第三章酶的發(fā)酵生產ppt課件

.,1,第三章酶的來源與發(fā)酵生產,.,2,1.酶的來源2.優(yōu)良產酶菌的篩選3.微生物酶的發(fā)酵生產基本要求：掌握微生物酶的發(fā)酵生產培養(yǎng)基及發(fā)酵方式的選擇和體系的控制，熟悉優(yōu)良產酶菌的篩選原則。,.,3,第一節(jié)酶的來源,.,4,.,5,一、酶的來源,1.主要來源于生物：所有細胞都有產酶的能力，但不是所有細胞都是酶的合適來源動物：胰臟胰蛋白酶，胃粘膜胃蛋白酶植物：菠蘿、木瓜蛋白酶微生物：利用微生物細胞的生命活動合成所需酶類的方法稱為發(fā)酵法,.,6,為什么要利用微生物？,抗生素、氨基酸、酶制劑等產品為什么能通過微生物發(fā)酵來生產？這與微生物的生長和代謝特點有什么關系？1、某些微生物因爭奪生存環(huán)境或營養(yǎng)物，會產生抗生素將其他種類的微生物殺死。2、微生物會產生蛋白酶、纖維素酶和淀粉酶，將營養(yǎng)物質水解成可吸收的小分子的多肽或氨基酸、葡萄糖。3、微生物細胞會通過合成或分解代謝生產它必需的一些物質，包括氨基酸、核苷酸等。,.,7,微生物作為酶來源的優(yōu)越性：,1）種類繁多（20萬種）2）易于人工控制，獲得高產酶的菌種3）微生物生長周期短，繁殖迅速，培養(yǎng)方便，成本低4）提高微生物產酶的途徑多5）培養(yǎng)條件簡單，易于自動化，生產易管理6）微生物本身也容易改造,.,8,2.人工合成酶制劑：,蛋白質的人工合成：人工合成胰島素等人工合成酶制劑受客觀條件的限制，如試劑、設備等，另外，體外合成，形成單體的難度大，且只能合成那些已經完全搞清楚其化學結構的酶類。,鈕經義（1920-1995),.,9,目前，應用于工業(yè)的酶類，主要來自于微生物發(fā)酵。,.,10,什么是發(fā)酵？,利用微生物，在適宜的條件下，將原料經過特定的代謝途徑轉化為人類所需要的產物的過程。,.,11,發(fā)酵工業(yè)經歷了哪幾個階段？,原始發(fā)展階段（發(fā)酵技術原始，頂多是家庭小制作，技術進步緩慢，完全是經驗式的，并不知道其中的原理。）傳統(tǒng)發(fā)酵工業(yè)階段（人們才開始了解發(fā)酵現(xiàn)象的本質，采用開放式的發(fā)酵方式，生產過程較為簡單，對生產設備要求不高，規(guī)模一般不大。）現(xiàn)代發(fā)酵工業(yè)階段（生產技術要求高；生產規(guī)模大；技術發(fā)展速度快；菌種的生產能力大幅度提高，新產品、新技術、新設備的應用達到前所未有的程度。）生物技術產業(yè)階段（利用構建的基因工程菌生產）,.,12,發(fā)酵工程,.,13,二、酶的生物合成,Centraldogma,酶合成的基本過程,轉錄翻譯調控,.,15,基因表達的調控,染色質活化,轉錄起始、延長、終止轉錄后加工,基因表達在全過程的各水平上都可以受調控：,轉錄起始調節(jié)是基因表達調控的主要環(huán)節(jié),.,16,蛋白質因子,特異DNA序列,.,17,.,18,乳糖操縱子誘導型操縱子,乳糖操縱子的結構,.,19,沒有乳糖存在時,乳糖操縱子被阻遏蛋白封閉,.,20,有乳糖存在時,乳糖操縱子被誘導物開放,.,21,無葡萄糖，cAMP濃度高時,有葡萄糖，cAMP濃度低時,CAP,CAP結合位點,.,22,低半乳糖時,高半乳糖時,葡萄糖低cAMP濃度高,葡萄糖高cAMP濃度低,無轉錄,無轉錄,低水平轉錄,.,23,.,24,Trp高時,Trp低時,