DNA的Feulgen染色法

.,DNA的Feulgen染色和細胞有絲分裂相的觀察,.,DNA是主要的遺傳物質(zhì)，主要分布在核的染色質(zhì)或有絲分裂過程中出現(xiàn)的染色體內(nèi)。自從1924年Feulgen等人建立了DNA-Feulgen染色方法以來,至今這種方法仍是DNA定量測定的主要染色方法之一。一、實驗?zāi)康?了解Feulgen反應(yīng)的基本原理。2熟悉傳統(tǒng)細胞化學(xué)實驗的基本實驗技能和操作方法。3掌握細胞分裂各期的主要特點。,.,二、實驗原理,DNA經(jīng)弱酸（1mol/LHCL）水解，其上的嘌呤堿和脫氧核糖之間的鍵打開，使脫氧核糖的一端形成游離的醛基，這些醛基在原位與Schiff試劑（無色品紅亞硫酸溶液）反應(yīng)，形成紫紅色的化合物，使細胞內(nèi)含有DNA的部位呈紫紅色陽性反應(yīng)。,紫紅色的產(chǎn)生，是由于反應(yīng)產(chǎn)物的分子內(nèi)含有醌基，醌基是一個發(fā)色團，所以具有顏色。對照組預(yù)先用熱三氯醋酸或DNA酶處理，抽提去細胞中的DNA而得到陰性反應(yīng)，從而證明了Feulgen反應(yīng)的專一性。,.,三、試劑1.Carnoy固定液：3份95%酒精加入1份冰醋酸。2.1mol/LHCL：準確量取86.2ml濃鹽酸（比重1.18）加入到93.8ml蒸餾水中。3.Schiff試劑：稱1g堿性品紅于200ml煮沸的重蒸餾水中，5分鐘后斷電使其冷卻至5550，過濾到一個棕色的試劑瓶中，加入1NHCl20ml，繼續(xù)冷卻至25，加入1g偏亞硫酸氫鈉，搖動瓶子使其溶解。密閉瓶口，置黑暗低溫處或冰箱內(nèi)（4左右），1824小時后檢查，試劑如透明無色或呈淺黃色時即可使用，這就是Schiff試劑溶液。如有不同程度的紅色未褪，可加入1g活性炭，強烈震蕩一分鐘，仍在低溫下靜置過夜，然后用濾紙過濾后使用。密封瓶口，包以黑紙，在5以下冰箱內(nèi)可以保存半年。,.,4.亞硫酸水溶液(漂白液)：在200ml蒸餾水中，加入10ml1NHCl和10ml10%偏亞硫酸氫鈉水溶液（或1.0g固體）。此液在臨用前配制。否則會因SO2的的逸出而失效。5.5%三氯乙酸6.0.5%固綠酒精溶液（95%的酒精溶解）,.,四、實驗材料及實驗器材1.材料Carnoy液固定的洋蔥根尖2.實驗器材顯微鏡、恒溫水浴鍋、鑷子、解剖針、剪刀、載玻片、蓋玻片、吸水紙、青霉素瓶、吸管、燒杯、量筒。,.,五、實驗方法和步驟（一）材料準備取洋蔥頭若干，剝皮后置于盛有水的培養(yǎng)皿內(nèi)使其長出新根。待根尖長1cm時，剪下根尖固定在Carnoy固定液內(nèi)、保存?zhèn)溆?。（二）水解實驗時，取出預(yù)先準備好的洋蔥根尖，用自來水漂洗后，置于3ml1mol/LHCl中，在600.5恒溫水浴鍋中水解8-15分鐘。然后吸去熱1mol/LHCl，再用自來水將根尖洗3次。水解是本實驗成敗的關(guān)鍵之一。重要的是溫度，應(yīng)保持在600.5之間。如果溫度過高或時間過長，造成水解過度，醣與醛基之間的鍵被破壞，醛基流失到水解液中；反之，不能出現(xiàn)潛在的醛基，都不能呈現(xiàn)顏色反應(yīng)。,.,預(yù)處理：切取長約5mm的植物根尖，加入Carnoy固定液固定2小時以上。樣品可以轉(zhuǎn)入70%酒精中長期保存。,.,將根尖放入1mol/L的鹽酸中，60水浴，恒溫條件下解離815min。,.,（三）染色吸凈水分，加入Schiff試劑避光染色40min60min，用亞硫酸水漂洗23次，每次5min，然后經(jīng)自來水流水沖洗干凈后準備壓片。（四）壓片法取一根尖置于載玻片上，用切下生長區(qū)部位（染成紫紅色），加蓋玻片，用拇指或鉛筆的橡皮頭輕壓使細胞分散均勻，鏡檢。