認試驗,血清玻片凝集試驗,PCR檢測,生化試驗,尿液,抗原檢測,軍團菌水質(zhì)檢測概括,采樣濃縮培養(yǎng)分離鑒定,實驗所需儀器設備,90mm平皿3537孵箱濾器（大的不銹鋼制成的濾器）正壓膜蠕動過濾泵：流速可調(diào)。3升/分鐘注意：樣本量少，也可用真空輔助的濾過系統(tǒng)代替膜濾器：0.22um或0.45um水浴鍋：離心機：渦旋振蕩器：顯微鏡：,軍團菌檢測所需準備基本試劑,培養(yǎng)基（GVPC，BCYE,BCYE-CYS)試劑(生化試劑、甲醛的鹽溶液）酸緩沖液（0.2mol/LKCL-HCL)，堿緩沖液（0.03mol/LKOH）血清學試劑,培養(yǎng)檢測所需準備材料,直徑大約為90mm或100mm的無菌培養(yǎng)皿培養(yǎng)箱，CO2能夠恒溫保持在（361）。水浴箱，能夠保持在（501）顯微鏡或熒光顯微鏡。,樣品采樣準備材料,玻璃、聚乙烯或類似的容器瓶：滅菌處理。水樣一般采集為250-500ml，收集在容器瓶中。如果所用的容器，如聚乙烯瓶，不能高壓，可用流動的熱水（不低于70）或蒸汽進行巴斯德氏消毒，時間不低于5分鐘。小的無菌容器瓶：可用來收集淤泥、沉淀物或沉積物。廣口的容器：用來收集淤泥等，要有螺絲蓋。滅菌棉拭子。一般建議用塑料包裝的容器,軍團菌培養(yǎng)基,Muller-Hinton瓊脂,第一次分離出嗜肺軍團菌使用的培養(yǎng)基,活性炭酵母抽提物瓊脂，活性炭替代培了淀粉以去除培養(yǎng)基的毒性，并且氨基酸也逐漸被酵母抽提物替代,CYE瓊脂,CYE瓊脂加入-酮戊二酸,BCYE瓊脂,BCYE瓊脂中含有選擇性抗生素,GVPC瓊脂,軍團菌培養(yǎng)基,軍團菌分離培養(yǎng)用BCYE培養(yǎng)基,酵母浸出物10.0g活性炭2.0g瓊脂17.0g酮戊二酸1.0g蒸餾水950mL半胱氨酸鹽酸鹽0.4g可溶的焦磷酸鐵0.25g,半胱氨酸和焦磷酸鐵分別溶于10mL蒸餾水，分別過濾（0.45m濾器）。將剩余培養(yǎng)基成分溶于950mL蒸餾水，高壓滅菌。水浴冷卻至50，加入上述過濾液。10NKOH調(diào)整pH至6.9。蒸餾水補充至1L。倒培養(yǎng)基前先搖動混勻以保持碳呈懸浮狀態(tài)。每平板20ml（15100mm），斜面10ml或4ml（20150mm或13100mm）。,ACES緩沖液(2乙酰基2氨基乙烷磺酸)10.0g,選擇性（GVPC）培養(yǎng)基的制備,添加四種抗生素：甘氨酸3g/L（穩(wěn)定劑，防腐劑，緩沖劑）多粘菌素B（硫酸鹽）79200iu/L（抑制大腸肺克，百日咳等）萬古霉素（鹽酸鹽）0.001g/L（金葡，化膿性鏈球菌，白喉，肺鏈，炭疽等）放線菌酮0.08g/L（殺真菌，致畸，）那他霉素也可代替之。,抗生素的配制,多粘菌素B：200mg加入100蒸餾水中，混勻后，.uM濾器過濾除菌，以5.5量分裝到無菌瓶內(nèi)，冷凍保存。用時在室溫下孵化。萬古霉素：20mg加入20蒸餾水中，混勻后.uM濾器過濾除菌，以ML量分裝到無菌瓶內(nèi)，冷凍保存。用時在室溫下孵化。放線菌酮：2g加入100蒸餾水中，混勻后，.uM濾器過濾除菌，以4ML量分裝到無菌瓶內(nèi)，冷凍保存。用時在室溫下孵化。注意：放線菌酮具有肝毒性，當處理這種粉末狀試劑時，應該帶手套和防塵口罩。,GVPC培養(yǎng)基的制備,按上述BCYE培養(yǎng)基的方法配制完成后，冷卻至50C時，分別添加已配制好的三種抗生素。每種取一份劑量，充分混勻后即為最終選擇性培養(yǎng)基。,BCYE-Cys培養(yǎng)基,為不含L-半胱氨酸的酵母浸出物、炭粉培養(yǎng)基。按照配制BCYE培養(yǎng)基的方法配制，不加L-半胱氨酸。,半成品培養(yǎng)基,培養(yǎng)基的質(zhì)控,注意：消毒過程中，加熱時間過長或溫度過高，都能影響培養(yǎng)基的營養(yǎng)質(zhì)量。培養(yǎng)基成分每批間的差別（特別是酮戊二酸）也能影響其效能。所以，檢驗各批次新配制的培養(yǎng)基是十分必要的。孵育三天，觀察其支持軍團菌的能力來判斷。選擇新鮮培養(yǎng)的LP1型參考菌株和分離到的LP1菌株（勿超過10代）制成菌懸液，分別接種到新舊兩個批次的培養(yǎng)基上。孵育之后記錄和比較結(jié)果，確保其菌落形態(tài)和菌落數(shù)量是相同的。,水樣的正壓膜過濾法,安放濾膜；過濾；取膜；洗膜。,水樣濃縮物的貯存,最好對樣品立刻進行分析；標本于（62）儲藏最多不超過15天。