mRNA,O,P,trpR,調節(jié)區(qū),結構基因,RNA聚合酶,RNA聚合酶,色氨酸操縱子阻遏型操縱子,操縱子關閉,.,25,前導序列,第10、11密碼子為trp密碼子,14aa前導肽編碼區(qū):,包含序列1,形成發(fā)夾結構能力強弱：序列1/2序列2/3序列3/4,.,26,UUUU3,前導肽,前導mRNA,當色氨酸濃度高時,轉錄衰減機制,衰減子結構就是終止子可使轉錄,RNA聚合酶,終止,.,27,前導肽,RNA聚合酶,當色氨酸濃度低時,Trp合成酶系相關結構基因被轉錄,序列3、4不能形成衰減子結構,前導mRNA,.,28,細胞周期與酶的合成,可能的三種模式：合成伴著生長進行，進入靜止期，合成降低對數(shù)生長期合成降低，靜止期合成增加中間類型,.,29,三、酶發(fā)酵動力學,主要研究在發(fā)酵過程中細胞生長速率，產物形成速率以及環(huán)境因素對速率的影響.在酶的發(fā)酵生產中,研究酶發(fā)酵動力學對于了解酶生物合成模式；發(fā)酵條件的優(yōu)化控制,提高酶產量具有重要的理論指導意義。,.,30,影響酶生物合成模式的因素主要是:mRNA和培養(yǎng)基中存在的阻遏物：mRNA穩(wěn)定性高的，在細胞停止生長后繼續(xù)合成相應的酶；mRNA穩(wěn)定性差的，隨著細胞生長停止而終止酶的合成；不受阻遏物阻遏的,可隨著細胞生長而開始酶的合成；受阻遏物阻遏的,要在細胞生長一段時間或進入穩(wěn)定期后解除阻遏,才能開始酶的合成。,.,31,酶生物合成模式：根據(jù)酶的合成與細胞生長的關系，可以把酶生物合成模式分為4種類型：同步合成型延續(xù)合成型中期合成型滯后合成型。,.,32,同步合成型：,又稱生長偶聯(lián)型,是指酶合成與細胞生長同步進行，當細胞生長進入對數(shù)期時，酶也大量合成；當細胞進入穩(wěn)定期時,酶的合成也停止。,大部分大組成型酶及部分誘導酶.mRNA不穩(wěn)定,細胞進入生長平衡期后,新的mRNA不再合成.,.,33,.,34,延續(xù)合成型：,酶的合成伴隨著細胞生長而開始，但在細胞生長進入穩(wěn)定期后,酶的合成仍將延續(xù)較長一段時間。生物合成可受誘導物誘導,一般不受分解代謝物阻遏mRNA相當穩(wěn)定,.,35,.,36,中期合成型：,酶的合成在細胞生長一段時間后才開始，而在細胞生長進入穩(wěn)定期后,酶的合成也終止。酶的生物合成受到產物的反饋阻遏作用或分解代謝物阻遏,酶的mRNA穩(wěn)定性差.,.,37,.,38,滯后合成型：,只有當細胞生長進入穩(wěn)定期后才開始酶的合成并大量積累培養(yǎng)基中含阻遏物,mRNA穩(wěn)定性好,如果去除阻遏物,則為延續(xù)合成型.,.,39,濃度,時間(h),細胞濃度,酶濃度,細胞濃度,酶濃度,酶濃度,酶濃度,細胞濃度,細胞濃度,圖3-1酶生物合成模式A.同步合成型;B.延續(xù)合成型;C.中期合成型;D.滯后合成型,A,B,C,D,.,41,在酶的工業(yè)生產中，為了提高酶產率和縮短發(fā)酵周期,最理想的酶合成模式是延續(xù)合成型；對于其它類型的酶,要在菌種選育和工藝條件上加以調節(jié)；對于同步合成型，盡量提高mRNA的穩(wěn)定性，如降低發(fā)酵溫度;對于滯后合成型,盡量減少阻遏物；對于中期合成型，要從提高mRNA穩(wěn)定性和解除阻遏兩方面進行。,.,42,三、優(yōu)良產酶菌的篩選,（一）必備條件：1.