（五）對照組預(yù)先用5%三氯醋酸（90）處理15min，然后再依次進行實驗步驟（二）（三）（四）。,.,染色后倒出Schiff試劑，亞硫酸水漂洗23次，每次35min，自來水漂洗干凈，蓋上蓋玻片。,.,用鑷子或鉛筆輕輕敲打，使根尖細胞分散開。,.,六、有絲分裂各期觀察洋蔥根尖壓片的觀察首先在低倍鏡下，區(qū)分根尖的分生組織區(qū)及延長組織區(qū)的細胞，然后，在高倍鏡下，觀察細胞核的形態(tài)，注意在你的片子上，是否有有絲分裂細胞，如有，你能找到細胞分裂期的幾個階段，其特征如何？（可參照附錄）,.,實驗結(jié)果,.,附錄：植物細胞分裂的幾個時期。細胞周期分為間期及分裂期，按照有無核膜，核仁、染色體，以及染色體形態(tài)與分布位置的變化，細胞有絲分裂又分為前期、中期、后期和末期四個階段?，F(xiàn)將各期特點簡述如下，（1）前期：此期的染色質(zhì)螺旋盤繞成一定數(shù)目的細而長的染色絲，此即染色體。染色體先是分散于核液中，以后，逐漸向核膜移動，在此時，核仁逐漸消失，核膜溶解。（2）中期：染色體進一步盤繞，變短變粗，在細胞的中央（即赤道板）規(guī)則地排列成行，仔細觀察，可看到染色體兩側(cè)的紡錘絲。,.,（3）后期：姊妹染色體分別向細胞兩極移動，染色體達到兩極時染色體緊縮成團，染色體的輪廓逐漸變得不清楚，細胞質(zhì)中間部位（細胞的赤道板）形成細胞板。（4）末期：盤繞變粗的染色體又伸展開，此時，核仁、核膜又重新出現(xiàn)。此外，間期細胞的細胞核有下述特點：核膜清楚，核內(nèi)結(jié)構(gòu)均勻，除異染色質(zhì)外，可見12個著色較深的核仁。而在進入細胞分裂期的細胞核，一般均大于間期細胞核。,.,植物細胞的細胞質(zhì)分裂,.,.,七、Feulgen方法應(yīng)注意的幾個問題：1.對照壓片的制做進行Feulgen反應(yīng)時,一般要做一對照壓片以便說明實驗結(jié)果的真實性。對照壓片的材料應(yīng)在酸解前預(yù)先用5%三氯醋酸（90）處理15min，然后再依次進行酸解、染色和壓片等。,.,2.固定劑的選擇以前很多人認為，選用的固定劑不應(yīng)含有醛基或含有氧化劑。后來發(fā)現(xiàn)含醛基或氧化劑的固定劑對反應(yīng)的專一性并沒有影響。實踐證明，一切好的組織學(xué)固定劑均適用于Feulgen反應(yīng)。如Bhampy固定劑、Helly固定劑、Flemming固定劑、OsO4固定劑、Carnoy固定劑、zenker固定劑和Bouin-Aller固定劑。但在上述固定劑中，以O(shè)sO4和Carnoy效果較好，OsO4(1%或0.5%)是Feulgen反應(yīng)的理想固定劑，只是因OsO4價錢較貴，故一般多采用Carnoy固定液。,.,3.水解時間Feulgen反應(yīng)通常用稀酸進行水解，但水解的時間一定要適當。如水解時間不夠,反應(yīng)就會變?nèi)?；如水解時間過長?；蛩獾剡^于劇烈，則脫氧核糖也易掉下來，反應(yīng)也會減弱。如用Carnoy固定液固定的材料，水解時間一般在815min之間。但是水解時間長短也要視標本的類型(如厚薄等)、固定劑的性質(zhì)以及酸的濃度而定。,.,4.Schiff試劑的作用Feulgen反應(yīng)成功與否的一個非常關(guān)鍵的因素，就是schiff試劑的質(zhì)量。有一大類試劑均稱為堿性品紅，它們實際上是由幾種產(chǎn)品分別組成的。因此只能選用注明“DNA染色反應(yīng)用”的堿性品紅才行。此外，Schiff試劑的配制方法也可影響DNA的染色反應(yīng)。配好的Schiff試劑須在5以下冰箱內(nèi)避光保存。,.,5.漂白液的重要性