對于軍團菌來說，如果儲藏于06，這種損失是最明顯的。而且，溫度在20或20以上時，異養(yǎng)生物的生長速度就會變快。,兩種處理方法,熱處理：將濃縮好的樣品混勻后分別取1ml于無菌管中，放到50度水浴內(nèi)保溫30分鐘；酸處理:取適量濃縮好的樣品混勻后離心，6000rpm10分鐘。滅菌管吸去上清，至原來一半的量。再次重懸混勻，加入酸緩沖液至原來的量，并輕輕混勻，室溫下靜置5分鐘，備用。,選擇培養(yǎng)基的接種,將100ul濃縮好的但未經(jīng)任何處理的標本接種到GVPC平板上，用無菌接種環(huán)將液體均勻涂布在整個培養(yǎng)基表面。用同樣的方法，從水浴中取出熱處理的標本，吸取100ul接種到GVPC平板上。同樣，經(jīng)酸處理的立即接種。,接種標本培養(yǎng),接種過的培養(yǎng)基靜置直至接種物被完全吸收，然后將平板倒置，在（361）培養(yǎng)7-10天。為了保證培養(yǎng)箱內(nèi)的空氣的濕度，可以在培養(yǎng)箱內(nèi)放置一個盛水的碟子。在每次觀察培養(yǎng)物時，向碟子內(nèi)注滿新鮮的水（根據(jù)需要）。在含2.5-5.0%CO2的環(huán)境下培養(yǎng)有利于軍團菌的生長。,平板的檢查,培養(yǎng)時間內(nèi)，48小時后，每天觀察菌落生長情況。軍團菌菌落通常呈灰白，灰綠，紫色和藍色。表面光滑，邊緣整齊。一種的菌落（博杰曼軍團菌，高曼，杜莫夫等）能自動發(fā)出白色耀眼的熒光。,孵育不同時間菌落生長情況,軍團菌菌落特點（1）,軍團軍菌落通常呈灰白色，但也能呈藍色、灰綠色、深褐色或深紅色。一般表面光滑濕潤，邊緣完整，并顯示典型的毛玻璃樣外觀。在紫外燈下，某些種的菌落（博杰曼軍團菌、高曼軍團菌、杜莫夫軍團菌、安綏軍團菌、奇銳軍團菌、斯泰戈瓦爾特軍團菌、格瑞梯納軍團菌、圖森軍團菌、巴黎軍團菌）能自動發(fā)出白色的耀眼熒光；某些種的軍團菌也能發(fā)出紅光。,軍團菌菌落特點（2）,嗜肺軍團菌的菌落呈暗淡的綠色，并常伴有淺黃色。為了避免軍團菌被殺死，平板暴露于紫外燈下不能超過規(guī)定時間。值得注意的是，新發(fā)現(xiàn)的某些種的軍團菌所具有的特征可能會和上述特征有所區(qū)別。,可疑軍團菌菌落的進一步鑒定,BCYE或其他培養(yǎng)基上傳代培養(yǎng)革蘭染色鏡檢生化鑒定PCR檢測軍團菌特異性基因片段免疫熒光的方法確定軍團菌的種類,BCYE或其他培養(yǎng)基上傳代培養(yǎng)（1）,至少從每塊GVPC平板上挑選出兩個典型的軍團菌菌落，在BCYE和BCYE-Cys培養(yǎng)基上傳代培養(yǎng)，傳代培養(yǎng)要在兩種培養(yǎng)基上同時進行。在（361）至少培養(yǎng)兩天。凡是在BCYE培養(yǎng)基上生長而在BCYE-Cys培養(yǎng)基上不生長的菌落即可初步認定為軍團菌。,BCYE或其他培養(yǎng)基上傳代培養(yǎng)（2）,營養(yǎng)瓊脂或血瓊脂培養(yǎng)基可以代替BCYE-Cys培養(yǎng)基。如果在這三種培養(yǎng)基上都不生長，原來選擇性培養(yǎng)基上的可疑軍團菌菌落應該繼續(xù)傳代培養(yǎng)。橡樹嶺軍團菌和幽靈湖軍團菌在初次分離培養(yǎng)時需要L-半胱氨酸和鐵離子，但隨后在L-半胱氨酸缺失時生長微弱。,BCYE培養(yǎng)基上傳代培養(yǎng),BCYE,血平板,BCYE不含半胱氨酸,革蘭染色鏡檢,軍團菌是革蘭染色陰性，淺紅色的短桿菌，直徑0.30.5m，長約1.25m或更長，菌體一端有鞭毛，長時間培養(yǎng)后鞭毛可能變成長絲狀。,短桿狀,長絲狀,軍團菌生化鑒定,確定軍團菌的種型,Oxoid的乳膠試劑盒可以鑒定出：嗜肺軍團菌血清1型;嗜肺軍團菌血清2-14混合型；L.longbeachae1和2型，L.bozemanii1和2型，L.dumoffii，L.gormanii，L.jordanis，L.micdadei，L.anisa混合型。,確定軍團菌的種型-1,在進行鑒定試驗前，要保證在BCYE培養(yǎng)基上生長的菌落是經(jīng)過形態(tài)學檢查的純菌。屬的鑒定，16sRNA。,嗜肺軍團菌的確定,應進行生化培養(yǎng)與血清學實驗確定嗜肺軍團菌。有條件的可做嗜肺軍團菌特異的PCR檢測。生化培養(yǎng)：氧化酶（/弱+），硝酸鹽還原，尿素酶，明膠液化，水解馬尿酸,淀粉酶水解弱+血清學實驗：用嗜肺軍團菌診斷血清進行分型。