安全可靠，無毒性，不是致病菌：微生物及其代謝產物安全無毒，對人體和環(huán)境都無不良影響，對酶的應用也無不良影響。2.酶的產量高：要有高產的特性，通常，生長周期短。高產細胞可通過多次反復篩選，誘變或采用基因克隆、細胞或者原生質體融合等技術獲得，在生產過程中，要注意，若其發(fā)生退化，要經復壯處理,.,43,3.容易培養(yǎng)和管理：優(yōu)良的產酶菌對培養(yǎng)基和工藝條件沒有特別苛刻的要求。4.產酶穩(wěn)定性好:優(yōu)良的產酶細胞在正常條件下，能夠穩(wěn)定生長和產酶，不易受噬菌體侵襲，不易變異退化，一旦發(fā)生退化，經復壯處理，可恢復其產酶特性。5.有利于酶的分離純化：以便獲得高純度的酶，滿足使用者的需求。,.,44,一般生產菌株可向菌種保藏機構或生產部門索取自然界分離：菌樣采集菌種分離粗篩純化復篩生產性能鑒定實驗室改良基因突變基因轉移基因克隆,四、產酶微生物的篩選,.,45,A、從微生物發(fā)生和存在的環(huán)境中采集土壤降解酶類易從其底物富集場所獲得（纖維素酶易從森林土壤和木材堆放處獲得）耐熱酶易從高溫處（如溫泉、火山口）獲得,1.菌樣采集,B、系統(tǒng)發(fā)生相近的物種，其產酶性質相似不同蛋白酶性質不同，但霉菌的蛋白酶性質相似，不同于細菌蛋白酶C、胞外酶活性顯現(xiàn)的最適條件和穩(wěn)定條件與產酶菌的生長條件相一致,.,46,2.菌種的分離純化：平板劃線法稀釋法等等,.,47,3.篩選,平板培養(yǎng)透明圈法：適合于水解酶類。將合適底物溶于固體培養(yǎng)基中，觀察透明圈的情況。改變培養(yǎng)基條件，看透明圈變化情況，即可調節(jié)最佳培養(yǎng)條件胞內酶：固體或液體培養(yǎng)，收集酶液，進行活性測定篩選時，還要注意菌種生長傳代情況及保存時間對酶活的影響情況,.,48,4.實驗室改良遺傳學在酶學的應用,基因突變：在物理、化學等因素作用下，DNA發(fā)生損傷或者畸變損傷的位點可在結構基因上，也可在順式作用元件上基因突變的方向不確定，需要大工作量的篩選過程基因轉移：轉化或者轉導基因擴增基因克隆：,.,49,四、常見的產酶微生物,大腸桿菌：枯草芽孢桿菌黑曲霉米曲霉青霉木霉,.,50,根霉毛霉紅曲霉鏈霉菌啤酒酵母假絲酵母,.,51,.,52,.,53,.,54,.,55,第二節(jié)發(fā)酵工藝條件及控制,酶的發(fā)酵生產：利用微生物的生命活動獲得所需的酶的技術過程。,.,56,一、酶的發(fā)酵生產類型:,根據(jù)微生物培養(yǎng)方式的不同可分為：固體發(fā)酵液體發(fā)酵載體發(fā)酵,.,57,（一）固體發(fā)酵(傳統(tǒng)）,其培養(yǎng)基以麩皮、米糠等為主要原料，加入其它必要的營養(yǎng)成分，制成固體或半固體麩曲，經過滅菌、冷卻后，接種產酶微生物應用：我國傳統(tǒng)的各種酒曲、醬油曲，所以又稱為曲法培養(yǎng)適合霉菌生產：菌絲體生長好，產酶量高,.,58,主要生產淀粉酶和蛋白酶優(yōu)點：設備簡單，操作方便，麩曲中酶濃度較高，特別適合于各種霉菌的培養(yǎng)和發(fā)酵產酶。缺點：勞動強度大，原料利用率低，生長周期長,.,59,（二）液體發(fā)酵法,采用液體培養(yǎng)基，置于生物反應器中，經滅菌、冷卻后接種產酶細胞，在一定條件下發(fā)酵。機械化程度較高，是目前酶發(fā)酵生產的主要方式。,.,60,優(yōu)點：適應性強，可用于各種細胞（動物、植物、微生物）的懸浮培養(yǎng)和發(fā)酵易于人為控制機械化程度高，酶產品質量好，酶產率及產品回收率較高適合大規(guī)模生產缺點：需要一定的設備和技術條件能耗大要防止雜菌污染,.,61,1.間歇發(fā)酵,適用于延續(xù)合成型又稱為二次發(fā)酵。生長的最適條件產酶的最適條件如：灰色鏈霉菌：加富培養(yǎng)基17hr收集菌體，并洗滌稀鹽溶液誘導物（酵母-聚甘露糖）18-24hr,生產方式:,.,62,2.連續(xù)發(fā)酵,適用于同步合成型先將菌體培養(yǎng)到對數(shù)生長期，然后一邊添加新鮮培養(yǎng)基，一邊收集培養(yǎng)物，使之平衡或：分批投料并加種子勞動效率提高抑制反饋阻遏,.,63,（三）載體發(fā)酵：,其特點是以天然的或者人工合成的多孔材料為載體，并以合成的液體培養(yǎng)基代替麩皮之類的固體而培養(yǎng)微生物，這種固定化技術，是在固定化酶的基礎上建立起來的固定化細胞發(fā)酵固定化原生質技術：,.,64,二、生產工藝,活化：使用以前，必須接種于新鮮的斜面培養(yǎng)基上，在一定條件下進行培養(yǎng)，以恢復細胞的生命活動能力。擴大培養(yǎng)：增加發(fā)酵時的數(shù)量，經過一級至數(shù)級擴大培養(yǎng)。培養(yǎng)基稱為種子培養(yǎng)基。,（一）細胞活化與擴大培養(yǎng),.,65,（二）培養(yǎng)基的配制,培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分（1）碳源（2）氮源（3）無機鹽（4）生長因子（5）水（6）酶的誘導劑和促進劑有時，細胞在生長、繁殖和發(fā)酵過程中需要采用不同的培養(yǎng)基,.,66,生長因子：某些微生物本身不能從普通的碳源、氮源合成，需要額外少量加入才能滿足需要的有機物質，包括氨基酸、維生素、嘌呤、嘧啶及其衍生物，有時也包括一些脂肪酸及其他膜成分,.,67,發(fā)酵培養(yǎng)基的配制原則,營養(yǎng)物質應滿足微生物的需要。不同營養(yǎng)類型的微生物對營養(yǎng)的需求差異很大，應根據(jù)菌種對各營養(yǎng)要素的不同要求進行配制。營養(yǎng)物的濃度及配比應恰當。營養(yǎng)物濃度太低，不能滿足微生物生長的需要；濃度太高，又會抑制微生物生長。物理、化學條件適宜。（pH、水活度、滲透壓）在設計培養(yǎng)基時，必須考慮是要培養(yǎng)菌體，還是要積累菌體代謝產物；是實驗室培養(yǎng)，還是大規(guī)模發(fā)酵等問題。,.,68,作用：建造微生物細胞的材料為生命活動提供能量構成酶的成分作為多種誘導酶的誘導物,1.碳源：為細胞提供碳架和能量來源,.,69,.,70,1）要滿足不同細胞的營養(yǎng)要求：多數(shù)利用淀粉及其水解產物糊精、麥芽糖、葡萄糖等如：黑曲霉(它有淀粉酶系)酵母利用蔗糖或葡萄糖等，不能利用淀粉。有些微生物利用脂肪、石油、乙醇等為碳源。,使用原則：,.,71,2）有的菌種利用特殊的碳源才產酶：黃青霉（葡萄糖氧化酶產生菌）：甜菜糖蜜生長旺盛，但是不產酶蔗糖產酶量高短乳桿菌：（葡萄糖異構酶產生菌）：葡萄糖生長旺盛木糖產酶,.,72,3）同種菌，在不同濃度的有效碳源作用下，產酶量不同：可能與碳氮比有關4）碳源類型不同，還會影響到胞內酶和胞外酶的產量黃灰鏈霉菌：黑麥硫酸水解液36hr：胞內酶生產高峰72hr：胞外酶才開始生產,.,73,5）某些碳源對酶的生物合成有代謝調節(jié)作用這主要包括酶生物合成的誘導作用分解代謝物阻遏作用：,.,74,誘導作用：有些酶，在培養(yǎng)基中不存在誘導物質時，酶的合成受到阻遏，而當有底物或者其類似物或產物存在時，會誘導相應酶類的合成如：白地霉的脂肪酶合成需要培養(yǎng)基中加入少量橄欖油作為誘導物,.,75,發(fā)生在生長于易利用的碳源（如葡萄糖、甘油等）中的大多數(shù)微生物。如：淀粉（誘導）-淀粉酶果糖（抑制）乳糖(誘導)-半乳糖苷酶葡萄糖(抑制)（分解代謝物阻遏作用）,分解代謝物阻遏：某些物質（主要指葡萄糖等容易被利用的碳源和氮源等）分解代謝的產物阻遏某些酶（主要是誘導酶）生物合成的現(xiàn)象。,.,76,2.氮源構成細胞或代謝產物中氮素的來源,分類：有機氮源：各種蛋白質及其水解產物，如酪蛋白、豆餅粉、蛋白胨、牛肉膏等無機氮源：各種含氮的化合物，如：氨水、硫酸銨、磷酸銨、硝酸鉀等銨鹽或硝酸鹽，兩種鹽的比例對細胞生長和新陳代謝有顯著影響,.,77,不同細胞對氮源有不同要求：動物細胞要求有機氮源植物細胞要求無機氮源微生物：要求不同，異養(yǎng)型細胞要求有機氮源，自養(yǎng)型細胞要求無機氮源；生長和產酶所需氮源會有不同。,.,78,碳氮比（C/N）：培養(yǎng)基中碳元素的總量與氮元素的總量之比，不同培養(yǎng)基該值不同，且相差很大，對酶產量有顯著影響.例如,較低的碳氮比（C/N）常有利于蛋白酶產量的提高,但是這種條件下,發(fā)酵后期培養(yǎng)基的pH值往往會向堿側偏移,反過來又會阻遏蛋白酶的積累.因此選擇并控制適宜的碳氮比也是提高酶產量的一個重要因素.,.,79,氮調節(jié)作用：由于氨基酸或氨的充分供應，而引起的與氮代謝有關、特別是與那些供應氨或谷氨酸有關的酶的阻遏，稱為氮的分解代謝物阻遏，又稱為氮調節(jié)作用,.,80,3.無機鹽類：,是提供細胞生命活動不可缺的無機元素，并對細胞內外的pH值、氧化還原電位和滲透壓起調節(jié)作用，有時可作為某些微生物生長的能源物質按需用量分類：大量元素：S、P、K、Na、Ca、Mg、Cl等微量元素：Cu、Mn、Zn、Co、Br、I等（必不可少，但過量對生命活動有不良影響,.,81,不同無機元素在生物活動中作用不同：組成細胞的主要元素：S、P等組成酶分子的主要元素：S、P、Zn、Ca等作為酶的激活劑：K、Mg、Zn、Cu、Fe、Br、I等調節(jié)pH、氧化還原電位、滲透壓等：K、Na、Ca、ClS和P的含量也會對微生物的酶合成有調節(jié)作用，主要調控方式也是阻遏調控。,.,82,4.生長因子（素）：,生長繁殖過程中必需的微量有機化合物，包括各種氨基酸（組成蛋白質）、嘌呤、嘧啶（組成核酸、輔基、輔酶）、維生素和生長激素（調節(jié)細胞生長分裂），這些對于營養(yǎng)缺陷型微生物更必需）通常在酶的發(fā)酵過程中，一般培養(yǎng)基中加入含各種生長激素的天然原料的水解物，如酵母膏、玉米漿和麥芽汁等,.,83,5.水水質的影響6.誘導物和促進物,.,84,.,85,.,86,（三）發(fā)酵條件的控制,1、溫度調節(jié)：2、pH值調節(jié)：3、溶解氧的調節(jié)控制：提高溶氧速率：通氣量、氧的分壓、氣液接觸時間和面積，培養(yǎng)液的性質。,.,87,1.溫度：生長繁殖、發(fā)酵產酶都需要一定的溫度條件,1）不同細胞有各自不同的最適生長溫度如：枯草桿菌：34-37黑曲霉：28-322）生長繁殖的最適溫度和發(fā)酵產酶的最適溫度不同通常情況：T（發(fā)酵產酶）T（生長繁殖）也有相同溫度，或者產酶溫度高的情況,.,88,相對較低溫度條件，可提高mRNA的穩(wěn)定性，延長酶合成的時間，從而合成酶量，醬油曲霉生產蛋白酶，28時的產量是40時的24倍。但是溫度如果過低，但是細胞生長速度減慢，代謝速度慢，從而使得產量反而下降。所以，需要確定最適溫度，對于有些情況，需要設定兩個最適（最適生長溫度，最適產酶溫度），同時，要考慮其他因素對溫度的影響，如培養(yǎng)基的散熱過程和代謝放能過程,.,89,2.pH值-緩沖劑或者酸、堿,1）不同細胞，其生長繁殖的最適pH不同：一般細菌和放線菌：中性或堿性（pH6.5-8.0）霉菌和酵母：偏酸性（pH4-6）,.,90,2）細胞發(fā)酵產酶的最適pH與生長的最適pH常不同：細胞產酶的最適pH通常接近于該酶催化反應的最適pH。堿性磷酸酶：pH8.5-9.0酸性蛋白酶：pH4-63）但是，由于有些pH條件不適合細胞生長，所以，產酶的最適pH與催化pH不同，枯草桿菌生產堿性磷酸酶，最適催化pH為9.5，而最適產酶pH為7.4,.,91,4）生產過程中應對pH進行調節(jié)：細胞生長繁殖和代謝物的堆積會改變培養(yǎng)基的pH，在生產各階段要合理調節(jié)：高糖培養(yǎng)基，由于糖代謝產生的有機酸，pH易降低含高蛋白的培養(yǎng)基，胺類的產生，使得pH升高,.,92,5）對于可產生多種酶產物的細胞，控制pH可控制酶的產量比例黑曲霉：培養(yǎng)基為中性產物以-淀粉酶為主酸性產物以糖化酶為主米曲霉：培養(yǎng)基為堿性產物主要為堿性蛋白酶中性產物主要為中性蛋白酶酸性產物主要為酸性蛋白酶,.,93,3.溶解氧（通氣與攪拌）,細胞生長繁殖和酶合成過程都需要大量的氧氣，在培養(yǎng)基中的細胞一般只能吸收和利用溶解氧，溶解氧指的是溶解在培養(yǎng)基中氧氣，在發(fā)酵過程中需要不斷的向培養(yǎng)基中供氧（無菌空氣）以保持氧分壓：由于氧是難溶于水的氣體，培養(yǎng)基中少量的溶解氧，且不斷被消耗細胞的產熱作用，導致氧溶解度更低,.,94,調節(jié)溶解氧的方法主要有：調節(jié)通氣量調節(jié)氧分壓調節(jié)氣液接觸時間調節(jié)氣液接觸面積改變培養(yǎng)液的性質,.,95,具體方法：通氣和攪拌,通氣：增加氧氣量攪拌：打碎氣泡增加表面積，加速氧向液相傳遞，并且加速液體流動，以延緩氣泡上升至液面逸出過程但是，避免劇烈攪拌，以防產生大量泡沫，阻礙CO2的排除，并防止發(fā)酵液溢出，以防污染,.,96,注意：溶氧速率不宜太高，要控制溶氧速率，是因為：1）過高的溶氧，造成浪費，2）高溶氧速率會抑制某些酶的生物合成，如青霉素酰化酶，3）為獲得高溶氧而采用的大量通氣或快速攪拌，會使得某些細胞（如霉菌、放線菌、固定化細胞等）受到損傷,.,97,四、提高酶產量的措施,酶合成的調節(jié)機制：在正常情況下，酶產量受酶合成調節(jié)機制的控制，要提高酶產量必須打破這種調節(jié)控制。酶合成主要取決于轉錄水平的調節(jié)，原核生物中普遍公認的調節(jié)機制是操縱子理論。,.,98,措施：,添加誘導物降低阻遏物濃度添加表面活性劑添加產酶促進劑,.,99,（一）添加誘導物,對于某些誘導酶的發(fā)酵生產，在合適的時候添加合適的誘導物，可以增加酶的產量一般來說，不同的酶有各自不同的誘導物，有時一種誘導